Khảo sát chọn lọc và tối ưu qui trình thử nghiệm hoạt tính PDGF (Platelet-Derived growth factor) người tái tổ hợp in Vitro - Nguyễn Phạm Phương Thanh

TAP CHI SINH HOC 2015, 37(1se): 238-244 DOI: 10.15625/0866-7160/v37n1se. KHẢO SÁT CHỌN LỌC VÀ TỐI ƯU QUI TRÌNH THỬ NGHIỆM HOẠT TÍNH PDGF (PLATELET-DERIVED GROWTH FACTOR) NGƯỜI TÁI TỔ HỢP IN VITRO Nguyễn Phạm Phương Thanh, Nguyễn Trí Nhân, Đặng Thị Phương Thảo* Trường Đại học Khoa học tự nhiên, ĐHQG tp. Hồ Chí Minh, *dtpthao@hcmus.edu.vn TÓM TẮT: Nhân tố tăng trưởng có nguồn gốc từ tiểu cầu (PDGFs) là nhân tố phân bào chính cho nhiều loại tế bào có nguồn gốc từ trung mô. Với tiềm năng ứng dụng hứa hẹn, PDGF đã và đang là một trong những protein được quan tâm sản xuất với định hướng ứng dụng trong dược phẩm. Thử nghiệm hoạt tính PDGF là một bước không thể thiếu trong qui trình sản xuất protein này. Trong hai dạng thử nghiệm, in vitro-thông qua khả năng kích thích tăng sinh nguyên bào sợi- và in vivo-thông qua khả năng làm lành vết thương, phương thức thử nghiệm in vitro là phương thức thể hiện nhiều ưu điểm về chi phí, thời gian và qui mô thử nghiệm. Hiện nay, đã có nhiều qui trình thử hoạt tính PDGF in vitro được sử dụng trong các công bố khoa học. Tuy nhiên, các qui trình này khác nhau về nhiều thông số như phương thức đồng hoá tế bào, thời gian xử lý thuốc. Trong khi đó, qui trình thử nghiệm hoạt tính PDGF trong sản xuất đòi hỏi có tính ổn định và chính xác cao. Nhằm tạo cơ sở khoa học cho việc chọn và ứng dụng qui trình thử nghiệm hoạt tính PDGF trong dây chuyền sản xuất PDGF tái tổ hợp tại Việt Nam, trong bài báo này, chúng tôi trình bày các kết quả khảo sát chọn lọc và tối ưu qui trình thử hoạt tính PDGF in vitro. Kết quả khảo sát cho thấy, qui trình thử nghiệm không thông qua phương thức đồng hoá tế bào, môi trường thử nghiệm không chứa FBS, mật độ tế bào đầu vào là 5×103 tế bào/giếng và thời gian tiến hành thử nghiệm là 36h, có độ ổn định (%CV<15%), và cho hiệu quả đáp ứng tốt với PDGF. Từ khóa: NIH-3T3, nguyên bào sợi, PDGF, thử nghiệm hoạt tính in vitro, thử nghiệm hoạt tính protein tái tổ hợp. MỞ ĐẦU Nhân tố tăng trưởng có nguồn gốc từ tiểu cầu (PDGFs- platelet-derived growth factors) là nhân tố phân bào chủ yếu cho nhiều loại tế bào có nguồn gốc từ trung mô như nguyên bào sợi, tế bào cơ trơn thành mạch máu hay tế bào thần kinh đệm [4]. Trong tự nhiên, có bốn loại chuỗi polypeptide PDGF, liên kết với nhau tạo thành dạng dimer đồng phân: PDGF-AA, PDGF-BB, PDGF-AB, PDGF-CC và PDGF-DD. PDGF tham gia vào nhiều quá trình quan trọng của cơ thể như: lành hoá vết thương, phát triển phôi, hình thành mạch máu, duy trì áp suất thẩm thấu của mô [7]. Ứng dụng vai trò PDGF trong quá trình lành hoá vết thương, các nhà khoa học đã nghiên cứu và sử dụng PDGF để chữa trị lở loét cho người bị tiểu đường (Regranex® gel 0,01%). Gần đây, PDGF còn cho thấy tiềm năng trong điều trị bệnh rối loạn về xương [8]. Với tiềm năng ứng dụng đầy triển vọng, PDGF đã và đang được quan tâm sản xuất. Để đảm bảo chất lượng, hoạt tính của PDGF sau khi được sản xuất cần được đánh giá thông qua qui trình thử nghiệm hoạt tính ổn định với độ tin cậy cao. Trước đây, một số qui trình kiểm tra hoạt tính protein tái tổ hợp PDGF đã được công bố. Tuy nhiên, giữa các qui trình có rất nhiều điểm khác biệt về: dòng tế bào sử dụng trong thử nghiệm; phương pháp đồng hoá tế bào; nồng độ FBS hay FCS sử dụng và thời gian xử lý tế bào với PDGF. Nói về sự khác biệt của các qui trình đã công bố trong việc sử dụng dòng tế bào thử nghiệm, năm 1997, dòng tế bào NIH 3T3 được Yanqiu Chen vào cộng sự sử dụng trong qui trình thử nghiệm hoạt tính PGDF [5], sau đó năm 2013 dòng tế bào này được Hongbo Li sử dụng lại trong công trình nghiên cứu công bố tại tạp chí Protein expression and purification [9]. Tuy nhiên, một số tác giả khác lại sử dụng nguyên bào sợi người hay dòng Swiss 3T3 trong thừ nghiệm [2]. Bên cạnh khác biệt về dòng tế bào, một số nhà nghiên cứu sử dụng phương thức đồng hoá tế bào bằng biện pháp gây đói trong môi trường có nồng độ huyết thanh thấp kết hợp ức chế kìm hãm tế bào đầu vào của qui trình thử nghiệm [5, 6], một số nhà nghiên cứu khác chỉ sử dụng một trong hai phương thức đồng nhất tế bào (gây đói với môi trường chứa FBS thấp hoặc ức chế kìm hãm tế bào đầu vào) [2] hoặc bỏ qua phương thức đồng hoá tế bào trong qui trình thử nghiệm hoạt tính PDGF [9]. Bên cạnh đó, thời gian xử lý tế bào với PDGF và nồng độ FBS trong môi trường thử nghiệm cũng ít nhiều biến động khác nhau ở các công trình khoa học đã công bố [5, 6, 7]. Sự khác biệt trong các qui trình đã công bố dẫn đến nhiều câu hỏi về cơ sở khoa học của việc lựa chọn qui trình thử nghiệm hoạt tính PGDF trong sản xuất protein PDGF tái tổ hợp. Qui trình được lựa chọn đòi hỏi tính chuẩn xác, ổn định, mức độ lặp lại cũng như sự tối ưu hoá các thông số kỹ thuật. Nhằm đáp ứng nhu cầu thực tiễn nêu trên, trong công trình này, chúng tôi trình bày các kết quả thực nghiệm trong khảo sát chọn và tối ưu qui trình thử hoạt tính PDGF. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nuôi cấy tế bào: NIH-3T3 (American TypeCulture Collection) được nuôi cấy với mật độ đầu vào 6x103 tế bào/cm2. Sau khi đạt được mật độ mong muốn (khoảng 80% bề mặt đĩa hoặc đầy đĩa), tế bào được xử lý trypsin 0,25% (Sigma-Aldrich®) và được chuyển vào đĩa 96 giếng, sẵn sàng cho các qui trình thử hoạt tính. Thử nghiệm tăng sinh: Sau khi đạt được mật độ phù hợp, NIH-3T3 được chuyển vào đĩa 96 giếng, mỗi giếng chứa 100μl môi trường DMEM/F12 (Himedia) 10% FBS (Sigma-Aldrich®), 1X kháng sinh (Sigma-Aldrich®). Sau 24h, tế bào được bổ sung 40ng/ml PDGF (Platelet-derived growth factor) tái tổ hợp người thương mại được biểu hiện trên E. coli (BioLegend®) hoặc gây đói 24h trong 0,5% FBS, theo sau đó là bước bổ sung 40ng/ml PDGF. Sau thời gian ủ PDGF phù hợp, tế bào được tiến hành đo MTT (Sigma-Aldrich®). Số liệu được xử lý thống kê bằng phương pháp t-test và ANOVA. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Khảo sát thử nghiệm các phương thức đồng nhất tế bào trong qui trình thử hoạt tính PDGF Đồng nhất tế bào là phương thức đưa tế bào về cùng trạng thái khi bắt đầu thử nghiệm [1]. Đây là một trong các yếu tố được các nhà nghiên cứu quan tâm khi khảo sát khả năng kích thích tăng sinh tế bào. Hiện nay, có hai phương pháp chủ yếu được sử dụng trong đồng hoá nguyên bào sợi cho thử nghiệm hoạt tính PDGF in vitro. Phương pháp thứ nhất dựa vào hiện tượng ức chế kìm hãm. Phương pháp thứ hai đưa tế bào vào trạng thái tĩnh bằng cách gây đói trong môi trường chứa nồng độ huyết thanh thấp (0-2%). Mặc dù một số qui trình trước đây sử dụng phương thức đồng hoá tế bào đầu vào thông qua ức chế kìm hãm do tăng trưởng đến trạng thái bão hòa [2], các kết quả thực nghiệm của chúng tôi cho thấy, việc sử dụng tế bào ở trạng thái bão hoà (hình 1a,b) làm tế bào chết nhiều. Sau khi nuôi cấy bổ sung PDGF, tế bào bắt đầu tăng trưởng trở lại nhưng mật độ tế bào tăng không đáng kể so với lượng tế bào đầu vào: tăng 1.5 đến 1.8 lần ở qui trình 1.1 và biến động nhiều ở qui trình 2.1. Khác biệt giữa lô xử lý PDGF và lô không xử lý PDGF nằm trong khoảng 1,5 đến 1,8 lần (hình 2c,d) sau 48h giờ nuôi cấy, điều này cho thấy tế bào thử nghiệm đáp ứng không cao với PDGF. Hơn thế nữa, kết quả xử lý thống kê ANOVA cho thấy trong khi qui trình thử nghiệm sử dụng tế bào đầu vào ở trạng thái bão hoà kết hợp đưa tế bào vào trạng thái tĩnh (qui trình 1.1 hình 1a) có độ ổn định khá tốt thể hiện ở chỉ số %CV<10% thì qui trình thử nghiệm 2.1 với tế bào đầu vào ở trạng thái bão hoà, bỏ qua giai đoạn đưa tế bào vào trạng thái tĩnh (qui trình 2.1 hình 1b) cho thấy tính ổn định thấp %CV là 19%. Chúng tôi tiếp tục khảo sát hiệu quả qui trình thử hoạt tính PDGF với việc đồng nhất tế bào thông qua việc đưa tế bào vào trạng thái tĩnh bằng phương pháp gây đói tế bào trong môi trường có nồng độ huyết thanh thấp với tế bào đầu vào không ở trạng thái bão hoà (qui trình 1.2 hình 2a). Tương tự như các công bố trước, kết quả thực nghiệm của chúng tôi cũng cho thấy hiệu quả đáp ứng của tế bào với PDGF tăng, thể hiện ở số lần khác biệt so với đối chứng không xử lý PDGF từ 1.9 đến 2.6 lần (hình 2c). Thêm nữa, kết quả xử lý thống kê cũng cho thấy qui trình này thể hiện độ ổn định trong khoảng cho phép (%CV<15%). Bên cạnh đó, các kết quả thử nghiệm PDGF trên qui trình 2.2 (hình 2b) là qui trình không sử dụng phương pháp đồng nhất tế bào cũng cho kết quả rất khả quan khi tế bào đáp ứng tốt với PDGF, khác biệt từ 1.9 đến 2.0 lần so với đối chứng (hình 2d). Đặc biệt, qui trình này cho thấy tính độ ổn định cao (%CV = 3%). Các kết quả thực nghiệm này cho phép chúng tôi chọn phương thức thử nghiệm hoạt tính PDGF không đồng nhất tế bào. Hình 1. Khả năng đáp ứng của NIH-3T3 với PDGF khi đồng hóa tế bào dựa trên hiện tượng ức chế kìm hãm. (■: chứng âm, □ : PDGF). a. Qui trình 1.1; b. Qui trình 2.1; c. Đáp ứng của tế bào theo QT1.1; d. Đáp ứng của tế bào theo QT2.1 Hình 2. Khả năng đáp ứng của NIH-3T3 với PDGF khi đồng hoá tế bào bằng phương pháp gây đói trong nồng độ FBS thấp. (■: chứng âm, □: PDGF). a. Qui trình 1.2; b. Qui trình 2.2; c. Đáp ứng của tế bào theo QT 1.2; d. Đáp ứng của tế bào theo QT2.2. Khảo sát nồng độ FBS trong môi trường thử nghiệm Trong cơ thể, PDGF hoạt động phối hợp với các thành phần khác trong máu [5]. Nói cách khác, mức độ tác động của PDGF trên tế bào đích bị ảnh hưởng bởi sự tác động của các tác nhân khác trong máu. Trong điều kiện thử nghiệm trên mô hình tế bào động vật, các nhân tố tăng trưởng có trong FBS của môi trường nuôi cấy cũng ít nhiều ảnh hưởng đến đáp ứng của tế bào đối với PDGF. Do vậy, nồng độ FBS trong môi trường thử nghiệm là một yếu tố được nhiều nhà nghiên cứu thay đổi trong các qui trình thử nghiệm đã công bố [2, 5]. Nghiên cứu của Brooks & Riddle (1988) [2] cho thấy, khi sử dụng môi trường thử nghiệm chứa nồng độ FBS thích hợp có thể làm gia tăng số lượng tế bào đáp ứng với PDGF và làm giảm lượng tế bào không phân chia do không đáp ứng với PDGF nên hoạt tính của PDGF được thể hiện rõ ràng, độ nhạy của qui trình thử nghiệm tăng. Trong nghiên cứu này, nhằm ổn định và tăng độ nhạy của qui trình thử nghiệm hoạt tính PDGFtrong sản xuất, chúng tôi tiến hành bổ sung PDGF trong môi trường chứa nồng độ FBS khác nhau: 0%; 0,5%; 1% và 2% (hình 3a). Kết quả thực nghiệm cho thấy, khả năng kích thích phân bào của PDGF quan sát rõ ràng nhất ở 0%FBS và giảm dần ở các nồng độ FBS cao hơn (hình 3b, c). Vì thế, chúng tôi không bổ sung FBS vào môi trường nuôi cấy tế bào trong các thử nghiệm tiếp theo. Hình 3. Kết quả khảo sát nồng độ FBS trong môi trường thử nghiệm (:c: chứng âm, : PDGF). a. Qui trình tiến hành thử nghiệm; b, c. Đáp ứng của NIH-3T3 trong môi trường thử nghiệm chứa nồng độ FBS khác nhau. Hình 4. Kết quả khảo sát mật độ tế bào đầu vào tiến hành thử nghiệm.. (: chứng âm, : PDGF). a. Đường tương quan giữa số lượng tế bào và OD550; b. Kết quả khảo sát mật độ tế bào. Khảo sát mật độ tế bào đầu vào Mật độ tế bào là tác nhân ảnh hưởng mạnh mẽ đến sự tồn tại và tốc độ tăng trưởng của tế bào trong quần thể. Phần lớn tế bào phát triển tốt trong khoảng mật độ 104-106 tế bào/ml. Ở mật độ thấp, tế bào phát triển nhanh, sử dụng hiệu quả môi trường. Ở mật độ cao, mật độ tế bào đạt ngưỡng bão hòa trong thời gian ngắn và nhanh chóng đi vào apoptosis [10]. Vì vậy, trong các công bố trước đây, các tác giả đã sử dụng các mật độ tế bào đầu vào khác nhau dao động trong khoảng 103 đến 105 tế bào [2, 11,12]. Trong nghiên cứu này, để lựa chọn mật độ tế bào đầu vào thích hợp cho qui trình thử nghiệm, dựa trên khoảng tuyến tính của đường tương quan giữa số lượng tế bào và OD550 (hình 4a), chúng tôi đánh giá hiệu quả qui trình khi sử dụng mật độ tế bào ở 5x103 tế bào/giếng, 104 tế bào/giếng và 2x104 tế bào/giếng. Kết quả cho thấy rằng, ở mật độ tế bào đầu vào là 2x104 tế bào/giếng, sau 48 ủ PDGF, giá trị đo mật số tế bào trong phép thử MTT (OD550 >0,751) bắt đầu vượt ra khỏi khoảng tuyến tính của đường tương quan giữa số lượng tế bào và OD550 (0,07 <= OD550 <= 0,75 - hình 4a) nên sự khác biệt theo số lượng tế bào không còn tính đúng. Ở mật độ tế bào đầu vào là 5x103 tế bào/giếng sự khác biệt của lô xử lý với PDGF so với lô đối chứng là 1.8 lần và sự khác biệt này là 1.6 lần khi sử dụng mật độ tế bào đầu vào là 104 tế bào/giếng. Kết quả khảo sát này cho thấy qui trình thử nghiệm đạt hiệu quả cao khi sử dụng tế bào đầu vào là 5x103 tế bào/giếng. Qui trình đạt độ ổn định cho phép với %CV<15%. Khảo sát thời gian tiến hành thử nghiệm Thời gian ủ PDGF PDGF/control Hình 5. Kết quả khảo sát thời gian tiến hành thử nghiệm. PDGF được bổ sung vào môi trường không chứa FBS. Sau 24h, 36h, 48h, 60h ủ PDGF, tế bào được tiến hành phản ứng MTT. ( :chứng âm, :PDGF). Thời gian xử lý tế bào với các tác nhân kích thích tăng trưởng là một yếu tố nhạy cảm đối với thử nghiệm sinh học. Đối với thử nghiệm hoạt tính PDGF, trong các nghiên cứu trước, tế bào được cho đáp ứng với PDGF trong các khoảng thời gian khác nhau 24, 48 hay 72 giờ [2, 5]. Để khảo sát tối ưu thời gian xừ lý tế bào với PDGF, trong nghiên cứu này, chúng tôi khảo sát các khoảng thời gian xử lý PDGF: 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ, và 60 giờ. Đây là khoảng thời gian nuôi cấy được cho là phù hợp đối với sự tăng trưởng tối đa của dòng tế bào NIH-3T3 (theo ATCC). Kết quả thu được cho thấy rằng, đáp ứng của NIH-3T3 với PDGF bắt đầu quan sát thấy sau khi ủ PDGF 24giờ và tăng lên, đạt giá trị tối đa ở 36 giờ. Sau đó, đáp ứng của tế bào đạt trạng thái bão hoà ở 48 giờ và giảm xuống 60 giờ do tế bào bắt đầu đi vào apoptosis (hình 5). KẾT LUẬN PDGF là một protein có vai trò quan trọng trong nhiều quá trình sinh học của cơ thể như lành hoá vết thương, phát triển phôi, hình thành mạch máu, duy trì áp suất thẩm thấu của mô. Với tiềm năng ứng dụng trong dược phẩm, mỹ phẩm, PDGF đã và đang là một trong các ứng viên của công nghệ sản xuất protein tái tổ hợp. Đối với một qui trình sản xuất protein tái tổ hợp, phương pháp thử hoạt tính sinh học hiệu quả, chính xác là vô cùng cần thiết. Với những kết quả thực nghiệm thu nhận được, chúng tôi đã chọn lọc và tối ưu thành công qui trình thử hoạt tính PDGF in vitro trên dòng nguyên bào sợi chuột NIH-3T3. Qui trình này không sử dụng phương pháp đồng hoá tế bào với môi trường thử nghiệm không chứa FBS; mật độ tế bào đầu vào là 5x103 tế bào/giếng và thời gian tiến hành thử nghiệm là 36 giờ. Lời cảm ơn: Nghiên cứu này được thực hiện với sự tài trợ kinh phí từ Sở Khoa học Công nghệ Tp. Hồ Chí Minh. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Ashihara T., Baserga R., 1979. Cell synchronization, Methods in enzymology, 58: 248-262. 2. Brooks R., Riddle P., 1988. The 3T3 cell cycle at low proliferation rates, Journal of cell science, 90(4): 601-612. 3. Brooks R. F., Howard M., Leake D. S., Riddle P. N., 1990. Failure of platelet-derived growth factor plus insulin to stimulate sustained proliferation of Swiss 3T3 cells. Requirement for hydrocortisone, prostaglandin E1, lipoproteins, fibronectin and an unidentified component derived from serum, Journal of cell science, 97(1): 71-78. 4. Chen P.-H., Chen X., He X., 2013. Platelet-derived growth factors and their receptors: structural and functional perspectives, Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Proteins and Proteomics, 1834(10): 2176-2186. 5. Chen Y., Derguini F., Buck J., 1997. Vitamin A in serum is a survival factor for fibroblasts, Proceedings of the National Academy of Sciences, 94(19): 10205-10208. 6. He C., Hughes M. A., Cherry G. W., Arnold F., 1999. Effects of chronic wound fluid on the bioactivity of platelet-derived growth factor in serum-free medium and its direct effect on fibroblast growth, Wound Repair and Regeneration, 7(2): 97-105. 7. Heldin C.-H.,Westermark B., 1999. Mechanism of action and in vivo role of platelet-derived growth factor, Physiological reviews, 79(4): 1283-1316. 8. Hollinger J. O., Hart C. E., Hirsch S. N., Lynch S., Friedlaender G. E., 2008. Recombinant human platelet-derived growth factor: biology and clinical applications, The Journal of Bone & Joint Surgery, 90(Supplement_1): 48-54. 9. Li H., Hui X., Yang S., Hu X., Tang X., Li P., Li S., Yang L., Jin S., Wang Y., 2013. High level expression, efficient purification and bioactivity assay of recombinant human platelet-derived growth factor AA dimer (PDGF-AA) from methylotrophic yeast Pichia pastoris, Protein expression and purification, 91(2): 221-227. 10. Mire-Sluis A. R., Page L., Thorpe R., 1995. Quantitative cell line based bioassays for human cytokines, Journal of immunological methods, 187(2): 191-199. 11. Pledger W., Stiles C. D., Antoniades H., Scher C. D., 1977. Induction of DNA synthesis in BALB/c 3T3 cells by serum components: reevaluation of the commitment process, Proceedings of the National Academy of Sciences, 74(10): 4481-4485. 12. Zetterberg A., Engström W., Dafgård E., 1984. The relative effects of different types of growth factors on DNA replication, mitosis, and cellular enlargement, Cytometry, 5(4): 368-375. OPTIMIZATION OF AN IN VITRO BIOASSAY FOR HUMAN PDGF (PLATELET-DERIVED GROWTH FACTOR) Nguyen Pham Phuong Thanh, Nguyen Tri Nhan, Dang Thi Phuong Thao University of Science, Vietnam National University in Ho Chi Minh city SUMMARY Platelet-derived growth factor (PDGF) is a major mitogen of many messenchymal original cells. With promising potential, PDGF has been considered as an emerging recombinant product which is targeted to pharmaceutical applications. Testing biological activity is an essential step in PDGF manufacturing. There are in vitro assay which based on PDGF function of stimulating fibrolast cell proliferation and in vivo assay which shows PDGF capability in healing wound. The former assay serves many advantages such as saving time, expenditure, and scale of experiments. Several PDGF in vitro assays have been used in some scientific publications. While the PDGF manufacturing asks for a stable, specific and authentic bioassay, those published bioassays differ from each others in some parameters such as: synchronization methods, PDGF-treating time, etc. To provide scientific base for selecting and using an in vitro bioassay in PDGF manufacturing in Vietnam, we present here our results of evaluation and optimization of PDGF in vitro bioassay. The results demontrated a stable and sensitive PDGF bioassay (%CV<15%) in which 5x103 initial seeding cells per well was used without sychronization, following by 36 hours PDGF-treated in FBS-free medium. Keywords: Fibrolast cells, in vitro bioassay, NIH 3T3, PDGF, recombinant protein bioassay. Ngày nhận bài: 22-10-2014