Hoạt tính kháng sinh của xạ khuẩn trong đất tại các khu vực có hoạt động khai thác khoáng sản

Đỗ Thị Tuyến và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 86(10): 153 - 158 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 153 HOẠT TÍNH KHÁNG SINH CỦA XẠ KHUẨN TRONG ĐẤT TẠI CÁC KHU VỰC CÓ HOẠT ĐỘNG KHAI THÁC KHOÁNG SẢN Đỗ Thị Tuyến, Lương Thị Hương Giang, Đào Thị Hằng Nguyễn Thị Hương Liên, Vi Thị Đoan Chính* Trường Đại học Khoa học – ĐH Thái Nguyên TÓM TẮT Từ 40 mẫu đất thu ở các địa điểm khác nhau tại các khu vực đang chịu ảnh hƣởng của hoạt động khai thác khoáng sản của tỉnh Thái Nguyên, đã phân lập đƣợc 162 chủng xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces. Qua kiểm tra hoạt tính kháng sinh (HTKS) của các chủng xạ khuẩn phân lập đƣợc, có 82 chủng (chiếm 50,62%) có hoạt tính kháng các vi sinh vật (VSV) kiểm định. Trong số đó, số chủng có hoạt tính kháng vi khuẩn Gram (+) là cao nhất – có 61 chủng (chiếm 74,39%), có 58 chủng (chiếm 70,73%) có hoạt tính kháng nấm và thấp nhất là số chủng có hoạt tính kháng vi khuẩn Gram (-) chỉ có 37 chủng (chiếm 45,12%). Đặc biệt, có 31 chủng (chiếm 37,8%) có hoạt tính với cả 2 nhóm vi khuẩn Gram (+) và Gram (-), có 20 chủng (chiếm 24,39%) có hoạt tính với cả 3 nhóm vi khuẩn Gram (+), vi khuẩn Gram (-) và nấm mốc. Với mục đích tuyển chọn đƣợc các chủng có hoạt tính kháng nấm, chúng tôi đã lựa chọn ra 5 chủng có hoạt tính mạnh nhất để tiếp tục nghiên cứu là TC13.1, TC13.2, TC12.1, HT17.8 và HT17.9. Từ khóa: chất kháng sinh, chủng, khuẩn ty, hoạt tính kháng sinh, xạ khuẩn.  ĐẶT VẤN ĐỀ Chất kháng sinh (CKS) ngày nay đã và đang đƣợc sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau. Ngoài mục đích y học, CKS còn đƣợc sử dụng trong chăn nuôi, thú y và đặc biệt là trong công tác bảo vệ thực vật để giảm dần việc sử dụng các loại thuốc hóa học. Song, việc sử dụng CKS càng rộng rãi bao nhiêu thì nguy cơ làm xuất hiện của các vi sinh vật kháng thuốc lại càng tăng lên bấy nhiêu. Điều này khiến cho các CKS thƣờng dùng không còn tác dụng nữa. Chính vì vậy, những nghiên cứu để tìm kiếm phát hiện ra các CKS mới từ tự nhiên luôn là một yêu cầu cấp thiết và có ý nghĩa thiết thực. Trong số các đối tƣợng để tìm kiếm CKS thì xạ khuẩn là đối tƣợng luôn đƣợc chú ý nhiều nhất vì có tới 70% số chủng xạ khuẩn có khả năng sinh CKS. Thái Nguyên là một tỉnh rất giàu tiềm năng về nông, lâm nghiệp nên có hệ VSV khá phong  Tel: 0987 123606, Email: vichinh57@gmail.com phú. Đồng thời, Thái Nguyên cũng nằm trong vùng sinh khoáng, có nhiều loại hình khoáng sản phân bố tập trung. Các hoạt động khai thác khoáng sản đã có những tác động đáng kể đến môi trƣờng đất, nƣớc và qua đó, rất có thể sẽ ảnh hƣởng đến hệ VSV đất ở những khu vực này mà hiện vẫn chƣa đƣợc nghiên cứu. Trong bài báo này, chúng tôi thông báo một số kết quả bƣớc đầu khảo sát và đánh giá hoạt tính sinh học của nhóm xạ khuẩn ở trong đất tại các khu vực đang chịu ảnh hƣởng của hoạt động khai thác khoáng sản trên địa bàn tỉnh Thái Nguyên. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên liệu - 40 mẫu đất lấy từ các địa điểm khác nhau ở 2 khu vực núi Pháo, Hà Thƣợng, Đại Từ và Mỏ sắt Trại Cau, Đồng Hỷ thuộc tỉnh Thái Nguyên. Đây là những khu vực đã và đang có các hoạt động khai thác khoáng sản nhiều năm. Đỗ Thị Tuyến và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 86(10): 153 - 158 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 154 - 7 chủng VSV kiểm định: Escherichia coli VTCC-B-883, Pseudomonas aeruginosa VTCC-B-481, Bacillus subtilis VTCC-B-888, Fusarium oxysporum VTCCF-1301, Aspergillus niger VTCCF-001, Fusarium solani VTCCF-1302 do Viện Bảo tàng giống chuẩn vi sinh vật cung cấp; Staphylococcus aureus ATCC 25923 do Viện Kiểm Nghiệm – Bộ Y tế cung cấp. - Các môi trƣờng: Gause I để phân lập và nuôi cấy xạ khuẩn; môi trƣờng MPA và PDA để nuôi các chủng VSV kiểm định. Phương pháp nghiên cứu - Thu mẫu đất, xác định pH của đất và phân lập xạ khuẩn [2]. - Xác định màu sắc của hệ khuẩn ty [5]. - Xác định hoạt tính kháng sinh (HTKS) theo phƣơng pháp thỏi thạch để sơ tuyển xạ khuẩn và phƣơng pháp đục lỗ để sàng lọc xạ khuẩn. - Xạ khuẩn được lên men trên máy lắc tròn 220 vòng/ phút, thời gian lên men 120 giờ ở 28oC. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Hoạt tính kháng sinh của xạ khuẩn Từ 40 mẫu đất lấy từ các địa điểm khác nhau tại các khu vực đang chịu ảnh hƣởng của hoạt động khai khoáng ở tỉnh Thái Nguyên, chúng tôi đã phân lập và thuần khiết đƣợc 162 chủng xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces. Số lƣợng và sự phân bố của xạ khuẩn đƣợc trình bày trên bảng 1. Kết quả bảng 1 cho thấy số lƣợng xạ khuẩn trong các mẫu đất là khá phong phú và phụ thuộc nhiều vào đặc điểm, tính chất của từng loại đất. Số lƣợng xạ khuẩn gặp nhiều nhất ở các loại đất trồng màu (12,07 x 106 CFU/g) và đất vƣờn (10 x 106 CFU/g). Kết quả này hoàn toàn phù hợp với đặc điểm sinh học của xạ khuẩn và đặc điểm canh tác đất tại những khu vực lấy mẫu. Xạ khuẩn thƣờng phân bố nhiều ở các loại đất tơi xốp, thoáng khí, giàu chất hữu cơ, có pH trung tính và độ ẩm thích hợp. Bảng 1. Số lƣợng và sự phân bố xạ khuẩn trong đất Loại đất lấy mẫu Số lượng mẫu pH của đất Số lượng XK/g (CFU/g) Số chủng XK phân lập Đất trồng chè 7 4,12 1.7 x 106 11 Đất trồng keo 9 5,53 5,3 x 106 26 Đất trồng màu 7 7,22 12,07 x 106 44 Đất trồng lúa 5 6,70 4,2 x 106 11 Đất vƣờn 5 7,30 10 x 106 55 Đất đồi trọc 7 4,15 3,6 x 106 15 Tổng cộng 40 162 Bảng 2. Số lƣợng và tỷ lệ các chủng xạ khuẩn có HTKS phân theo nhóm màu TT XK phân theo nhóm màu XK phân lập được XK có HTKS Tỷ lệ XK có HTKS so với tổng số chủng phân lập được (%) Số lượng Tỷ lệ (%) Số lượng Tỷ lệ (%) 1 Xám 83 51,23 38 46,34 23,46 2 Trắng 39 24,07 22 26,83 13,58 3 Xanh 13 8,02 4 4,88 2,47 4 Nâu 12 7,41 6 7,32 3,70 5 Hồng 9 5,56 7 8,54 4,32 Đỗ Thị Tuyến và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 86(10): 153 - 158 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 155 6 Tím 4 2,47 3 3,66 1,85 7 Vàng 2 1,23 2 2,44 1,23 Tổng 162 100 82 100 50,62 Đất trồng màu và đất vƣờn thƣờng xuyên đƣợc cuốc xới, bổ sung nguồn phân bón hữu cơ và vô cơ, có pH trung tính, đó là các điều kiện rất thuận lợi cho sự phát triển của xạ khuẩn. Ngƣợc lại, những loại đất nghèo dinh dƣỡng và đặc biệt là có pH quá cao hay quá thấp, xạ khuẩn phân bố rất ít. Theo kết quả nghiên cứu, đất chịu ảnh hƣởng của các hoạt động khai thác thiếc ở khu vực núi Pháo hay khai thác quặng sắt ở Trại Cau đều thuộc loại đất chua [3], vì vậy không thích hợp cho xạ khuẩn phát triển. Tuy nhiên, những nơi có hoạt động sản xuất của con ngƣời, pH có thể đƣợc cải thiện. Màu sắc của hệ khuẩn ty xạ khuẩn cũng rất đa dạng. Chúng tôi nhận đƣợc 7 nhóm màu. Số lƣợng và tỷ lệ các nhóm màu rất khác nhau đƣợc thể hiện trên bảng 2. Hình 1. Tỷ lệ xạ khuẩn có HTKS phân theo nhóm màu Nhƣ thƣờng lệ, xạ khuẩn thuộc 2 nhóm xám và trắng vẫn chiếm ƣu thế. Tỷ lệ xạ khuẩn thuộc nhóm xám chiếm 51,23%, tiếp theo là nhóm trắng chiếm 24,07%, các nhóm màu còn lại chiếm tỷ lệ rất thấp. Tỷ lệ các chủng xạ khuẩn có HTKS tƣơng đối cao, có 82 trong tổng số 162 chủng đƣợc kiểm tra, chiếm 50,62%. So sánh với các kết quả đã công bố [1,2,3,4], đây là một tỷ lệ khá cao. Điều này đã chứng tỏ số lƣợng xạ khuẩn có khả năng sinh CKS ở các khu vực có hoạt động khai thác khoáng sản không những không thấp mà có phần còn cao hơn so với nhiều khu vực khác ở Thái Nguyên [1,2]. Kết quả trên bảng 2 và hình 1 còn cho thấy tỷ lệ xạ khuẩn có HTKS cũng rất khác nhau giữa các nhóm màu. Nhóm màu xám có số lƣợng chủng nhiều nhất đồng thời cũng có tỷ lệ chủng có HTKS cao nhất (chiếm 46,34%). Tuy nhiên, nếu xét riêng từng nhóm màu, các nhóm màu vàng, tím và hồng, mặc dù số lƣợng chủng ít nhƣng tỷ lệ chủng có HTKS lại rất cao. Đây là kết quả đáng lƣu ý. Phổ kháng sinh của các chủng xạ khuẩn phân lập Kiểm tra khả năng ức chế các nhóm VSV kiểm định, kết quả thể hiện trên bảng 3 và hình 2 đã cho thấy tính đối kháng của các chủng xạ khuẩn với các VSV kiểm định rất khác nhau. Trong tổng số 82 chủng có HTKS, nhƣ thƣờng lệ, số chủng có khả năng kháng vi khuẩn Gram (+) là cao nhất, có 61 chủng - chiếm 74,39%, tiếp theo là kháng nấm mốc, có 58 chủng - chiếm 70,73% và thấp nhất là kháng vi khuẩn Gram (-), chỉ có 37 chủng - chiếm 45,12%. Đặc biệt, trong số này có 31 chủng - chiếm 37,8% có khả năng kháng đƣợc cả 2 nhóm vi khuẩn Gram (+) và Gram (-), có 20 chủng - chiếm 24,39% kháng đƣợc cả 3 nhóm vi khuẩn Gram (+), Gram (-) và nấm mốc. Bảng 3. Tính đối kháng của xạ khuẩn với các nhóm VSV kiểm định Xạ khuẩn có HT với VK Gr(+) Xạ khuẩn có HT với VK Gr(-) Xạ khuẩn có HT với nấm mốc Xạ khuẩn có HT với cả 2 nhóm VK Gr(+) và Gr(- Xạ khuẩn có HT với cả 3 nhómVK Gr(+), Gr(-) và nấm mốc Đỗ Thị Tuyến và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 86(10): 153 - 158 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 156 ) Số lƣợng Tỷ lệ (%) Số lƣợng Tỷ lệ (%) Số lƣợng Tỷ lệ (%) Số lƣợng Tỷ lệ (%) Số lƣợng Tỷ lệ (%) 61 74,39 37 45,12 58 70,73 31 37,80 20 24,39 Hình 2. Tỷ lệ các chủng XK có HT với các nhóm VSV kiểm định Số lƣợng và tỷ lệ các chủng xạ khuẩn có hoạt tính với mỗi VSV kiểm định có sự khác nhau và đƣợc thể hiện trên bảng 4 và hình 3. Trong số 7 chủng VSV kiểm định, số chủng có hoạt tính với Staphylococcus aureus chiếm tỷ lệ cao nhất (54 chủng - chiếm 65,85%) và thấp nhất là kháng nấm Fusarium solani (chỉ có 22 chủng - chiếm 26,83%). Hình 3. Tỷ lệ các chủng XK có HT với các VSV kiểm định 1: Staphylococcus aureus ATCC 25923 2: Bacillus subtilis VTCC-B-888 3: Escherichia coli VTCC-B-883 4: Pseudomonas aeruginosa VTCC-B-481 5: Fusarium oxysporum VTCCF-1301 6: Fusarium solani VTCCF-1302 7: Aspergillus niger VTCCF-001 Bảng 4. Tỷ lệ các chủng XK có HT với các VSV kiểm định Vi sinh vật kiểm định Chủng XK có HTKS Số lượng Tỷ lệ (%) Vi khuẩn Gr(+) Staphylococcus aureus ATCC 25923 54 65,85 Bacillus subtilis VTCC-B-888 45 54,88 Vi khuẩn Gr(+) Escherichia coli VTCC-B-883 32 39,02 Pseudomonas aeruginosa VTCC-B-481 22 26.83 Nấm mốc Fusarium oxysporum VTCCF-1301 42 51,22 Fusarium solani VTCCF-1302 22 26,83 Aspergillus niger VTCCF-001 32 39,02 Bảng 5. HTKS của 10 chủng xạ khuẩn tuyển chọn Ký hiệu chủng Hoạt tính kháng sinh (D-d, mmm) E.coli VTCC-B-883 P. aeruginosa VTCC-B-481 B. subtilis VTCC-B- 888 S. aureus ATCC 25923 F. oxysporum VTCCF-1301 F. solani VTCCF- 1302 A.niger VTCCF- 001 TC 13.1 24,5 ± 0,5 28,3 ± 0,4 23,5 ± 0,5 22,6 ± 0,5 26,4 ± 0,5 25,9 ± 0,3 - TC 13.2 26,4 ± 0,5 29,8 ± 0,4 24,2 ± 0,3 24,5 ± 0,5 24,8 ± 0,3 26,0 ± 0,5 - TC 15.9 27,2 ± 0,3 27,3 ± 0,4 15,7 ± 0,5 11,2 ± 0,3 18,9 ± 0,4 12,1 ± 0,4 - TC 12.1 26,3 ± 0,6 20,7 ± 0,3 20,7 ± 0,3 27,1 ± 0,4 25,1 ± 0,4 24,6 ± 0,5 - 74.39% 45.12% 70.73% 37.8% 24.39% 0 10 20 30 40 50 60 70 80 T ỷ l ệ ch ủ n g c ó H T K S (% ) VK G+ VK G- NÊm mèc VK G+ vµ G- NÊm mèc VK G+ vµ G- Nhóm VSV kiểm định Đỗ Thị Tuyến và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 86(10): 153 - 158 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 157 TC 16.12 10,8 ± 0,3 8,9 ± 0,4 10,8 ± 0,3 13,1 ± 0,4 15,4 ± 0,5 16,5 ± 0,5 - HT 17.8 10,2 ± 0,1 11,2 ± 0,1 10,2 ± 0,2 10,2 ± 0,1 15,1 ± 0,1 16,8 ± 0,7 - HT 19.1 20,8 ± 0,7 20,5 ± 0,5 17,2 ± 0,3 15,2 ± 0,2 23,8 ± 0,7 27,8 ± 0,7 - HT 12.2 12,2 ± 0,2 15,3 ± 0,5 11,2 ± 0,1 15,4 ± 0,3 17,5 ± 0,5 11,2 ± 0,1 - HT 19.2 10,3 ± 0,3 10,2 ± 0,2 - 13,2 ± 0,1 5,0 ± 0,4 15,2 ± 0,2 - HT 17.18 15,3 ± 0,3 6,0 ± 0,7 15,3 ± 0,3 - - 9,2 ± 0,1 - Hình 4. Khả năng ức chế VSV kiểm định của một số chủng xạ khuẩn 1: TC16.12; 2: TC15.9; 3: TC13.1; 4: TC13.2; 5: TC12.1; 6: HT 19.1; 7: HT 17.8; 8: HT 17.18 Tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng sinh cao Căn cứ từ các kết quả kiểm tra sơ bộ về HTKS ở trên, chúng tôi chọn ra 10 chủng có hoạt tính cao, hoạt phổ rộng để tiếp tục sàng lọc. Các chủng này đƣợc nuôi lắc trong môi trƣờng Gause I dịch thể và kiểm tra HTKS của dịch lên men bằng phƣơng pháp đục lỗ. Kết quả đƣợc thể hiện ở bảng 5. Kết quả trên cho thấy phần lớn các chủng lựa chọn đều vẫn giữ đƣợc hoạt tính khi chuyển từ môi trƣờng thạch sang môi trƣờng dịch thể. Hoạt tính của các chủng tƣơng đối ổn định. Tuy nhiên tất cả các chủng đều không có hoạt tính với nấm Aspergillus niger VTCCF-001. Có 5 chủng có hoạt tính mạnh nhất, có khả năng ức chế đƣợc với 6 trong 7 chủng VSV kiểm định: TC13.1, TC13.2, TC12.1, HT 17.8, HT 19.1 (hình 4). Với hƣớng nghiên cứu tuyển chọn ra các chủng có HTKS cao, có hoạt phổ rộng và đặc biệt là có hoạt tính kháng nấm gây bệnh thực vật, 5 chủng trên đƣợc lựa chọn để tiếp tục nghiên cứu. KẾT LUẬN 1. Số lƣợng xạ khuẩn phân bố ở trong đất tại khu vực núi Pháo, Đại Từ và mỏ sắt Trại Cau, Đồng Hỷ, Thái Nguyên dao động trong khoảng từ 1,7 x 106 đến 12,07 x 106 CFU/g đất. 2. Đã phân lập và thuần khiết đƣợc 162 chủng xạ khuẩn từ 40 mẫu đất thu tại một số khu vực đất bị nhiễm quặng của tỉnh Thái Nguyên, trong đó có 82 chủng có hoạt tính kháng sinh (chiếm 50,62%), 61 chủng (74,39%) kháng vi khuẩn Gram (+), 58 chủng (70,73%) kháng nấm mốc, 37 chủng (45,12%) kháng vi khuẩn Gram (-), 31 chủng (37,8%) cả 2 nhóm vi khuẩn kiểm định G+ và Đỗ Thị Tuyến và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 86(10): 153 - 158 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 158 G-, 20 chủng (24,39%) kháng cả vi khuẩn (+), vi khuẩn Gram (-) và nấm mốc. 3. Đã tuyển chọn ra 5 chủng xạ khuẩn TC 12.1, TC 13.1, TC 13.2, HT 19.1, HT17.8 có hoạt tính kháng nấm mạnh (F. oxysporum VTCCF-1301và F. solani VTCCF-1302) sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo. TÀI LIỆU THAM KHẢO [1]. Vi Thị Đoan Chính (2011), Tuyển chọn và nghiên cứu xạ khuẩn có khả năng đối kháng với một số chủng vi khuẩn gây nhiễm trùng bệnh viện. Báo cáo tổng kết đề tài khoa học và công nghệ cấp Bộ. Mã số: B2009-TN07-02. [2]. Vi Thị Đoan Chính, Trịnh Ngọc Hoàng, Trịnh Đình Khá, Vũ Thị Lan (2007), Nghiên cứu sự phân bố của xạ khuẩn sinh chất kháng sinh phân lập từ đất Thái Nguyên. Báo cáo khoa học Hội nghị toàn quốc NCCB trong khoa học sự sống. Tr.433 – 437. [3]. Lê Đức, Nguyễn Quốc Việt (2007), Tác động của hoạt động khai thác khoáng sản tại Đại Từ, Đồng Hỷ, Thái Nguyên đến môi trường khu vực. Hội tháo KH Quốc gia “Những vấn đề môi trƣờng và phát triển bền vững vùng đông bắc. Tr.153 – 159. [4]. Nguyễn Lân Dũng, Phạm Thị Trân Châu, Nguyễn Thanh Hiền, Lê đình Lƣơng, Đoàn Xuân Mƣợu, Phạm Văn Ty (1978), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, Tập III, Nxb KH&CN, Hà Nội. [5]. Bùi Thị Việt Hà, 2006, Nghiên cứu xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh thực vật ở Việt Nam, Luận án tiến sĩ sinh học, Hà Nội. [6]. Nguyễn Huỳnh Minh Quyên (2011), Điều tra nghiên cứu một số hoạt chất có khả năng kháng vi sinh vật và kháng dòng tế bào ung thƣ từ tế bào xạ khuẩn. Báo cáo tổng kết đề tài KH&CN cấp ĐH Quốc gia. Mã số 09.48. Hà Nội. SUMMARY ANTIBIOTIC ACTIVITY OF SOME ACTINOMYCETES ISOLATED FROM SOIL WITH MINING OPERATIONS Do Thi Tuyen, Dao Thi Hang, Luong Thi Huong Giang, Nguyen Thi Huong Lien, Vi Thi Đoan Chinh College of Sciences – TNU A total of 162 actinomycete strains of the genus Streptomyces were isolated and pured from 40 soil samples collected from Thai Nguyen province. These isolates were then examined antibiotic activities by agar streak method against Gram-positive (Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus), Gram-negative (Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa ,) bacteria and fungi (Fusarium oxysporum, Aspergillus niger, Fusarium solani). Results indicated that 82 isolates exhibited antibiotic activity (50,62%). Among them, 61 strains (74,39%) possessed antibiotic activity against Gram positivie bacteria, 37 strains (45,12%) – against Gram negative bacteria, 58 strains (70,73%) – against fungi. In particular, there are 31 strains (37.8%) against both Gram (+) and Gram (-) bacteria, 20 strains (representing 24.39%) against all three groups of Gram (+), Gram (-) bacteria and fungi. Five strains signed as TC 12.1, TC 13.1, TC 13.2, HT 19.1, HT 17.8 and HT 12.2 with high active against fungi were selected for further investigation. Key words: antibiotic, strains, mycelium, antibiotic activity, actinomycetes.  Tel: 0987 123606, Email: vichinh57@gmail.com