Hoạt tính probiotic, đặc điểm phân loại và điều kiện nuôi thích hợp của chủng bacillus pumilus B3.10.2 phân lập từ tôm hùm bông - Trần Vũ Đình Nguyên

Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 1/2014 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 177 KEÁT QUAÛ NGHIEÂN CÖÙU ÑAØO TAÏO SAU ÑAÏI HOÏC HOẠ T TÍ NH PROBIOTIC, ĐẶC ĐIỂM PHÂN LOẠI VÀ ĐIỀ U KIỆ N NUÔI THÍ CH HỢ P CỦA CHỦ NG BACILLUS PUMILUS B3.10.2 PHÂN LẬP TỪ TÔM HÙ M BÔNG THE PROBIOTIC ACTIVITY, IDENTIFICATION AND APPROPRIATE CULTURE CONDITIONS OF BACILLUS PUMILUS B3.10.2 ISOLATED FROM THE ORNATE SPINY LOBSTER Trần Vũ Đình Nguyên1, Nguyễn Văn Duy2, Vũ Ngọc Bội3 Ngày nhận bài: 30/11/2012; Ngày phản biệ n thông qua: 15/7/2013; Ngày duyệt đăng: 10/3/2014 TÓM TẮT Vấ n đề dị ch bệ nh do vi sinh vậ t gây ra trong nhữ ng năm gầ n đây gây thiệt hại nặng nề đế n nghề nuôi trồng thủy sản. Việ c sử dụ ng cá c chế phẩ m probiotic để kiể m soá t tác nhân gây bệ nh đượ c xem là mộ t hướ ng thay thế cho điề u trị khá ng sinh truyền thống. Mụ c tiêu củ a nghiên cứ u này là xác định hoạ t tí nh probiotic, định danh và nghiên cứu điề u kiệ n nuôi cấ y thí ch hợ p của chủng probiotic tiềm năng trong số 4 chủng Bacillus (B3.7.1, B3.7.4, B3.10.1, B3.10.2) phân lập từ tôm hù m bông (Panulirus ornatus). Kế t quả cho thấ y cả 4 chủng đề u có hoạ t tí nh khá ng khuẩ n và 3 chủng trong đó (B3.7.4, B3.10.1, B3.10.2) có khả năng sinh protease ngoại bào. Chủng B3.10.2 đã được định danh là Bacillus pumilus có khả năng kháng khuẩn mạnh nhất với chủng Vibrio owensii DY05 mới được chứng minh gây bệnh nguy hiểm trên tôm hùm bông. Điều kiện nuôi cấy thích hợp cho sinh trưởng của chủng này là môi trườ ng TSB cải tiến chứ a rỉ đườ ng là nguồn cacbon, pepton là nguồn nitơ, nồ ng độ muố i 1-3%, pH 8, và ở nhiệ t độ 34-37oC. Kết quả này đóng góp cơ sở khoa học trong xây dựng quy trình sản xuất chế phẩm probiotic ở mức độ công nghiệp và mở ra tiềm năng ứng dụng của chủng này trong nuôi trồng hải sản nói chung và nuôi tôm hùm nói riêng. Từ khóa: Bacillus, Bacillus pumilus, Panulirus ornatus, Probiotic, Protease ABSTRACT The disease problems due to microbial infection in recent years caused a heavy loss in aquaculture. The use of probiotics to control pathogens is suggested to replace of traditional antibiotic treatment. The aim of the study is to assess the probiotic activity, identifi cation and the appropriate culture conditions of the potential probiotic strain out of four Bacillus isolates from the ornate spiny lobster (Panulirus ornatus). The results showed that all these four strains were found to have their antibacterial activity and three of them (B3.7.4, B3.10.1, B3.10.2) expressed extracellular protease activity. The strain B3.10.2 was identifi ed as Bacillus pumilus with the strongest inhibitory effect against Vibrio owensii DY05, a serious pathogen causing epizootics in the ornate spiny lobster. The appropriate culture conditions for the growth of this strain include the modifi ed TSB medium with molasses as a carbon source, peptone as a nitrogen source, salinity from 1 to 3%, pH at 8, and the temperature of 34-37oC. The research contributes into the development of the protocol for probiotic production in industry scale and opens the potential applications of this probiotic strain for marine aquaculture in general and lobster culture in particular. Keywords: Bacillus, Bacillus pumilus, Panulirus ornatus, Probiotics, Protease 1 Trần Vũ Đình Nguyên: Cao học Công nghệ Sau thu hoạch 2010 – Trường Đại học Nha Trang 2 TS. Nguyễn Văn Duy, 3 TS. Vũ Ngọc Bội: Viện Công nghệ sinh học và Môi trường – Trường Đại học Nha Trang I. ĐẶT VẤN ĐỀ Nghề nuôi tôm hùm lồng ở Việt Nam được bắt đầu từ năm 1992, và phát triển nhanh đến năm 2000 với đối tượng nuôi chính, quan trọng là tôm hùm bông (Panulirus ornatus). Tuy nhiên, nghề nuôi tôm hùm lồng đã chịu tổn thất kinh tế nặng nề khi dịch bệnh xuất hiện và có xu hướng giảm sút cả về năng suất và sản lượng trong những năm gần đây (Lại Văn Hùng, Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 1/2014 178 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG Lê Anh Tuấn, 2009). Các nghiên cứu về bệnh trên giáp xác nói chung và trên tôm hùm nói riêng, cho thấy một trong những tác nhân gây bệnh chính và nguy hiểm nhất là các vi khuẩn Vibrio bao gồm V. parahaemolyticus, V. harveyi, V. anguillarum, V. alginolyticus, (Webster et al., 2006; Raissy et al., 2011). Chúng thường là những tác nhân gây bệnh cơ hội, có thể gây chết từ rải rác đến hàng loạt (Shields, 2011). Chủng vi khuẩn Vibrio owensii DY05 mới đây đã được phân lập từ một số động vật giáp xác (Cano-Gómez et al., 2010) và được chứng minh là tác nhân gây bệnh nguy hiểm trên tôm hùm bông (Panulirus ornatus) giai đoạn ấu trùng nuôi tại Australia (Goulden et al., 2012) và giai đoạn con non ở Việt Nam (Nguyễn Thị Thanh Xuân và cs, 2013). Võ Văn Nha (2004) khi nghiên cứu một số bệnh thường gặp trên tôm hùm bông tại vùng biển Khánh Hòa và Phú Yên đã phát hiện trên tôm hùm bị bệnh đỏ thân có mặt của nhiều vi khuẩn thuộc chi Vibrio mà trong đó chủ yếu là V. parahaemolyticus. Trên tôm nước lợ, hội chứng hoại tử gan tụy cấp đã xuất hiện tại các vùng nuôi tôm ở đồng bằng sông Cửu Long từ năm 2010, sau đó lan ra miền Trung và một số tỉnh ven biển phía Bắc. Theo báo cáo của Vụ Nuôi trồng thủy sản (2012), sự hiện diện của vi khuẩn Vibrio và phage dẫn đến chết sớm và hội chứng hoại tử gan tụy ở tôm nuôi. Trong đó, 53,8% mẫu tôm giống thu ở các trại giống khu vực miền Trung nhiễm Vibrio, phổ biến là các loài V. parahaemolyticus, V. harveyi và V. vulnifi cus. Để phòng trừ dịch bệnh do vi khuẩn gây ra, sử dụng kháng sinh vẫn là biện pháp chính. Tuy nhiên, việc sử dụng kháng sinh quá liều đã làm giảm hiệu quả chữa bệnh trong nuôi trồng thủy sản, làm ô nhiễm môi trường nuôi và gây ảnh hưởng lớn đến chất lượng sản phẩm do việc tồn dư kháng sinh, hay tạo ra các chủng kháng kháng sinh (Zhou et al., 2009). Các plasmid mã hóa cho các gen kháng kháng sinh cũng có thể truyền từ vi sinh vật gây bệnh ở thủy sản sang các vi sinh vật gây bệnh cho động vật và người (Sahu et al., 2008). Chẳng hạn, vụ dịch tiêu chảy lớn do vi khuẩn Vibrio cholera gây ra ở Ecuador từ năm 1991-1994 đã bắt đầu từ các ngư dân nuôi tôm. Ban đầu các chủng vi khuẩn Vibrio gây bệnh cho tôm và không gây bệnh ở người nhưng sau đó do cơ chế chuyển gen ngang của các gen kháng kháng sinh trên plasmid mà các chủng này đã gây ra dịch bệnh lớn trên người (Weber et al., 1994). Do đó việc sử dụng các chế phẩm sinh học hoặc vi khuẩn có lợi nhằm kiểm soát mầm bệnh đang ngày càng được xem như là một giải pháp thay thế cho điều trị kháng sinh (Sahu et al., 2008). Chế phẩm probiotic là tập hợp một hoặc nhiều chủng vi khuẩn sống, được bổ sung vào thức ăn nhằm tác động tích cực đến sức khỏe vật nuôi, bao gồm khả năng ức chế các vi khuẩn gây hại, kích thích hệ tiêu hóa đường ruột thông qua hoạt động của các enzyme thủy phân (protease, amylase,), hoặc tăng cường đáp ứng miễn dịch (Zhou et al., 2009). Cá c chế phẩ m sinh họ c hiệ n nay thườ ng chứ a cá c chủ ng có lợ i như: Lactobacilus spp., Bacillus spp., nấm men, Trong đó sử dụ ng chủ ng Bacillus trong nuôi trồ ng thủ y sả n hiệ n là mộ t hướ ng rấ t đượ c quan tâm nghiên cứ u (Ravi el al., 2007). Tất cả các loài Bacillus đều có khả năng phân giải hợp chất hữu cơ chứa nitơ (như protein) khá mạnh nhờ sinh ra protease ngoại bào. Ngoài các enzym trên, các vi khuẩn còn có khả năng sinh ra các chất có hoạt tính kháng khuẩn như insulin và subtilin từ B. subtilis, bacteriocin từ B. licheniformis, (Hill et al., 2009). Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng 4 chủng vi khuẩn phân lập từ ruột tôm hùm bông (đã khảo sát sơ bộ hoạt tính kháng khuẩn) để xác định hoạt tính probiotic in vitro và điều kiện nuôi cấy thích hợp của chúng nhằm sản xuất chế phẩm vi sinh phục vụ nuôi tôm hùm và các đối tượng nuôi hải sản khác. II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Chủng vi sinh vật Các chủng vi khuẩn probiotic tiềm năng Bacillus spp. (B3.10.1, B3.10.2, B3.7.1, B3.7.4) phân lập từ ruột tôm hùm bông, chủng chuẩn sinh protease Bacillus sp. L5’, và các chủng vi sinh vật chỉ thị Vibrio spp. (V1.1 và V3.3) được lấy từ bộ sưu tập vi sinh vật của Viện Công nghệ sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nha Trang. Chủng Vibrio owensii DY05 là chủng vi khuẩn đã được chứng minh gây bệnh trên ấu trùng tôm hùm bông (Goulden et al., 2012a), được cung cấp từ Viện Hải dương học Australia (AIMS). Các chủng probiotic tiềm năng và chủng chỉ thị được nuôi cấy trên môi trường TSB (Tryptic Soy Borth) (HiMedia, Ấn Độ), có bổ sung 1,5% NaCl và bảo quản trong 20% glycerol ở -800C theo mô tả của Trần Linh Thước (2007). 2. Xác định hoạt tính sinh protease ngoại bào Hoạt tính sinh protease ngoại bào được xá c đị nh theo phương pháp đo đường kính phân giải casein. Vi khuẩn được nuôi cấy lắc 180 vòng/phút ở 300C trong môi trường dịch thể TSB, sau 24h tiến hành ly tâm dịch nuôi cấy với tốc độ 8000 vòng/phút trong 15 phút, thu dịch và nhỏ vào lỗ thạch đã khoan trên đĩa petri chứa môi trường cơ chất có casein; Để vào tủ ấm 300C trong 24 giờ; Đo đường kính vòng phân giải casein. Hoạt tính enzyme được xác định theo công thức: D-d, trong đó D là đường kính vòng phân giải + đường kính lỗ khoan, và d là đường kính lỗ khoan. Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 1/2014 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 179 3. Xác định hoạt tính kháng khuẩn Hoạt tính kháng khuẩn được xác định bằng phương pháp khuếch tán trên thạch đĩa. Các chủng vi khuẩn đã phân lập được nuôi cấy trong môi trường TSB, bổ sung 1,5% NaCl, trong 14-16 giờ. Sau đó dịch nuôi cấy ở mật độ tế bào khoảng 105 CFU/ml được ly tâm ở 6000 vòng/phút trong 30 phút ở 40C, thu dịch nổi. Lấy 80 μl dung dịch này nhỏ vào mỗi giếng của đĩa thạch đã trang đều vi khuẩn chỉ thị (Vibrio sp. V1.1 hoặc Vibrio sp. V3.3) sau khi nuôi trên môi trường TSB tới mật độ 104 CFU/ml. Sử dụng methylene blue 0,4% làm chất chỉ thị màu trước khi đổ đĩa để tăng độ tương phản của vòng kháng khuẩn. Sau đó, đĩa được ủ ở 370C trong 24-48 giờ và xác định đường kính vòng kháng khuẩn (Ravi et al., 2007). 4. Xác định điều kiện nuôi cấy thích hợp cho sinh trưởng Các chủng vi khuẩn nghiên cứu được nuôi trên môi trường TSB tại pH 7,3 ở nhiệt độ 37oC. Để xác định điều kiện nuôi cấy thích hợp, lần lượt các thông số: nguồn cacbon (glucose, rỉ đường, tinh bột bắp, tinh bột sắn), nguồn nitơ (bột mì, amoni sulfat, pepton), nồng độ muối (0%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%), pH môi trường (pH 5, 6, 7, 8, 9) và nhiệt độ (28, 31, 34, 37, 40 (oC)) được thay đổi trong khi các thông số còn lại được cố định và cải tiến dần. Sau 3 giờ nuôi, khả năng sinh trưởng của vi khuẩn được xác định bằng phép đo mật độ quang của dịch nuôi tại bước sóng 540 nm (OD540) trên máy đo quang phổ Cary 100 Bio (Varian, Mỹ). 5. Định danh vi khuẩn Bacillus Vi khuẩn Bacillus được định danh bằng cách kết hợp giải trình tự đoạn gen 16S rDNA và sử dụng bộ kít hóa sinh API 50CHB (BioMérieux, Pháp) dựa trên 49 phản ứng lên men đường và 12 thử nghiệm hoạt tính enzyme theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Kết quả thử nghiệm hóa sinh được phân tích bằng phần mềm ApiWeb (BioMérieux, Pháp). Nhằm tách chiết DNA, dịch nuôi cấy vi khuẩn được ly tâm ở 13.000 vòng/phút trong 2 phút ở 40C để thu tế bào (Luan et al., 2007). DNA tổng số được tách chiết bằng bộ kit Wizard® SV Genomic DNA System (Promega) theo hướng dẫn của nhà sản xuất và sau đó bảo quản ở -200C. Đoạn gen 16S rDNA của vi khuẩn được khuếch đại bằng kỹ thuật PCR sử dụng cặp mồi tương ứng được tổng hợp bởi IDT (Mỹ) có trình tự như sau: 16S-27F 5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG 3’ và 16S-1492R 5’ACG GCT ACC TTG TTA CGA CT-3’ (Luan et al., 2007). Phản ứng PCR được tiến hành trong tổng thể tích 50 µl với các thành phần ở nồng độ cuối cùng như sau: DNA (2-20 ng), mỗi mồi (0,1 µM), dNTP (0,1 mM mỗi loại), MgCl2 (2 mM), Taq polymerase (1,25 U) và đệm Tag (1X). Chu kì nhiệt của phản ứng bao gồm biến tính ban đầu ở 940C trong 3 phút; 35 chu kì của 940C trong 1 phút, 500C trong 1 phút và 720C trong 1 phút; và cuối cùng kết thúc ở 720C trong 7 phút. Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1-1,5% trong đệm TBE 0,5X, sau đó được nhuộm với ethidium bromide và đọc kết quả trên máy chụp ảnh gel (Biorad). Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng bộ kit PCR clean up system (Promega) theo hướng dẫn của nhà sản xuất và sử dụng làm khuôn trực tiếp cho phản ứng tiền giải trình tự theo nguyên tắc dye-labelled dideoxy terminator (Big Dye Terminator v.3.1, Applied Biosystems) với các cặp mồi 16S-27F/16S-1492R theo chương trình nhiệt như sau: 960C trong 20 giây, 500C trong 20 giây và 600C trong 4 phút. Sản phẩm phản ứng được phân tích trên máy phân tích trình tự tự động ABI Prism 3700 DNA Analyser (Applied Biosystems). Các trình tự được phân tích, chỉnh sửa bằng phần mềm BioEdit 7.1.3.0 và Genious Pro 5.5.7, và được so sánh với các trình tự tương đồng trên Genbank bằng chương trình BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/). 6. Xử lý thống kê Các thí nghiệm xác định điều kiện nuôi cấy thích hợp được lặp lại ít nhất 3 lần. Các số liệu được xử lý thống kê bằng phân tích ANOVA trên phần mềm Microsoft EXCEL 2007. III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 1. Xác định hoạt tính probiotic của các chủng nghiên cứu 1.1. Xác định hoạt tính sinh protease ngoại bào Kết quả từ bảng 1 và hình 1 cho thấy có 3/4 chủng probiotic nghiên cứu (B3.7.4, B3.10.1, B3.10.2) có khả năng sinh protease ngoại bào. Trong đó chủng B3.7.4 sinh protease mạnh nhất (đường kính vòng phân giải casein > 20 mm) và mạnh hơn so với chủng L5’ là chủng chuẩn có khả năng sinh protease mạ nh đã đượ c nghiên cứ u tạ i Việ n Công nghệ sinh họ c và Môi trường - Trườ ng Đạ i họ c Nha Trang. Kết quả nghiên cứu này tương tự với một nghiên cứu gần đây của Liu và cộng sự (2009) về chủng vi khuẩn Bacillus subtilis E20 có khả năng sinh protease mạnh. Chủng này đã được thử nghiệm bổ sung vào thức ăn của tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei). Kết quả cho thấy tôm có bổ sung probiotic tiết ra enzyme tiêu hóa nhiều hơn do được hỗ trợ bởi hoạt động sinh protease của chủng probiotic so với tôm không được bổ sung probiotic, do vậy tôm có bổ sung probiotic đã tăng trưởng nhanh hơn (Liu et al., 2009). Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 1/2014 180 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG Hì nh 1. Vòng phân giải casein từ dịch nuôi sau ly tâm củ a cá c chủ ng nghiên cứ u Bả ng 1. Hoạ t tí nh sinh protease ngoại bà o củ a cá c chủ ng nghiên cứ u STT Chủng probiotic Đường kính vòng phân giải casein (D-d, mm) 1 B3.10.1 16 2 B3.10.2 16 3 B3.7.1 - 4 B3.7.4 21 5 L5’ 18 1.2. Xác định hoạt tính kháng khuẩn Kết quả từ bảng 2 và hình 2 cho thấy các chủng probiotic nghiên cứu sau khi nuôi trên môi trường TSB đều có hoạt tính kháng khuẩn đối với chủng V1.1, V3.3 và DY05. Trong đó chủng probiotic B3.7.4 có hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhất với cả hai chủng V1.1 và V3.3 còn chủng B3.10.2 có hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhất với chủng DY05. Vibrio owensii là loài vi khuẩn mới được công bố gần đây (Cano-Gómez et al., 2010) và chủng V. owensii DY05 đã được chỉ ra là tác nhân gây bệnh nguy hiểm trên tôm hùm bông trong giai đoạn ấu trùng ở Australia (Goulden et al., 2012a) và con non ở Việt Nam (Nguyễn Thị Thanh Xuân và cs, 2013). Trong một nghiên cứu mới đây, Goulden và cs (2012b) đã tuyển chọn được các chủng probiotic (Vibrio sp. PP05 và Pseudoalteromonas sp. PP107) có hoạt tính kháng khuẩn mạnh với chủng DY05 và cho thấy chúng có khả năng bảo vệ ấu trùng tôm hùm bông sau khi lây nhiễm với DY05. Trong nghiên cứu này, các chủng probiotic, nhất là chủng B3.10.2, cũng có khả năng kháng mạnh với DY05 trong điều kiện in vitro. Do vậy, cần tiếp tục có những thử nghiệm in vivo để đánh giá hiệu quả của các chủng probiotic tiềm năng này trên tôm hùm bông. Hình 2. Vòng kháng khuẩn của các chủng probiotic nghiên cứu với chủng V3.3 Bảng 2. Hoạt tính kháng khuẩn của các chủng probiotic nghiên cứu STT Chủng probiotic Đường kính vòng kháng khuẩn (D-d, mm) Vibrio sp. V1.1 Vibrio sp. V3.3 Vibrio owensii DY05 1 B3.7.4 10 15 10 2 B3.7.1 10 7 15 3 B3.10.1 8 10 15 4 B3.10.2 9 13 29 2. Định danh chủng B3.10.2 Chủng B3.10.2 có khả năng kháng khuẩn mạnh nhất với chủng DY05, đồng thời có khả năng sinh protease ngoại bào tốt, nên đã được lựa chọn trước tiên để định danh nhằm kiểm tra tính an toàn của chủng. Việc định danh chủng B3.10.2 bằng cách sử dụng kết hợp cả hai phương pháp: dựa trên đặc điểm kiểu gen (trình tự đoạn gen 16S rDNA) và kiểu hình (khả năng lên men đường và hoạt tính sinh enzyme). Kết quả giải trình tự 2 chiều đoạn gen 16S rDNA của chủng B3.10.2 đã thu được đoạn trình tự dài 1066 bp. Trình tự này đã được gửi lưu trữ trên Ngân hàng gen thế giới (GenBank) với mã số gen là KC894663. Kết quả phân tích BLAST từ bảng 3 cho thấy, trình tự đoạn gen 16S rDNA của chủng B3.10.2 tương đồng 100% với một số chủng của loài Bacillus pumilus (các chủng T246, Nsic-2, V1, B12), B. altitudinis chủng T86, 100% với các chủng chuẩn (type strain) của các loài B. stratosphericus, B. aerophilus, B. altitudinis, và 99,6% với các chủng chuẩn của các loài B. pumilus và B. safensis. Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 1/2014 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 181 Bảng 3. So sánh trình tự đoạn gen 16S rDNA của chủng B3.10.2 với các trình tự tương đồng cao nhất trên GenBank bằng phương pháp BLAST Mã số gen Chủng vi khuẩn Tỉ lệ che phủ Mức ý nghĩa Độ tương đồng KC764989 Bacillus pumilus T246 100% 0,0 100% KC764971 Bacillus altitudinis T86 100% 0,0 100% KC568200 Bacillus pumilus Nsic-2 100% 0,0 100% KC492092 Bacillus pumilus V1 100% 0,0 100% KC596004 Bacillus pumilus B12 100% 0,0 100% NR042336 Bacillus stratosphericus 41KFT 100% 0,0 100% NR042339 Bacillus aerophilus 28KT 100% 0,0 100% NR042337 Bacillus altitudinis 41KF2bT 100% 0,0 100% NR041794 Bacillus safensis FO-036bT 100% 0,0 99,6% NR043242 Bacillus pumilus ATCC 7061T 100% 0,0 99,6% T: kí hiệu chủng chuẩn của loài (type strain) Kết quả phân tích kiểu hình dựa trên 49 phản ứng lên men đường và 12 thử nghiệm hoạt tính enzyme của chủng B3.10.2 đã xác nhận kết quả phân tích kiểu gen nói trên, trong đó những đặc điểm khác biệt về đặc điểm hóa sinh của chủng này so với 5 loài gần gũi về trình tự gen 16S rDNA đã được chỉ ra trong bảng 4. Phân tích trên phần mềm Apiweb (BioMérieux, Pháp) cho thấy chủng B3.10.2 được định danh là Bacillus pumilus với %ID = 99,9 và T = 0,49. Loài vi khuẩn này được coi là an toàn cho người và động vật. Chẳng hạn, chủng Bacillus pumilus GB34 đã được cấp phép sử dụng trong chế phẩm kháng nấm Rhizoctonia và Fusarium hại cây trồng, trong khi đó một chủng B. pumilus khác phân lập từ tôm sú (Penaeus monodon) đã cho thấy có tính chịu mặn tốt và khả năng ức chế mạnh sinh trưởng của một số vi khuẩn biển gây bệnh như Vibrio alginolyticus, V. mimicus và V. harveyi (Hill et al., 2009). Bảng 4. Đặc điểm hóa sinh khác biệt của chủng B3.10.2 so với các loài Bacillus gần gũi nhất TT Phản ứng Cơ chất Chủng B3.10.2 Bacillus pumilus B. safensis B. altitudinis B. aerophilus B. strato- sphericus Tài liệu Nghiên cứu này Dữ liệu API Satomi et al.,2006 Shivaji et al., 2006 Shivaji et al., 2006 Shivaji et al., 2006 A. Các phản ứng lên men đường GLY Glycerol w +/- + DARA D-arabinose - - + + + SBE L-sorbose - - + + + RHA L-rhamnose - - + + + DUL Dulcitol - - + - + INO Inositol - - + + - + SOR D-sorbitol - - + + - MDG Methyl-b-D-gluco- pyranoside - +/- + NAG N-acetyl glucos- amine w +/- - - - CEL D-cellobiose + + + - + MAL D-maltose - +/- + + + MEL D-melibiose - - + TRE D-trehalose + + + - INU Inulin - - + + + RAF D-raffi nose - - + - + + XLT Xylitol - - + - TUR D-turanose - +/- + B. Các hoạt tính enzyme ADH L-arginine - - + - CIT Trisodium citrate w +/- - + - URE Urea - - - + VP Sodium pyruvate - + - GEL Gelatin w + + + + Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 1/2014 182 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG 3.2. Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến sinh trưởng Chủng probiotic tiềm năng B3.10.2 còn được nuôi ở các nguồn nitơ khác nhau (bột đậu nành, amoni sulfat, pepton và sau 3 giờ được thu mẫu đo ở mật độ quang OD540 để xác định mật độ tế bào. Kết quả từ hình 3 cho thấy, từ các nguồn nitơ khác nhau sẽ ảnh hưởng khác nhau đến sự sinh trưởng của chủng probiotic nghiên cứu. Đồng thời, thí nghiệm này còn cho thấy trong số các nguồn nitơ thử nghiệm, pepton là nguồn nitơ thích hợp nhất cho sinh trưởng của chủng B3.10.2. 3.3. Ảnh hưởng của nồng độ muối đến sinh trưởng Kết quả xác định ảnh hưởng của nồng độ muối NaCl đến sinh trưởng của chủng nghiên cứu từ hình 3 cho thấy chủng B3.10.2 có khả năng sinh trưởng tốt ở các nồng độ muối từ 1 đến 3%. Tạ i nồng độ muối 1% thì chủng sinh trưởng mạnh nhất. Khi nồng độ muối tăng lên thì ức chế khả năng sinh trưởng của chủng nghiên cứu làm cho tốc độ sinh trưởng chậm lại. Kết quả này cũng cho thấy tiềm năng ứng dụng của chủng này trong nuôi nước lợ, mặn (tôm hùm, tôm sú, tôm hùm,) vì chúng có khả năng chịu được môi trường có nồng độ muối cao. Đồng thời, chủng B3.10.2 vẫn sống được ở nồng độ muối 0% (nước ngọt) cho thấy khả năng thích ứng rộng với nồng độ muối của chủng nghiên cứu. 3.4. Ảnh hưởng của pH môi trường đến sinh trưởng Kết quả từ hình 3 cho thấy pH môi trường có ảnh hưởng mạnh đến sinh trưởng của chủng B3.10.2. Sau 3 giờ nuôi cấ y, chủng nghiên cứu sinh trưởng mạnh nhất trên môi trường có pH 8. Tại những khoảng pH lân cận (pH 6-9), chủng nghiên cứu vẫn sinh trưởng khá tốt. Điều này cho thấy khả năng ứng dụng rộng rãi của chủng probiotic khi phát triển được ở điều kiện pH khác nhau. Tuy nhiên, chủng B3.10.2 bị ức chế mạnh khi nuôi trên môi trường có độ acid cao (pH 5). 3.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng Kết quả từ hình 3 chỉ ra rằng trong khoảng nhiệt độ nghiên cứu từ 280 đế n 400C, nhiệt độ không ảnh hưởng lớn đến sinh trưởng của chủng B3.10.2 (mật độ tế bào (OD540) chỉ dao động từ 1,9-2,2 sau 3 giờ nuôi). Chủ ng B3.10.2 sinh trưởng tố t nhấ t ở 340C. Điề u nà y rấ t thuậ n lợ i cho việ c nuôi cấy sản xuất chế phẩ m probiotic ở điề u kiệ n nhiệ t độ phò ng, giú p hạ giá thà nh, giả m chi phí sả n xuấ t ở mức độ công nghiệp. IV. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1. Kết luận Kết quả nghiên cứu hoạ t tí nh probiotic của 4 chủ ng Bacillus (B3.7.1, B3.7.4, B3.10.1, B3.10.2) phân lập từ tôm hù m bông chỉ ra rằng cả 4 chủng đề u có hoạ t tí nh khá ng khuẩ n đối với Vibrio spp. và 3 chủng trong đó (ngoại trừ B3.7.1) có khả năng sinh protease ngoại bào. Trong số 4 chủng nghiên cứu, chủng B3.10.2 cho thấy vừa có khả năng sinh 3. Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy thích hợp của chủng B3.10.2 3.1. Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến sinh trưởng Kết quả từ hình 3 cho thấy sau 3 giờ nuôi trên các nguồn cacbon khác nhau (glucose, rỉ đường, tinh bột bắp, tinh bột sắn) thì ảnh hưởng khác nhau đến sự sinh trưởng của chủng B3.10.2. Nguồn cacbon từ rỉ đường cho kết quả sinh trưởng cao nhất, cho nên có thể thay thế thành phần glucose để làm môi trường nuôi cấy của chủng probiotic này mà vẫn đảm bảo khả năng sinh trưởng của chúng. Khi sử dụng rỉ đường giúp hạ giá thành môi trường nuôi cấy chủng probiotic, từ đó hạ giá thành sản xuất. Sử dụng nguồn rỉ đường cũng giúp giải quyết khâu tiêu thụ phế phẩm từ ngành sản xuất đường. Hình 3. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến sinh trưởng của chủng B3.10.2 Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 1/2014 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 183 protease vừa có khả năng kháng khuẩn mạnh nhất với Vibrio owensii DY05 (tác nhân gây bệnh trên tôm hùm bông). Dựa trên các đặc điểm về kiểu gen và kiểu hình, chủng B3.10.2 đã được định danh là Bacillus pumilis. Điều kiện nuôi cấy thích hợp cho sinh trưởng của chủng B3.10.2 là trong môi trườ ng TSB cải tiến chứ a rỉ đườ ng là nguồn cacbon, pepton là nguồn nitơ, nồ ng độ muố i 1-3%, pH 8, và ở nhiệ t độ 34 - 37oC. 2. Kiến nghị Điều kiện sinh trưởng của chủng B3.10.2 phù hợp tốt trong sản xuất công nghiệp chế phẩm và ứng dụng chế phẩm ngoài biển, nên có thể đưa vào sản xuất thử nghiệm chế phẩm probiotic và thử nghiệm in vivo hiệu quả probiotic trên tôm hùm và các đối tượng thủy sản khác. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt 1. Võ Văn Nha, 2004. Kết quả bước đầu nghiên cứu một số bệnh thường gặp ở tôm hùm bông (Panulirus ornatus) nuôi lồng tại vùng biển Phú Yên, Khánh Hòa. Tuyển tập các công trình nghiên cứu khoa học công nghệ (1984 – 2004). NXB Nông nghiệp. Thành phố Hồ Chí Minh: 487-493. 2. Trần Linh Thước, 2007. Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mỹ phẩm. NXB Giáo dục. Hà Nội. 3. Nguyễn Thị Thanh Xuân, Phạm Thu Thủy, Lone Hoj, Nguyễn Văn Duy, 2013. Cảm nhiễm tôm hùm bông (Panulirus ornatus) giai đoạn con non với vi khuẩn Vibrio owensii DY05. Báo cáo Hội thảo khoa học trẻ ngành thủy sản lần thứ IV, 6-7/6/2013. Trường Đại học Nông Lâm. TP. Hồ Chí Minh. 4. Vụ Nuôi trồng thủy sản, 2012. Hội chứng hoại tử gan tụy cấp ở tôm nuôi nước lợ: nguyên nhân và giải pháp phòng ngừa. Website: stenet.gov.vn/thong-tin-huu-ich/thong-tin-thong-ke/thong-tin/hoi-chung-hoai-tu-gan-tuy-cap-o-tom- nuoi-nuoc-lo-nguyen-nhan-va-giai-phap-phong-ngua/. Tiếng Anh 5. Cano-Gómez A, Gou lden EF, Owens L, Høj L, 2010. Vibrio owensii sp. nov., isolated from cultured crustaceans in Australia. FEMS Microbiol Lett, 302 (2): 175-81. 6. Goulden EF, Hall MR, Bourne DG, Pereg LL, Hoj L, 2012a. Pathogenicity and infection cycle of Vibrio owensii in larviculture of the ornate spiny lobster (Panulirus ornatus). Appl Environ Microbiol, 78(8): 2841-9. 7. Goulden EF, Hall MR, Pereg LL, Hoj L, 2012b. Identifi cation of an antagonistic probiotic combination protecting ornate spiny lobster (Panulirus ornatus) larvae against Vibrio owensii infection. PLoS One, 7 (7): e39667. 8. Hill J E, Baiano JCF, Barnes AC, 2009. Isolation of a novel strain of Bacillus pumilus from penaeid shrimp that is inhibitory against marine pathogens. J Fish Dis, 32 (12): 1007–1016. 9. Liu CH, Chiu CS, Ho PL, Wang SW, 2009. Improvement in the growth performance of white shrimp, Litopenaeus vannamei, by a protease-producing probiotic, Bacillus subtilis E20, from natto. J Appl Microbiol, 107 (3): 1031-41. 10. Ravi AV, Musthafa KS, Jegathammbal G, Kathiresan K and Pandian SK, 2007. Screening and evaluation of probiotics as a biocontrol agent against pathogenic Vibrios in marine aquaculture. Lett Appl Microbiol, 45: 219-223. 11. Sahu M, Swarnakumar N, Sivakumar K, Thangaradjou T, Kannan L, 2008. Probiotics in aquaculture: importance and future perspectives. Ind J Microbiol, 48: 299–308. 12. Zhou Q, Li K, Jun X, Bo L, 2009. Role and functions of benefi cial microorganisms in sustainable aquaculture. Bioresource Technol, 100: 3780–3786. 13. Weber JT, Mintz ED, Canizares R, Semiglia A, Gomez I, Sempertegui R, Davila A, Greene KD, Puhr ND, Cameron DN, Tenover FC, Barrett TJ, Bean NH, Ivey C, Tauxe RV and Blake PA, 1994. Epidemia cholera in Ecuador: multidrug resistance and transmission by water and seafood. Epidemiol Infect, 112: 1-11. 14. Webster N S, Bourne D G and Hall M, 2006. Vibrionaceae infection in phyllosomas of the tropical rock lobster Panulirus ornatus as detected by fl uorescence in situ hybridization. Aquaculture, 255: 173-178. 15. Shields J D, 2011. Diseases of spiny lobsters: a review. J Invertebr Pathol, 106 (1): 79-91. 16. Raissy M, Momtaz H, Moumeni M, Ansari M and Rahimi E, 2011. Molecular detection of Vibrio spp. in lobster hemolymph. Afr J Microbiol Res, 5 (13): 1697 - 1700. 17. Lai Van Hung and Le Anh Tuan, 2009. Lobster seacage culture in Vietnam. In: Williams K.C. (ed.), Spiny lobster aquaculture in the Asia–Pacifi c region. Proceedings of an international symposium held at Nha Trang, Vietnam, 9–10 December 2008. ACIAR Proceedings No. 132. Australian Centre for International Agricultural Research: Canberra. 162 pp. 18. Luan XY, Chen JX, Zhang XH, Jia JT, Sun FR, Li Y, 2007. Comparison of different primers for rapid detection of Vibrio parahaemolyticus using the polymerase chain reaction. Lett Appl Microbiol, 44 (3): 242-7. 19. Satomi M, La Duc MT, Venkateswaran K, 2006. Bacillus safensis sp. nov., isolated from spacecraft and assembly-facility surfaces. Int J Syst Evol Microbiol, 56 (Pt 8):1735-40. 20. Shivaji S, Chaturvedi P, Suresh K, Reddy GS, Dutt CB, Wainwright M, Narlikar JV, Bhargava PM, 2006. Bacillus aerius sp. nov., Bacillus aerophilus sp. nov., Bacillus stratosphericus sp. nov. and Bacillus altitudinis sp. nov., isolated from cryogenic tubes used for collecting air samples from high altitudes. Int J Syst Evol Microbiol, 56 (Pt 7): 1465-73.