Hóa sinh học thực nghiệm

HÓA SINH HỌC THỰC NGHIỆM CHƯƠNG 1. NHỮNG NGUYÊN TẮC VÀ CHUẨN BỊ CƠ BẢN TRONG CÁC NGHIÊN CỨU HÓA SINH HỌC Những nguyên tắc an toàn khi làm việc với các phòng thí nghiệm hóa sinh học. Cần tuân thủ nghiêm ngặt các quy định của phòng thí nghiệm Một số hóa chất có độc tính cao, có thể gây bỏng, gây mê, gây dị ứng hoặc có ảnh hưởng nghiêm trọng, lâu dài đến sức khỏe con người cần được bảo quản đúng nguyên tắc, sử dụng phương tiện bảo vệ thích hợp khi tiếp xúc. Khi có sự cố làm đổ hóa chất rat ay, chân, quần áo hay ra phòng thí nghiệm thì phải dùng các biện pháp sơ cứu thích hợp để nhanh chóng hạn chế tác hại và ngay sau đó phải báo cho cán bộ hướng dẫn hoặc những người có chuyên môn hay nghiệp vụ để xử lý. Các hóa chất phóng xạ có những quy định riêng và khi làm việc với các chất phóng xạ phải đọc kỹ các quy định về an toàn phóng xạ và phải được học qua lớp an toàn phóng xạ do những tổ chức có thẩm quyền huấn luyện. Các loại tế bào mang thể tái tổ hợp và nhiều phế thải của thí nghiệm cần được xử lý và thải bỏ theo những phương thức phù hợp để tránh gây ra những tác hại đến con người và môi trường. Bảo quản và sử dụng hóa chất Bảo quản và sử dụng hóa chất đúng là điều kiện đầu tiên đảm bảo thí nghiệm thành công của thí nghiệm. Bảo quản và cất giữ hóa chất theo đúng yêu cầu của hãng sản xuất hay chỉ dẫn của các sách tra cứu. Cần sử dụng các hóa chất đạt độ tinh khiết phù hợp theo yêu cầu thí nghiệm. Khi pha hay chuẩn bị hóa chất cần lưu ý nồng độ hòa tan tối đa của các chất khác nhau trong nước hoặc trong dung môi hữu cơ (ethanol, isopropanol,..) là rất khác nhau. Thời gian sử dụng và bảo quản hóa chất tùy thuộc vào nồng độ của hóa chất hoặc loại hóa chất Một số hóa chất phải chuẩn bị ở dạng vô trùng: dùng nồi hấp hoặc màng lọc tùy theo loại hóa chất. Hạn chế tối đa làm nhiễm bẩn hóa chất trước, trong khi sử dụng. phần lớn vật tư tiêu hao dùng cho hóa sinh học và sinh học phân tử chỉ nên dùng một lần và ở dạng vô trùng. Cách chuẩn bị một số hóa chất và dung dịch thường dùng. Một số nồng độ 3.1 Nồng độ phần trăm Nồng độ phần trăm theo thể tích (w/v): là số gam chất tan trong 100ml dung dịch. VD: pha 80ml dd Na2CO3 2,5% Nồng độ phần trăm theo khối lượng (w/w): là số gam chất tan trong 100g dung dịch. VD: pha 250ml dd Na2CO3 14%. Nồng độ phần trăm theo thể tích (v/v): là số ml chất đó trong 100ml dung dịch. Nồng độ mg% có nghĩa là số mg chất đó trong 100g nguyên liệu hay hỗn hợp. Nồng độ % bão hòa là nồng độ % so với khả năng hòa tan tối đa của chất đó trong dung dịch. Nồng độ part per million (ppm) là phần chất đó trong 1 triệu g. Nồng độ phân tử gam M = mole/L: là số phân tử gam chất tan có trong 1 lít dung dịch VD: NaOH 0,3M, có nghĩa là có 0,3x40=12g NaOh trong 1 lít dung dịch. Nồng độ đương lượng N là số đương lượng gam chất tan có trong 1 lít dung dịch Với acid thì nồng độ đương lượng được tính bằng số phân tử gam chất tan chia cho số ion H+ tham gia phản ứng trao đổi. VD: HCl 1N, tức là có 36,5g HCl trong 1 lít dung dịch; H2SO4 1N, tức là có 98g:2=49g H2SO4 trong 1 lít dd. Với bazơ thì nồng độ đương lượng được tính bằng số phân tử gam chia cho số nhóm hydroxyl (OH-) trong phân tử chất đó. VD: NaOH 2N, tức là có 2x(40:1)=80g NaOH trong 1 lít dung dịch; Mg(OH)2 0,5N tức là có 0,5x(41:2)=10,25g Mg(OH)2 trong 1 lít dd. Với chất oxy hóa-khử như KmnO4 trong phản ứng với H2O2 Ngoài ra, hiện nay người ta còn dùng nồng độ “x” vì loại dung dịch này chứa nhiều thành phần khác nhau, việc liệt kê đầy đủ thành phần, nồng độ sẽ mất thời gian nên các đệm này có tên chung hoặc theo ký tự sao cho dễ thực hiện, theo dõi. Nồng độ làm việc là nồng độ 1x. Chuẩn bị nhanh các dung dịch từ nồng độ các nồng độ đã biết. Pha loãng nồng độ của một dung dịch ra n lần: thì ta chỉ cần lấy n-1 thể tích dung môi và cho thêm 1 thể tích dung dịch cần pha loãng sẽ được dung dịch mới có nồng độ nhỏ đi n lần. VD: Pha ATP 200mM thành ATP 2,4mM, ta lấy 200:2,4=83,3 lần. Ta lấy n(83,3)-1=82,3 thể tích (dung môi, nước) và bổ sung 1thể tích ATP 200mM vào, lắc đều, ta sẽ có dung dịch ATP 2,4mM. Pha một dung dịch có nồng độ phần trăm tương ứng từ một dung dịch có nồng độ cao hơn: Ta cần pha X% từ dung dịch Y% có nồng độ cao hơn thì ta lấy Xml dung dịch Y% bổ sung thêm nước đến Yml. Cách chuẩn bị một dung dịch đệm: có 2 cách Cách 1. Pha hai thành phần của đệm ( một có tính acid, một có tính bazo) sau đó trộn chúng lại với nhau theo tỉ lệ được ghi trong các bảng đệm để có dung dịch đệm với pH và nồng độ mong muốn. Cách 2: Tính toán nồng độ và thể tích cần pha của đệm sau đó cân lượng hóa chất cần thiết của thành phần thứ nhất, hòa tan trong một thể tích nước vừa phải sau đó bổ sung từ từ thành phần thứ hai để đưa về giá trị pH cần pha, sau đó thêm nước để đạt thể tích tính toán ban đầu. Lưu ý khi sử dụng đệm: Đệm chỉ có khả năng đệm (duy trì pH hỗn hợp phản ứng ổn định) trong một vùng pH nhất định, thường là trong phạm vi trên dưới 1 đơn vị pH so với giá trị pKa của đệm. pH của một số đệm thay đổi theo nhiệt độ, độ pha loãng hay khi được bổ sung một số thành phần khác. Chính vì vậy, cần kiểm tra pH của dung dịch đệm khi thay đổi nhiệt độ, pha loãng hay bổ sung thêm chất nào đó. Một số đệm có thể hấp thụ ánh sáng tử ngoại, can thiệp vào phân tích, có thể thâm nhập qua màng tế bào và gây độc. Trong một số phản ứng đệm phản ứng thường rất phức tạp, ngoài dung dịch đệm đảm bảo sự ổn định của pH thì người làm việc phải bổ sung thêm các chất khác như: NaCl,KCl, muối kim loại, gelatin, albumin Các tính chất của hệ thống đệm tốt: pKa nằm ở vùng 6 - 8 Có độ hòa tan cao trong các hệ thống với dung môi chủ yếu là nước Không bị hoặc ít bị vận chuyển bởi các màng sinh học Bị ảnh hưởng tối thiểu bởi các muối. Ít bị ảnh hưởng khi phân ly do thành phần ion, hay khi thay đổi nồng độ, nhiệt độ. Không tạo phức giữa đệm và ion kim loại. Bền vững về mặt hóa học Ít hấp thụ ánh sáng tử ngoại và nhìn thấy Sẵn có ở dạng tinh khiết. CHƯƠNG 2. CÁC QUY TRÌNH THÍ NGHIỆM THÔNG THƯỜNG Thu thập, chuẩn bị và bảo quản các mẫu nghiên cứu. Thu thập mẫu nghiên cứu. Mẫu nghiên cứu phải có nguồn gốc, lý lịch rõ ràng. Mẫu phải đủ về số lượng, chủng loại, khối lượng để triển khai đủ tạo ra số liệu tin cậy. Mẫu được bảo quản phù hợp để không bị biến đổi hoặc hạn chế tối đa những thay đổi sau lấy mẫu Chuẩn bị mẫu nghiên cứu. Các hợp chất sinh học tồn tại ở một trong hai dạng ngoại bào hoặc nội bào. Việc thu nhận các hợp chất ngoại bào thường dùng ly tâm hoặc lọc để loại bỏ tế bào và các chất không tan khác.Tuy vậy, nhóm chất ngoại bào chỉ chiếm một phần rất nhỏ so với các chất nội bào. Để thu dịch chiết tế bào hay mô, cần có phương pháp phá vỡ tế bào/mô phù hợp. Các phương pháp chính được dùng: Nghiền đồng thể: sử dụng máy nghiền mô bằng tay hay gắn mô tơ Siêu âm: phá vỡ bằng cách tạo ra sự va đập của mẫu do tác động rung siêu âm tạo ra. Thay đổi áp suất đột ngột: ép mẫu với một áp suất lớn rồi thả ra đột ngột. Lắc hay va đập với cát thủy tinh: dùng máy làm vỡ hạt/tế bào tạo lực va đập, đồng thời trong mẫu có thêm cát thủy tinh thì mô và tế bào bị phá vỡ rất nhanh. Phá vỡ bằng enzyme: Sử dụng enzyme phân hủy thành tế bào lysozyme và mutanolysin. Phá vỡ bằng chất tẩy rửa: Một số chất tẩy rửa có thể phá vỡ các tế bào hay cơ quan tử. Phá vỡ bằng áp suất thẩm thấu: VD hồng cầu Phá vỡ bằng làm đông – làm tan đột ngột: Là pp dùng sự thay đổi nhiệt độ từ chỗ rất lạnh để tế bào bị đông cứng sau đó cho ngay vào nhiệt độ làm tan đá để phá vỡ tế bào. Bảo quản mẫu nghiên cứu: Các mẫu sinh học rất dễ bị biến đổi trong quá trình bảo quản, vì vậy sử dụng biện pháp bảo quản thích hợp cũng là vấn đề hết sức cần thiết. Với các mẫu sinh học thông thường như lá, quả, mô động vật, dịch nuôi cấy vi khuẩn bảo quản ở 40C. Hạt hay các mẫu mô thực vật (lá, thân) đã được phơi khô bảo quản ở nhiệt độ phòng. Những mẫu vật cần bảo quản lâu dài, dịch chiết tế bào, rất nhiều chế phẩm enzyme cần bảo quản ở nhiệt độ rất thấp. Bố trí thí nghiệm và xử lý kết quả Nguyên tắc chung: Để một nghiên cứu có kết quả tốt, người làm thí nghiệm phải xác định rõ mục đích và các tiêu chí phải đạt được của nghiên cứu đó. Từ đó, xác định các nội dung, phạm vi thí nghiệm cần thực hiện, xác đinh hay lựa chọn các phương pháp, kỹ thuật phải sử dụng. Sau đó, lập kế hoạch thực hiện các thí nghiệm với các quy trình cụ thể. Xây dựng Protocol phân tích Nguyên tắc của phương pháp hay phép phân tích Nguyên liệu, hóa chất, thiết bị, máy móc và dụng cụ Cách làm hay các bước tiến hành Tính toán kết quả. Các vấn đề cần lưu ý Kiểm tra độ tin cậy của kết quả thu được. Phân tích định tính và định lượng các hợp chất sinh học Độ nhạy là giới hạn thấp nhất mà phép đo/phân tích vẫn đo/phân tích được một cách tin cậy. Độ đặc hiệu trong phép đo/phân tích một chất là giới hạn hay khả năng của phép đo/phân tích cho phép phân biệt chất đó với chất khác, đặc biệt là các chất tương tự nó. Mức độ tin cậy của các phân tích chính là khả năng lặp lại của thí nghiệm để cho cùng kết quả. Các phương pháp phân tích trong hóa sinh. Phương pháp chuẩn độ: La phương pháp có tính cổ điển dựa trên tương tác hóa học của hợp chất quan tâm với một chất khác có nồng độ đã biết kèm theo một chất chỉ thị màu để đảm bảo phát hiện đúng điểm dừng của phản ứng, từ đó tính ra lượng hay nồng độ của chất quan tâm. Phương pháp đo quang phổ: Định lượng các chất bằng phép đo quang phổ là phương pháp được sử dụng phổ biến nhất trong tất cả các phân tích hóa sinh do tính chính xác và thuận tiện. Phương pháp này dựa trên sự hấp thụ ánh sáng của một số hợp chất tại vùng bước sóng nhất định và hàm lượng của chất đó được tính ra theo nguyên tắc của định luật Lambert Beer. Theo định luật này thì độ hấp thụ ánh sang của một chất tỷ lệ với nồng độ của chất đó và được thể hiện qua công thức A = logI0/I = ε.l.c A: độ hấp thụ ánh sang I0: Cường độ tia tới ε: hệ số tắt phân tử gam I: Cường độ ánh sáng truyền qua l: độ dày của dung dịch c: Nồng độ chất phân tích. Hệ số tắt phân tử gam là độ hấp thụ của chất đó khi ở nồng độ 1M, sử dụng cuvette đo có chiều dày dung dịch 1cm và trong các điều kiện nhiệt độ, pH xác định. Phương pháp huỳnh quang: Các pp đo huỳnh quang dựa trên đặc trưng của một số chất có khả năng nhận ánh sáng kích thích ở mức năng lượng cao và bức xạ ra ánh sáng ở mức năng lượng thấp hơn ở một bước sóng đặc trưng nên người ta sẽ định lượng được chất cần quan tâm. Phương pháp miễn dịch: Trường hợp chất cần xác định có tính kháng nguyên, thì người ta có thể dựa vào tương tác kháng nguyên – kháng thể tương ứng tạo ra để định lượng bằng kỹ thuật phân tích hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme gọi tắt là ELISA ( Enzyme linked Immunosorbant Assay). Kháng thể trong các phép phân tích này thường là kháng thể đơn dòng có tính đặc hiệu cao. Minh họa: CPT+KTSC - KTTC+E — cơ chất -à sản phẩm có màu. Enzyme có khả năng chuyển hóa cơ chất không màu thành sản phẩm có màu. Nồng độ chất cần phân tích sẽ được định lượng qua nồng độ chất màu tạo thành và được đo theo nguyên tắc đo quang phổ hấp thụ. Phương pháp phóng xạ: PP dựa trên cơ sở đánh dấu hợp chất quan tâm bằng một trong những nguyên tố phóng xạ.Nguyên tố đồng vị phóng xạ là nguyên tố có hạt nhân không bền vững, nó phân rã và kèm theo sự bức xạ ra các hạt hay các tia và sự bức xạ này có thế được đo bằng thiết bị phóng xạ. Phương pháp khổi phổ MS: Khối phổ là phổ về khối lượng. Nguyên lý của phép đo khối phổ là: khi hai phân tử A và B được xác định có khối lượng hoàn toàn giống nhau thì có thể cùng một chất, đặc biệt nếu phân tử chất A được cắt thành các mảnh nhỏ, sau đó phân tích khối lượng của các mảnh nhỏ và thấy phổ khối lượng thu được giống hoàn toàn khối phổ chất B đã biết, thì chắc chắn A và B là một. Phân tích khối phổ bằng sắc ký khí (Gass chromatography mass spectrometry-GCMS) căn cứ vào thời gian và độ lớn của đỉnh của chất này so với chất chuẩn có hàm lượng đã biết người ta có thể nhận biết và định lượng ra chất quan tâm. MALDI:(Matrix assisted laser desortion inoization) phương pháp ion hóa phản hấp thụ laser hỗ trợ bằng chất nền. PP MALDI các ion protein được tạo ra được gia tốc qua một trường điện từ và chúng đi qua một ống bay để đến một detector. Như vậy thời gian bay (TOF) của một ion protein hay peptid trong ống là thước đo tỷ số khối lượng trên điện tích (m/z) của nó. Và, ESI MS ( Electrospray ionization mass spectrometry) phân tích khối phổ ion hóa phun điện tử. Dung dịch protein được phân tán thành những giọt nhỏ tích điện nhờ cho đi qua một kim nhỏ và trong một điện trường điện thế cao. Cộng hưởng từ hạt nhân: Là PP đo phổ hấp thụ với một số đặc trưng tương tự như đo phổ nhìn thấy và tử ngoại. Nguyên lý cơ bản dựa trên đặc trưng của tất cả hạt nhân đều tích điện dương. Các biện pháp nâng cao tính chính xác của phân tích. Các phương pháp nâng cao độ nhạy của phép đo. Cô đặc mẫu: Khi giới hạn của phương pháp không thể cho phép phát hiện vì hàm lượng của chất cần phân tích quá nhỏ thì cô đặc mẫu là phương pháp đơn giản để cho phép phân tích được thực hiện có kết quả Sửa dụng chất đồng vị phóng xạ: Sử dụng chất phát huỳnh quang Nhân bản Tích lũy hay quay vòng Các phương pháp nâng cao độ đặc hiệu của phép đo Sử dụng các phản ứng đặc trưng của chất cần phân tích để tăng tính đặc hiệu Dựa trên các tương tác đặc hiệu sinh học: Các tương tác sinh học là cơ sở để phát triển các phép đo có tính đặc hiệu cao như: tương tác giữa enzyme cà cơ chất hay chất ức chế cạnh tranh, giữa enzyme và cofactor hay coenzyme, giữa kháng nguyên và kháng thể, giữa hormone và vitamine với các thụ thể tương ứng, hay giữa các đoạn oligonucleotid có trình tư bổ sung lẫn nhau. Phân tích hoạt độ enzyme Nguyên tắc: E + S ↔ ES↔ES* ↔ E + P E: Enzyme S: cơ chất P: sản phẩm ES: Phức chất hình thành giữa enzyme và cơ chất ES*: là phức chất giữa enzyme với cơ chất mà trong đó cơ chất đã được biến đổi gần như sản phẩm của phản ứng. Hoạt độ enzyme có thể được xác định bằng cách phân tích cơ chất còn lại hay sản phẩm tạo thành của phản ứng trong một đơn vị thời gian, hoặc kết hợp cả hai. Hoạt độ xúc tác của enzyme được tính bằng một đơn vị hoạt độ. Một đơn vị hoạt độ enzyme là lượng enzyme xúc tác cho phản ứng chuyển hóa một micromol cơ chất thành sản phẩm trong thời gian một phút ở điều kiện phân tích. Hoạt độ riêng của enzyme được tính bằng số đơn vị hoạt độ enzyme trên một miligram hay gram protein. Hoạt độ riêng phản ánh mức độ tinh sạch của chế phẩm enzyme. Để phân tích chính xác hoạt độ enzyme thì trong phản ứng xác định hoạt độ enzyme cần phải sử dụng nồng độ dư thừa cơ chất và cofactor (nếu enzyme cần cofactor) và chỉ để phản ứng diễn ra trong một khoảng thời gian xác định. Các phương pháp phân tích hoạt độ enzmyme: Phân tích liên tục: là phương pháp đo cơ chất bị biến đổi liên tục hay sản phẩm tạo thành một cách liên tục theo thời gian. Áp dụng khi không có chất hay cách làm ngừng phản ứng thích hợp hoặc được áp dụng với một số enzyme dễ bị mất hoạt tính xúc tác ở điều kiện phân tích. Phân tích gián đoạn: là pp cho enzyme tác dụng với cơ chất ở điều kiện thích hợp và sau một khoảng thời gian nhất định thì làm ngừng phản ứng enzyme, sau đó đo lượng cơ chất còn lại hoặc sản phẩm tạo thành. Ngoài hai pp chủ yếu ở trên còn có một số phương pháp khác như: PP đo độ nhớt, pp phân cực kế, pp đo áp suất khíTùy theo enzyme mà người ta thiết kế những cơ chất phù hợp và pp thích hợp để định tính hay định lượng enzyme cần phân tích. Một số lưu ý khi phân tích hoạt độ hay thực hiện phản ứng enzyme. pH và nhiệt độ Cơ chất, thành phần đệm, lực ion hay nồng độ muối, các chất làm nền Thời gian phản ứng của các mẫu phân tích phải đồng đều nhau Phải luôn luôn có mẫu kiểm tra thích hợp để tránh sai số Phương pháp làm ngừng phản ứng thích hợp CHƯƠNG 3. PHÂN TÁCH CÁC CHẤT BẰNG LY TÂM Giới thiệu chung về ly tâm Các loại ly tâm Một số điều cần lưu ý khi dùng ly tâm CHƯƠNG 4. PHÂN TÁCH CÁC CHẤT BẰNG SẮC KÝ Nguyên tắc chung của các phương pháp sắc ký Sắc ký bản mỏng Sắc ký lọc gel Sắc ký trao đổi ion Sắc ký ái lực Một số loại sắc ký khác CHƯƠNG 5. PHÂN TÁCH CÁC CHẤT BẰNG ĐIỆN DI Giới thiệu chung về điện di Điện di gel polyacrylamide Điện di gel agarose Điện di xung trường Điện di miễn dịch và thẩm tách miễn dịch Điện di hai chiều CHƯƠNG 6. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH CÁC HỢP CHẤT SINH HỌC THƯỜNG GẶP Phương pháp định lượng Protein Phương pháp tách chiết DNA Phương pháp tách chiết RNA Phương pháp định lượng acid nucleic Phân tích một số hợp chất sinh học phân tử nhỏ Phân tích hoạt độ một số enzyme và chất ức chế enzyme Tách chiết và tinh sạch protein