Hệ amylase và ứng dụng trong công nghệ thực phẩm

daïng B. amyloliquefaciens. Amylose vaø amylopectin caû hai ñeàu cho saûn phaåm ban ñaàu phaàn lôùn laø G2 , G3 , G6 vaø G7 vôùi söï phaân caét daàn theo thôøi gian vaø glucose ñöôïc hình thaønh. Vôùi glycogen, saûn phaåm chính ban ñaàu laø G6 vaø G7 , sau ñoù laø G1 , G2 vaø G6 ñöôïc tìm thaáy vôùi soá löôïng nhieàu nhaát. Vôùi nhöõng cô chaát ngaén hôn, G6 ñöôïc thuyû phaân chaäm ñeán G1 vaø G5, vôùi moät vaøi G2 vaø G3 , G7 ñi tôùi G1 vaø G6 vaø cuõng töø G2 vaø G5, vaø G8 , G9 vaø G10 cho G2 , G3 vaø G6 . G12 saûn xuaát moät loaït nhöõng saûn ban ñaàu : G2 vaø G10 , G3 vaø G9 , G4 vaø G8 , vaø 2G6 . Söû duïng nhaõn G6 ñeå chæ raèng söï phaân caét taïi lieân keát gaàn ñoaïn cuoái. Keát quaû naøy laø cuûa chính 2 nhoùm taùc giaû Thoma vaø Hiromi ñeå thaønh laäp sô ñoà caáu taïo phaân töû cuûa enzyme, moãi nhoùm söû duïng nhöõng kyõ thuaät tính toaùn khaùc nhau döïa treân nhöõng döõ lieäu thöïc nghieäm khaùc nhau, söï khaùc nhau naøy ñöôïc giaûi thích bôûi Thoma vaø Allen, nhöng toùm laïi thì cuõng raát gioáng nhau. Thoma vaø nhoùm coäng söï söû 41 duïng α-metylmalto-oligosaccharide, thaáy raèng Km giaûm ñeàu theo chuoãi daøi 12, nhöng Vmax laïi taêng ít nhaát tôùi khi ñoä polymer hoaù DP baèng 9. vôùi söï phaân caét lieân keát thöôøng xuyeân, ñieàu naøy chæ ra raèng trung taâm hoaït ñoäng coù 9 caáu töû vôùi vò trí xuùc taùc naèm ôû giöõa caáu töû thöù saùu vaø thöù baûy (chaát neàn noái laïi trôû thaønh chaát coù soá löôïng phaân töû cao hôn baèng caùch söû duïng phaân töû glucose gaàn ñoaïn cuoái). Löïc lieân keát thì aâm ôû moãi phaân töû, ngoaïi tröø taïi caáu töû thöù 3 coù giaù trò döông thaáp vaø giaù trò döông cao taïi caáu töû thöù 6 vaø 10. Naêng löôïng ôû caáu töû thöù 3 ñeå giaønh phaân caét, naêng löôïng ôû caáu töû 6 vaø 10 ñeå taêng theâm khaû naêng lieân keát cuûa oligosaccharide vôùi ñoaïn cuoái cuûa trung taâm hoaït ñoäng ñeå söï phaân caét ôû gaàn vò trí cuoái naøy. Moâ hình naøy coù theå döï ñoaùn chính xaùc thôøi gian thuyû phaân tieán haønh vaø tieán trình lieân keát öu tieân ñöôïc beû gaõy gaàn vôùi ñoaïn cuoái khi chuoãi daøi giaûm. Nhoùm cuûa Hiromi xaùc ñònh caáu hình phaân töû baèng söï khaùc nhau cuûa Vmax vaø Km vôùi chaát neàn coù chieàu daøi khaùc nhau baèng caùch ñaàu tieân söû duïng lieân keát phaân caét thöôøng, nhö nhoùm Thoma ñaõ laøm. Sau ñoù tìm thaáy raèng giaù trò Km giaûm lieân tuïc theo chuoãi daøi, nhöng Vmax taêng cho ñeán khi cô chaát coøn 8 ñôn vò chieàu daøi. Taát caû caùc phaân töû ñeàu coù naêng löôïng lieân keát aâm tröø phaân töû thöù 6, vôùi phaân töû thöù 3 vaø thöù 7 thì ôû gaàn 0. Vò trí phaân caét laø giöõa phaân töû thöù 6 vaø thöù 7 vaø toång soá phaân töû laø 8. Noù döôøng nhö coù moät phaân töû tryptofan vaø moät phaân töû tyrosine ôû gaàn vò trí caét vaø moät phaân töû histidine ñöôïc ñaët taïi phaân töû thöù nhaát hoaëc thöù ba, khi enzyme hoaït ñoäng cho G6 vaø lôùn hôn neáu phaân töû histidine naøy bò bieán ñoåi bôûi söï oxyhoaù cuûa aùnh saùng. Lyù thuyeát veà phaân töû deã daøng giaûi thích taïi sao caùc enzyme thuyû phaân noäi baøo vaø ngoaïi baøo seõ taêng hoaït tính vôùi söï taêng Vmax vaø söï giaûm Km treân cô chaát coù chuoãi daøi taêng. Cô chaát maø khoâng ñuû daøi ñeå laøm ñaày caùc phaân töû coù naêng löôïng lieân keát aâm thì seõ khoâng thuaän lôïi, khi ñoù chuùng khoâng maïnh ñeå chòu ñöïng söï phaân caét nhanh choùng. Khi cô chaát trôû neân nhoû hôn daàn, löïc lieân keát ngaøy caøng yeáu daàn vaø phaûn öùng ngaøy caøng chaäm hôn. Söï khaùc nhau veà naêng löôïng lieân keát töø phaân töû ñeán phaân töû coù theå ñaùp öùng thay theá cho nhöõng cô chaát ngaén veà vò trí phaân caét ñeå saûn phaåm ñaëc bieät ñöôïc taïo ra. Trong tröôøng hôïp cuûa B. amyloliquefaciens α-amylase, vò trí khoâng ñoái xöùng cuûa ñieåm phaân caét quyeát ñònh G4 vaø G5 seõ khoâng ñöôïc taïo thaønh vôùi soá löôïng cao. 42 4.2.3. α-Amylase töø thermophilic bacilli a. Giôùi thieäu Trong nhöõng thaäp nieân gaàn ñaây, α-amylase töø B. amyloliquefaciens ñaõ ñöôïc söû duïng nhieàu trong saûn xuaát coâng nghieäp, nhö söû duïng ôû giai ñoaïn ñaàu saûn xuaát dextrin cung caáp cho vieäc saûn xuaát siroâ coù haøm löôïng glucose cao. Moät nghieân cöùu môùi ñeå thay theá enzyme B. amyloliquefaciens baèng enzyme beàn nhieät hôn vaø coù theå ñöôïc saûn xuaát ôû ñoä taäp trung cao, cuoái cuøng enzyme α-amylase töø B. licheniformis ñöôïc chaáp nhaän cho nhieàu quaù trình saûn xuaát. Trong phaàn naøy chuùng ta thaûo luaän enzyme töø caùc loaøi Bacillus beàn nhieät vaø chòu nhieät khaùc nhau, maø caùc ñaëc tính hoaù lyù cuûa chuùng ñaõ ñöôïc nghieân cöùu. b. Hoãn hôïp bacillus α-amylase Moät ít thoâng tin ñöôïc vieát veà α-amylase töø B.coagulans, B.circulans, B.caldoliticus vaø B.acidocaldarius cho moät vaøi chuù thích veà chuùng. Thöïc ra, döôøng nhö noù khoâng oån ñònh hôn B.amyloliquefaciens α-amylase, söï oån ñònh ñöôïc thieát laäp cho enzyme B.caldoliticus vaø noù beàn nhieät baèng vôùi α-amylase chòu nhieät trung gian, nhöng hình nhö noù oån ñònh ôû nhieät ñoä cao hôn bôûi vì noù hoaït ñoäng hôn. Tuy nhieân, roõ raøng laø α-amylase töø B.acidocaldarius thì hoaït ñoäng ôû möùc pH thaáp hôn töø B.amyloliquefaciens vaø taïo ra saûn phaåm coù chuoåi daøi thaáp hôn. Theâm nöõa coù theå noùi tôùi B. stearothermophilis α-amylase khi noù ñaõ ñöôïc nghieân cöùu nhieàu. Thaønh phaàn acid amin cuûa noù thì töông töï, duø noù khoâng chính xaùc vôùi α-amylase töø B. amyloliquefaciens, vôùi raát ít hoaëc khoâng coù cystein. Phaân töû löôïng vaøo khoaûng 48.000 vaø cuõng ñöôïc oån ñònh bôûi ion Ca2+. Tuy nhieân khoâng coù ion Zn2+ hieän dieän. Ñoù laø ñieàu quyeát ñònh tính oån ñònh cao cuûa enzyme vaø lieân quan ñeán tính öa nöôùc cao, tuy nhieân söï lieân heä naøy khoâng aûnh höôûng nhieàu ñeán caùc enzyme khaùc. Döôøng nhö ion Ca2+ höõu ích cho vieäc beàn hôn cuûa enzyme ôû nhieät ñoä cao hôn B. amyloliquefaciens α-amylase. Enzyme B. steorothermophilus saûn xuaát soá löôïng xaáp xæ nhau giöõa caùc G2 , G3 , G4 vaø G5 töø tinh boät vaø cho saûn phaåm töông töï töø α-glucose- pyranosylfluride. 43 c. B. Licheniformis α-amylase OÅn ñònh nhaát trong taát caû caùc Bacillus α-amylase laø töø B. licheniformis, ñaõ ñöôïc xöû lyù töông ñoái ít, moâ hình hoaït ñoäng cuûa noù thì cuõng töông töï, nhöng khaùc moät ít so vôùi B. amyloliquefaciens laø cho G5 vôùi löôïng lôùn trong saûn phaåm ban ñaàu vaø caùc saûn phaåm tieáp theo laø G5 , G3 , G2 , G1 vaø G4 theo thöù töû giaûm daàn. Tæ leä thuyû phaân giaûm nhanh choùng vôùi söï giaûm chuoåi daøi ; G2 vaø G3 thì khoâng ñöôïc phaân caét. Coù moät vaøi söï khaùc bieät laø G4 vaø G5 coù hay khoâng coù bò phaân caét vaø saûn phaåm gì ñöôïc hình thaønh töø G6. Tuy nhieân, döôøng nhö noù gioáng vôùi B. amyloliquefaciens α-amylase, caùc phaân töû malto-oligosaccharide coù chieàu daøi trung bình thì öu tieân phaân caét ñoaïn gaàn cuoái. B. licheniformis α-amylase döôøng nhö cuõng coù phaân töû löôïng vaøo khoaûng 50.000 – 60.000, thaønh phaàn amino acid cuõng töông töï B. amyloliquefaciens, ngoaïi tröø haøm löôïng glycine vaø histidine cao hôn, coøn proline thì thaáp hôn. pH toái thích cho hoaït ñoäng vaø oån ñònh thì xaáp xæ gioáng nhau. Coù 2mol ion Ca2+ treân moät phaân töû enzyme, ñaït ñöôïc söï oån ñònh cao ôû noàng ñoä Ca2+ thaáp hôn nhieàu so vôùi B. amyloliquefaciens α-amylase. 4.2.4. Söï ñöôøng hoaù bôûi α-amylase cuûa B. subtilis Moâ hình hoaït ñoäng cuûa α-amylase ñöôïc saûn xuaát töø B. subtilis raát khaùc vôùi α- amylase töø B. amyloliquefaciens hoaëc töø B. licheniformis. Maëc duø coù nhieàu khuynh höôùng coù theå taïo ra caùc enzyme töông töï nhau, thöôøng gioáng amylosacchariticus ñöôïc ñeà caäp tôùi, bôûi vì tính oån ñònh cuûa noù thaáp hôn B. amyloliquefaciens, khoâng ñaït hieäu quaû kinh teá cao. Tuy nhieân, ñaëc tính cuûa noù thì raát ñaùng chuù yù, ñaëc bieät laø khi so saùnh vôùi amyloliquefaciens. Naêm 1951 Fukumoto, ñaõ keát tinh enzyme α-amylase-amylosacchariticus laàn ñaàu tieân vaø tìm thaáy pH toái thích cho hoaït ñoäng vaø oån ñònh cuûa noù thaáp hôn B. amyloliquefaciens α-amylase, taâm hoaït ñoäng cuûa noù chöùa nhieàu acid aspartic, acid glutamic, serin vaø moät ít cystein vaø methionin. Phaân töû löôïng laø 41.000 vaø ñöôïc hoaït hoaù bôûi ion Ca2+, coù chuoãi amino acid cuoái cuøng hoaøn toaøn khaùc vôùi B. amyloliquefaciens α-amylase. Maëc duø thaønh phaàn amino acid coù moät chuùt gioáng vaø 44 coù tính mieãn dòch rieâng. Teân ñuùng cuûa noù laø B. subtilis saccharifying α-amylase, coù nhieàu moâ hình hoaït ñoäng khaùc nhau leân phaân töû tinh boät. Noù coù theå saûn xuaát siroâ coù ñöông löôïng dextrose DE 70 vôùi xaáp xæ 50% (w/w) glucose so vôùi chaát khoâ. Coøn B. amyloquefaciens vaø B. licheniformis liquefying α-amylase ñaït DE 30 -35 vôùi 10% (w/w) glucoase vaø ñöôïc xeáp vaøo loaïi malto-oligosaccharide, Okada cho raèng lieân keát thích hôïp ñeå phaân caét giaûm khi chuoåi daøi taêng leân boán, theâm vaøo ñoù Vmax taêng töø G3 ñeán G4 vaø sau ñoù oån ñònh, nhöng Km giaûm vôùi chuoåi daøi. Ñieàu naøy coù theå ñöôïc giaûi thích baèng trung taâm hoaït ñoäng vôùi chæ 4 caáu töû, ñieåm phaân caét ñöôïc ñaët giöõa caáu töû thöù ba vaø thöù tö. Tuy nhieân, hoaït ñoäng cuûa enzyme thì phöùc taïp hôn nhieàu B. subtilis saccharifying α-amylase saûn xuaát ra nhöõng ñoaïn khaùc nhau töø caùc cô chaát nhaùnh hôn B. amyloliquefaciens liquefying α-amylase. Phaàn chính coøn laïi laø 63-α-D-glucosylmaltotriose, nhöng keøm theo saûn phaåm phuï vì B. subtilis saccharifying khoâng theå taán coâng vaøo lieân keát α(1,4) giöõa nhaùnh vaø vò trí cuoái hoaëc lieân keát α(1,4) maø phía coøn laïi cuûa glucose khaùc nhau ôû hai nhaùnh. Ñaëc bieät hôn, hoaït ñoäng cuûa enzyme treân tinh boät laø hoaït ñoäng treân phenylmaltoside. Coù leû ñaëc bieät laø moät enzyme noäi baøo coù theå taán coâng cô chaát ôû taát caû vò trí, nhöng keùo theo nhöõng ñoäng löïc hoïc phöùc taïp vaø thöïc teá raèng söï thay ñoåi caáu hình caùc ñoàng phaân khaùc nhau vôùi caùc cô chaát khaùc nhau vaø nhöõng ñieàu kieän caàn chuù yù. Thöù nhaát laø saccharifying α-amylase höùa heïn trong caùc phaûn öùng chuyeån ñoåi vôùi caû hai phenyl α-maltoside vaø phenyl β-maltoside, khi maltotriose ñöôïc hình thaønh vôùi caû hai cô chaát. ÔÛ noàng ñoä phenyl α-maltoside thaáp, phenol vaø maltose thì chieám öu theá trong saûn phaåm ; ôû noàng ñoä cao thì phenyl α-glucose vaø glucose ñöôïc hình thaønh chuû yeáu. Vôùi phenyl β-maltoside, chæ coù glucose vaø phenyl β-glucoside ñöôïc saûn xuaát. Maëc duø, söï hình thaønh cuûa phenol vaø maltose tuaân theo ñoäng hoïc cuûa Michaelis- Menten, saûn phaåm cuûa phenyl α-glucoside vaø glucose thì ôû daïng xích ma vôùi noàng ñoä cuûa phenyl α-maltose. Nhöõng hieän töôïng naøy coù theå ñöôïc giaûi thích laø enzyme coù caû vò trí hoaït ñoäng vaø vò trí hoaït hoaù. Vôùi hoãn hôïp maltose vaø phenyl α-glucoside thì xaûy ra hai tröôøng hôïp laø thuyû phaân vaø chuyeån hoaù. Maltose ñöôïc thuyû phaân tröïc tieáp tôùi glucose, hoaëc coäng theâm phenyl α-glucoside ñeå saûn xuaát phenyl α-maltoside vaø 45 glucose. B. subtilis g α-amylase chæ phaân caét tôùi maltose vaø phenol. Phenyl α-maltoside ôû noàng ñoä thaáp seõ thuyû phaân cho α-maltose, nhöng vôùi söï loâi keùo ñieän töû taïi vò trí para cuûa voøng benzen laø nguyeân nhaân taïo ra saûn phaåm β- maltose. Khi pH taêng töø pH toái thích 5.4, caû hai phenyl α-maltoside vaø p-tert- butylphenyl-α-maltoside ñeàu cho hoãn hôïp α-maltose vaø β-maltose. Gaàn ñaây, Frederick ñaõ quan saùt caáu hình hoaùn vò cuûa saûn phaåm thuyû phaân cuûa xylan baèng enzyme xylanase vôùi moâ hình hoaït ñoäng töông töï nhö α-amylase naøy. Khoâng bieát caùch taán coâng vaø chuyeån hoaù coù xaûy ra töông töï nhö hôïp chaát phenyl khoâng thì chöa ñöôïc bieát. Gioáng B. subtilis marburg cuõng saûn xuaát ra saccharifying α-amylase. Hieän töôïng ñieän chuyeån gel thì khaùc so vôùi chuaån enzyme saccharifying ñaõ thaûo luaän tröôùc ñaây, nhöng noù coù moái quan heä mieãn dòch hoïc vaø cuõng taán coâng vaøo p-nitrophenyl-α- maltoside. Vôùi söï ngoaïi leä laø chuoåi amino acid cuoái cuøng thì gioáng nhau. 4.2.5. Hieäu quaû thöông maïi vôùi Bacillus α-amylase Nhö ñaõ ñeà caäp tröôùc ñaây, caû hai B. amyloliquefaciens vaø B. licheniformis α- amylase ñöôïc söû duïng ôû giai ñoaïn ñaàu cuûa quaù trình chuyeån hoaù tinh boät thaønh siroâ coù haøm löôïng glucose cao. Sau naøy ñöôïc öùng trong quaù trình gelatin hoaù, noù coù ñuû khaû naêng oån ñònh vaø duy trì hoaït ñoäng ôû nhieät ñoä tinh boät bò hoà hoaù. Ñieàu kieän hoaït ñoäng cuûa hai enzyme naøy nhö sau: Vôùi B. amyloliquefacens α-amylase ôû giai ñoaïn ñaàu caàn taïo pH khoaûng 6.5 vaø nhieät ñoä 950C roài sau ñoù naáu trong noài aùp suaát ôû nhieät ñoä 1400C vaø tieáp theo laø dextrin hoaù ôû nhieät ñoä 850C vôùi nhieàu enzyme hôn. Vôùi B. licheniformis α-amylase ôû hai giai ñoaïn ñaàu coù khaû naêng naáu trong noài hôi ôû pH 6.5 vaø nhieät ñoä 1050C trong khoaûng 5 phuùt, caùc giai ñoaïn sau duy trì ôû pH 6.5 vaø nhieät ñoä 950C. Söï thuyû phaân saâu saéc vôùi α-amylase seõ mang laïi lôïi ích trong quaù khi saûn xuaát 46 siroâ coù haøm löôïng glucose cao baèng caùch keùo daøi quaù trình xöû lyù ôû 85 – 950C. Tuy nhieân, khoâng phaûi nhö theá khi taùc duïng keùo daøi trong giai ñoaïn pH ôû möùc ñoä ñaït ñeán trung tính seõ daãn söï hình thaønh saûn phaåm maltulose (4-α-D-glucopyranosyl-D- fructose), saûn phaåm naøy seõ tieáp tuïc bò thuyû phaân bôûi enzyme glucoamylase. Ñieàu naøy coù theå ñöôïc thaáy ôû hình 4 Maët khaùc, neáu saûn xuaát saûn phaåm siroâ coù haøm löôïng maltose cao baèng caùch ôû giai ñoaïn söû duïng α-amylase vaø tieáp theo sau laø söû duïng β-amylase, keùo daøi thôøi gian xöû lyù vôùi α-amylase ñeán moät möùc ñoä naøo ñoù laø moät ñieàu caàn laøm, bôûi vì β-amylase khoâng gioáng nhö glucoamylase, khoâng theå thuyû phaân lieân keát α(1,6) vaø vì theá sau khi keùo daøi quaù trình thuyû phaân dung dòch dextrin vôùi β-amylase thì nhöõng ñoaïn phaân töû lôùn seõ ñöôïc taïo thaønh chæ khi ñaõ ñöôïc α-amylase thuyû phaân moät ít. Quaù trình thuyû phaân tieáp tuïc sau khi β-amylase phaân caét seõ laøm taêng saûn phaåm coù phaân töû nhoû hôn. 4.2.6. Tieàm naêng öùng duïngcuûa enzyme α-amylase coá ñònh Coù raát nhieàu taøi lieäu ñeà caäp ñeán enzyme α-amylase coá ñònh, enzyme naøy khaù reû vaø raát oån ñònh. Ngoaøi nhöõng yeáu toá naøy, chuùng coøn coù taùc duïng raát maïnh ñeán caùc phaân töû cô chaát coù khoái löôïng lôùn vaø dung dòch coù ñoä nhôùt cao, vaø theå hieän ôû giai ñoaïn ñaàu cuûa quaù trình thuyû phaân tinh boät. Sau ñoù hoaït tính seõ giaûm nhanh choùng. Neáu enzyme α-amylase coá ñònh ñöôïc gaén treân coät thì thöôøng coù hieäu quaû trong saûn xuaát nhaát. 4.3. Saûn xuaáât dung dòch ñöôøng dextrose coù noàng ñoä cao 4.3.1.. Lôøi giôùi thieäu Glucoamylase [EC 3.2.1.3, α(1,4)-glucan glucohydrolase], maëc duø söï töông ñoàng cuûa caû teân thoâng thöôøng vaø teân heä thoáng cuûa caùc α-amylase, chuùng bao goàm nhieàu loaïi enzyme khaùc nhau. α-amylase laø moät endolydrolase taùc ñoäng leân caùc lieân keát α(1,4) glucosidic beân trong cuûa caùc phaân töû amylose vaø amylopectin, nhöng glucoamylase phaân caét caùc noái α(1,4) ñaëc bieät taïi caùc ñaàu khoâng khöû (nonreducing) cuûa caû tinh boät vaø caùc ñoaïn töø söï thuûy phaân bôûi α-amylase. Tuy nhieân, töông töï nhö α-amylase, noù coù hoaït tính maïnh treân caùc chuoãi daøi hôn chuoãi ngaén. Ngoaøi ra, glucoamylase coøn coù khaû naêng thuûy phaân lieân keát α(1,6) Khi coâng ngheä enzyme ñöôïc quan taâm, glucoamylase coøn khaù môùi meû, vöøa chæ ñöôïc khaùm phaù hôn 30 naêm. Vì theá noù chöa thoâng duïng. Tuy nhieân tính ñaëc tröng cuûa noù thì raát lôùn vaø caùc saûn phaåm glucose cuûa noù thì raát vöôït troäi caïnh tranh raát maïnh meõ vôùi saûn phaåm ñöôïc thuûy phaân baèng acid vaø nhanh choùng thích hôïp vôùi saûn xuaát dung dòch ñöôøng glucose noàng ñoä cao. Kieåu enzyme Nguoàn enzyme Teân goïi % Tinh boät bò thuûy phaân Hoaït löïc mantase Rhizopus delemar Rh.delemar Rh. delemar Asp. awamori Asp. niger - - Glucoamylase Glucoamylase Amylase “deebraanding” Amyloglucosidase Glucoamylase Amyloglucosidase 92 100 100 100 100 100 + + + + + Aspergillus niger Asp.usamii Rh.tonkinensis Asp.niger Asp.niger Asp.oryzae Asp.awamori Neurospora Monaseus γ-amylase “glucogenase” Amyloglucosidase Amyloglucosidase Taka-amylase Amylase-sacarogenase Amyloglucosidase amyloglucosidase 70 80 80 78 75 80 75 74 - + + + + + + +p Glucoamylase ñöôïc saûn xuaát bôûi soá löôïng lôùn cuûa naám vaø caùc loaøi ñoäng vaät; tuy nhieân chæ caùc glucoamylase cuûa Aspegillus vaø Rhizopus laø caùc cheá phaåm thöông maïi. Khi enzyme ñöôïc löïa choïn taïi Myõ, nôi maø phaàn lôùn caùc loaïi glucoamylase ñöôïc duøng caùc tính chaát cuûa Apergillus enzyme, vaø ñaëc bieät töø Aspergillus niger, seõ ñöôïc thaûo luaän sau ñaây. 4.3.2. Tính chaát phaân töû cuûa glucoamylase Ñeå hieåu roõ hôn glucoamylase hoaït ñoäng nhö theá naøo trong trong nghieäp caàn 47 48 phaûi hieåu moät soá chi tieát veà tính chaát phaân töû vaø ñoäng löïc hoïc cuûa noù. Nhieàu chuûng A.niger taïo ra hai glucoamylase isoenzyme chính. Vaø thoâng thöôøng thaáy caû hai trong caùc cheá phaåm thöông maïi (commercial preparation). Glucoamylase I coù ñieåm ñaúng ñieän thaáp hôn vaø ñöôïc taùch ra thöù hai trong coät saéc kyù chöùa DEAE-cellulose khi moät gradient pH giaûm ñöôïc aùp ñaët. Hai isoenzyme khaùc nhau veà chieàu daøi, glucoamylase I coù 616 amino acid vôùi phaân töû löôïng 66,000 (82,000 khi keát hôïp vôùi carbonhydrate) trong khi glucoamylase II coù cuøng trình töï amino acid nhöng thieáu moät maûnh C cuoái cuøng. Glucoamylase I coù nhieàu serine, threonine, aspartic acid, alanine, vaø glycine, coù ít methionine, histidine, cysteine, lysine, vaø arginine. Mannose, glucose vaø galactose ñöôïc noái chuû yeáu vôùi serine, vaø threonine trong moät vuøng cuûa 70 amino acid. Glucoamylase I oån ñònh gaáp 4 laàn glucoamylase II; vieäc loaïi boû carbonhydrate laøm giaûm caû hoaït tính vaø söï oån ñònh. C. Ñaëc tính cuûa glucoamylase Nhö ñaõ ñöôïc noùi treân, glucoamylase taán coâng di-, oligo-, vaø polysaccharide chöùa glucose, ñaëc bieät khi naèm giöõa lieân keát α(1,4). Glucoamylase cuõng taán coâng lieân keát bôûi α(1,6) vôùi tæ leä thaáp hôn. Caùc ñoaïn bò ñöùt laø cuûa caùc noái glucosic lieân keát anomeric carbon cuûa glucose cuoái cuøng taïi ñaàu khoâng khöû cuûa chuoãi vôùi oxygen, β- glucose meàm deûo vaø moät maûnh chöùa noù ít ñôn vò hôn chuoãi ban ñaàu. Caáu truùc naøy cuûa anomeric carbon bò thay ñoåi laø söï bieåu loä khaùc maø glucoamylase laø moät exo-hydrolase hôn laø moät glycoside glycohrolase; tuy nhieân noù khoâng phaûi laø moät ñaëc tính coâng nghieäp, khi söï bieán ñoåi luaân phieân laø quaù nhanh döôùi caùc ñieàu kieän saûn xuaát coâng nghieäp ñeå cho caùc phaûn öùng thaønh coâng, nhö laø vôùi glucose isomerase, ñaëc hieäu cho α-glucose, söï chaïm traùn laø moät hoãn hôïp caân baèng cuûa α- vaø β-glucose. Toác ñoä phaûn öùng gia taêng khi taêng chieàu daøi chuoãi vôùi khoaûng 5 ñôn vò, taïi ñoù toác ñoä laø khoaûng 5 laàn hôn so vôùi maltose. Ñieàu naøy cho thaáy roõ glucoamylase coù söï thu huùt cao vôùi caùc chuoãi daøi hôn, ñeå khoâng chæ laøm toác ñoä gia taêng maø coøn laøm haèng soá Michelis giaûm. Hiromi vaø nhoùm cuûa mình giaûi thích caùc hieän töôïng naøy ñöôïc gaây ra bôûi trung taâm hoaït ñoäng cuûa phaân töû glucoamylase chöùa moät soá vò thay theá coù khaû naêng baét giöõ glucose; moät soá chaát neàn coù theå coù theå cho pheùp gia taêng xaùc xuaát hình thaønh phöùc enzyme vaø cô chaát. Saûn xuaát glucose töø ñaàu khoâng khöû cuûa chuoãi hôn laø saûn xuaát caùc ñoaïn lôùn hôn hay söï phaân caét chuoãi, xaûy ra khi vò trí phaân caét cuûa enzyme naèm giöõa vò trí thay theá ñaàu tieân vaø thöù hai. Maëc duø söï taán coâng ñaàu tieân laø töø caùc lieân keát α(1,4) glucosic, glucoamylase cuõng coù hoaït tính taïi α(1,3) vaø, söû duïng cuøng trung taâm hoaït ñoäng. Ñoù laø hoaït tính khoa hoïc thuù vò trong coâng ngheä, sau khi α-amylase xöû lyù caùc lieân keát α(1,6) caùi maø phaûi ñöôïc phaân caét neáu hieäu suaát glucose coù theå chaáp nhaän ñaït ñöôïc. Nigerose (3-α- D-glucopyranosyl-D-glucose) vaø isomaltose (6-α-D-glucopyranosyl-D-glucose) bò thuûy phaân khoaûng 1% vaø tæ leä khoaûng 1-4% treân maltose, moät caùch tuaàn töï. Caùc chuoãi daøi chöùa caùc noái α(1,3) bò beõ gaõy vôùi cuøng tæ leä cuûa Nigerose. Vôùi caùc noái α(1,6), moät söï gia taêng chieàu daøi chuoãi seõ laøm taêng tæ leä thuûy phaân. Caùc ñoaïn chöùa hoãn hôïp caùc noái α(1,3), α(1,4), α(1,6), maø moät vaøi trong soá chuùng coù theå ñöôïc hình thaønh trong suoát quaù trình thuûy phaân tinh boät vaø dextrin baèng α-amylase vaø β-amylase, ñöôïc phaân caét baèng caùc tæ leä raát khaùc nhau sau ñoù. Ví duï, noái α(1,4) trong isopanose (I) bò beõ gaõy gaáp 2-3 laàn, trong 3-α-maltosylglucose (II) gaáp 1-2 laàn vaø trong 3-α- maltotriosylglucose (III) gaáp 5 laàn tæ leä cuûa maltose (caùc ñöôøng naèm ngang trong hình minh hoïa ñaïi dieän cho lieân keát α(1,4), caùc ñöôøng naèm ngang laø α(1,6), caùc ñöôøng naèm cheùo laø α(1,3), caùc voøng troøn laø glucose vaø caùc voøng troøn coù gaïch cheùo laø caùc glucose khöû) 49 50 Ba loaïi lieân keát naøy, cuøng vôùi 62-α-maltosylmaltose (IV), taïo ra ñoaïn chöùa moät lieân keát α(1,3) hay α(1,6), lieân keát α(1,4) taïi ñaàu khoâng khöû bò beõ gaõy, vaø caùc ñoaïn naøy coøn laïi tröø khi quaù trình thuûy phaân keùo daøi theâm. Noùi moät caùch khaùc, söï toàn taïi cuûa moät lieân keát α(1,3) hay α(1,6) taïi ñaàu khoâng khöû, nhö panose (V) vaø 63-α- glucosylmaltotriose (VI), taïo ra glucose raát nhanh khi caùc noái naøy bò phaân caét. Coù theå hy voïng raèng khi soá löôïng cuûa lieân keát α(1,4) trong chaát neàn gia taêng, ngay caû khi chaát neàn coù caùc kieåu noái khaùc, hieäu suaát cuûa quaù trình thuûy phaân seõ gia taêng, nhö ñaõ ñöôïc ghi nhaän bôûi söï gia taêng trong hieäu suaát thuûy phaân cuûa III treân II cuõng toát nhö V treân maltose. Ngay caû khi theâm vaøo moät glucose ñöôïc lieân keát bôûi nhieàu hôn moät α(1,4) coù theå laøm taêng hieäu suaát thuûy phaân, noái trong caû I vaø II bò beõ gaõy nhanh hôn laø laø chuùng coù trong maltose. Yeáu toá naøy laøm taêng saûn phaåm töø thuûy phaân bôûi a- amylase cuûa amylopectin chöùa caùc lieân keát α(1,6) raát nhaïy caûm khi bò beõ gaõy bôûi glucoamylase vôùi moät hieäu suaát toái thieåu coù theå chaáp nhaän ñöôïc. 4.3.3. Ñoäng löïc hoïc vaø söï caân baèng trong phaûn öùng ngöôïc Phaûi nhaát trí raèng glucoamylase tinh khieát, khoâng coù caùc enzyme khaùc, coù theå thuûy phaân α(1,6) vaø α(1,3), cuõng toát nhö lieân keát α(1,4), nhöng ngöôïc laïi, glucoamylase coù theå taïo ra caùc noái naøy thì khoâng ñöôïc coi laø toát. Tuy nhieân, khaùi nieäm veà söï ñaûo chieàu cöïc nhoû môùi ñöôïc chaáp nhaän gaàn ñaây vaø ñöôïc xem nhö moät söï caân baèng. Coù moät vaøi döõ kieän veà hieäu suaát hình thaønh caùc noái naøy vaø caùc giaù trò caân baèng cuûa caùc kieåu keát quaû, coù ñöôïc vôùi caùc maãu xem nhö ñoàng nhaát töông ñoái, hay taïi transferase-free toái thieåu, cuûa glucoamylase. Rhizopus niveus glucoamylase taïi 55oC vaø khoaûng chöøng pH 5 taïo ra 96% glucose, 1.3% nigerose vaø maltose, 2.2% isomaltose, vaø 0.5% oligosaccharide, haàu heát isomaltose vaø panose treân neàn taûng khoâ trong 96 giôø töø dung dòch ban ñaàu chöùa khoaûng 40% (w/v)glucose. Vôùi Endomyces glucoamylase vôùi cuøng ñieàu kieän, 3.1% isomaltose, 1.5% nigerose vaø maltose, 0.5% oligosaccharide, chuû yeáu laø isomaltotriose, panose, vaø maltotriose ñöôïc hình thaønh. Moät caùch khoâng roõ raøng laø söï caân baèng coù ñaït ñöôïc trong tröôøng naøy hay khoâng. Hehre et al., duøng R.niveus glucoamylase thuaàn khieát taïi 30oC vaø pH4.5, tìm thaáy raèng chæ β-glucose seõ baét ñaàu phaûn öùng ñaûo ngöôïc, ñieàu ñöôïc mong ñôïi, khi noù laø saûn phaåm cuûa phaûn öùng thuûy phaân ñöôïc xuùc taùc bôûi glucoamylase. Coù söï toång hôïp maltose nhanh choùng nhöng bò giôùi haïn, söï hình thaønh cuûa isomaltose thì chaäm nhöng nhieàu, vaø söï saûn xuaát nigerose vaø oligosaccharide trong 24 giôø thì chaäm vaø bò giôùi haïn. Khi maltose laø chaát neàn döôùi cuøng ñieàu kieän trong moät thí nghieäm 15 phuùt, maltotriose vaø panose, khoâng coù isomaltose ñöôïc tìm thaáy cuøng vôùi glucose. Moät haèng soá caân baèng cho maltose ñaõ ñöôïc xaùc ñònh: [maltose].[H2O] KMaltose = [β-glucopyranose].[glucose] 51 Paxur et al., baèng A.niger glucoamylase ñöôïc tinh saïch baèng DEAE-cellulose, nhöng khoâng ghi roõ loaïi isoenzyme naøo, nhaän thaáy raèng 30% (w/w) glucose taïi pH3.5 vaø nhieät ñoä phoøng taïo ra hôn 1% söï ñaûo ngöôïc thaønh moãi nigerose vaø isomaltose sau 96 giôø, saûn phaåm ñöôïc hình thaønh raát nhanh. Khoâng coù söï hình thaønh maltose. Vôùi khoaûng 30% (w/v) maltose taïi pH 4.8 vaø nhieät ñoä phoøng, 1.3% chaát neàn seõ taïo thaønh isomaltose vaø 0.7% thaønh panose sau 24 giôø, moät soá lôùn chuyeån thaønh glucose. Trong tröôøng hôïp khaùc, ñaït ñöôïc söï caân baèng. Roels and van Tilburg, söû duïng A.niger glucoamylase thöông maïi, nhieàu free of transferase, nhöng haàu nhö chöùa caû 2 loaïi isoenzyme, ño löôøng söï caân baèng vaø ñoäng löïc hoïc cuûa söï ñaûo ngöôïc glucose vaø cuûa phaûn öùng thuûy phaân DE 15 dextrin taïi pH4.5 vôùi caùc noàng ñoä khaùc nhau (10-40%) vaø caùc nhieät ñoä khaùc nhau (45-65oC). Söï caân baèng cuûa maltose vaø isomaltose laø khoâng ñaùng keå vôùi chaát neàn hay vôùi nhieät ñoä. Caàn phaûi thöøa nhaän raèng taïi caùc ñieàu kieän naøy β-glucopyranose chieám 63% toång soá glucose, ñoù laø: 52 [maltose].[H2O] Kmaltose = = 0.45 [β-glucopyranose].[glucose] [isomaltose].[H2O] Kmaltose = = 2.6 [β-glucopyranose].[glucose] Söï coù maët cuûa nigerose vaø oligosaccharide khoâng ñöôïc ghi nhaän. Ñoäng löïc hoïc cuûa söï hình thaønh maltose vaø isomaltose töø glucose ñöôïc moâ hình baèng vieäc duøng giôùi haïn thöù hai (second-order terms) vaø haèng soá caân baèng vöøa thu ñöôïc vaø caùc döõ lieäu thí nghieäm phuø hôïp coù lieân quan. Gia taêng nhieät ñoä vaø noàng ñoä glucose laøm taêng hieäu suaát hình thaønh maltose vaø isomaltose, maltose ñöôïc hình thaønh nhanh nhöng ôû möùc ñoä thaáp hôn isomaltose. Baøi thuyeát trình thöù hai töø cuøng phoøng thí nghieäm cho thaáy nhieàu moâ hình hoaøn chænh cho söï caân baèng giöõa glucose vaø di-, oligosaccharide chöùa lieân keát α(1,4) vaø α(1,6) vaø töø caùc ghi nhaän tröôùc ñoù raèng enthalpy töï do cuûa söï thuûy phaân maltose taïi 60oC vaø ñôn vò noàng ñoä cuûa phaûn öùng laø -3500 J/mol, nhöng ñôn vò noàng ñoä cuûa phaûn öùng cuûa isomaltose laø 1400 J/mol. Coù hai döõ lieäu choïn loïc raèng ñieån hình toát nhaát cuûa söï taùc ñoäng cuûa phaûn öùng 53 54 chuyeån ñoåi laø khi glucoamylase thuûy phaân dextrin. Lee et al. söû duïng glucoamylase coá ñònh vaø tan ñöôïc ñeå beû gaõy caùc dextrin cuûa caùc DE khaùc nhau taïi caùc nhieät ñoä khaùc nhau. Vôùi DE ban ñaàu thaáp, seõ ñaït ñöôïc DE cao toái ña do bôûi giaûm soá löôïng caùc saûn phaåm phuï ñöôïc hình thaønh khi tinh boät bò thuûy phaân caùc dextrin DE thaáp. Caùc disaccharide baét ñaàu gia taêng tröôùc khi DE toái ña ñöôïc ñaït ñeán cuøng luùc vôùi söï taêng chaäm caùc trisaccharide. Vieäc gia taêng nhieät ñoä laøm giaûm nheï DE toái ña, nhöng noù laøm taêng toác ñoä thuûy phaân vaø söï tích luõy ñoät ngoät caùc saûn phaåm phuï. Thaät khoâng deã ñeå nhaát trí vôùi caùc phaùt hieän khaùc nhau naøy. Roels vaø van Tilburg khoâng tìm ra nigerose baèng caùc phöông phaùp maø hoï söû duïng, saéc kyù loûng cao aùp (HPLC) vôùi coät Waters carbonhydrate khoâng ñuû khaû naêng ñeå taùch nigerose khoûi maltose. Hoï ñaõ tìm ra caùc oligosaccharide nhöng khoâng baùo caùo chuùng. Söï vaéng maët cuûa maltose trong baùo caùo cuûa Pazur et al. coù theå bò taïo thaønh bôûi pH thaáp (pH3.5), so saùnh vôùi pH 4.5~5.0. Khi isomaltose ñöôïc hình thaønh moät caùch chaäm chaïp töø glucose. Hehre et al. coù theå tìm ra chuùng trong thí nghieäm 15 phuùt maø söû duïng maltose nhö moät cô chaát bôûi vì khoâng ñuû thôøi gian ñeå noù ñöôïc hình thaønh. Neáu haèng soá caân baèng ñöôïc baùo caùo bôûi Roels vaø van Tilburg laø baát bieán khi nhieät ñoä haï xuoáng 30oC ñöôïc thöïc hieän bôûi Hehre et al. moät noàng ñoä maltose cho keát quaû raèng laø 3 laàn lôùn hôn ñaït ñöôïc vôùi haèng soá caân baèng gaàn ñaây nhaát. Ñieàu naøy cho thaáy raèng taát caû maltose vaø nigerose bôûi caùc vaán ñeà tröôùc ñaõ taïo ra caùc sai laàm ñaùng keå. Döõ lieäu caân baèng cuûa Hehre et al. veà söï hình thaønh cuûa maltose vaø nöôùc töø glucose vaø β-glucose daãn tôùi moät naêng löôïng töï do tieâu chuaån 5000 J/mol. Ñieàu naøy raát gaàn guõi vôùi enthalpy chuaån cho söï hình thaønh maltose vaø nöôùc töø glucose (4585 J/mol taïi 25oC vaø 4750 J/mol taïi 35oC) vaø enthalpy chuaån ñeå hình thaønh 1 lieân keát trung bình α(1,4) trong amylose (4300 J/mol). Nhö ñaõ ñeà caäp tröôùc ñoù, van Beynum et al naêng löôïng töï do tieâu chuaån cuûa thuûy phaân isomaltose thaønh glucose laø 1400 J/mol. Isomaltose vaø nöôùc töø β-glucose vaø glucose thì naêng löôïng töï do laø -2650 J/mol. Ñoù laø khoaûng enthalpy chuaån ñeå hình 55 thaønh α(1,4) trong isomaltose (-5430 J/mol) hay hình thaønh lieân keát naøy trong panose (-5180 J/mol) vaø giaù trò gaàn tôùi zero bôûi söï thieáu nhieät ñoä phuï thuoäc ñöôïc tìm ra cho phaûn öùng bôûi Roels va van Tilburg. Nhö ñaõ löu yù, moät trong caùc khoù khaên trong nghieân cöùu caùc phaûn öùng ngöôïc laø söï baát löïc cuûa caùc phöông phaùp saéc kyù thoâng duïng ñeå coù theå phaân taùch disaccharide, maltose, nigerose; roõ raøng, vaán ñeà vôùi trisaccharide vaø caùc phaân töû lôùn hôn laø khoù khaên. Söï khoù khaên naøy laø hieån nhieân ñoái vôùi caû Watanabe et al. vaø Roels vaø van Tiburg, vaø caû Pazur et al. Söï tieán boäđgaàn ñaây nhaát bôû Nikolov vaø Reilly höùa heïn cho pheùp coù ñöôïc ñoä chính xaùc cao trong vieäc ño löôøng maltose, nigerose, vaø isomaltose vôùi caùc noàng ñoä khaùc nhau. Hoï coù theå phaân taùch hoaøn toaøn 6 loaïi anomeric cuûa 3 disaccharide, sau trimethylsilylation, baèng saéc kyù loûng-khí (GLC) ôû 240oC bôûi coät mao quaûn silica SE-54. 4.3.4. Söû duïng glucoamylase trong coâng nghieäp Vieäc duøng glucoamylase trong coâng nghieäp saûn xuaát dòch ñöôøng DE cao laø raát hieän thöïc. Maëc duø caùc coâng ty vôùi caùc qui trình khaùc nhau, nhöng thöôøng laø duøng glucoamylase A.niger ñeå thuûy phaân dòch dextrin 30-40% (w/w) vaø DE 10-15 taïi pH4.0-4.50. Phaûn öùng dieãn ra trong boàn coù khuaáy 60oC ñeå DE ñaït toái ña sau 48-72 giôø. Roõ raøng DE laø cao, vaø moät soá löôïng lôùn cuûa fructose coù theå ñöôïc hình thaønh bôûi böôùc ñoàng phaân hoùa tieáp theo bò thuûy phaân bôûi isomerase. Khoâng khoù khaên ñeå ñaït DE 96, töôïng tröng cho dòch 94% glucose trong khoái löôïng khoâ, cuøng vôùi khoaûng 3% disaccharide, 3% maltulose vaø caùc oligosaccharide khaùc. Coù theå ñaït ñöôïc giaù tri DE cao ñaùng keå baèng caùch giaûm haøm löôïng chaát raén hay baèng moät enzyme beû nhaùnh nhö isoamylase hay pullulanase. Söï löïa choïn ñaàu tieân laø khoâng phuø hôïp, khi nöôùc ñöôïc theâm vaøo ñeå hoøa tan chaát raén phaûi ñöôïc laøm bay hôi ñeå taïo haøm löôïng glucose hay fructose cao, vaø glucoamylase thì keùm oån ñònh taïi noàng ñoä chaát raén thaáp vaø hoãn hôïp naøy thì raát deã nhieãm khuaån. Löïa choïn thöù hai seõ ñöôïc thaûo luaän sau ñaây, sau khi chuùng ta xem xeùt khaû naêng trong coâng nghieäp cuûa glucoamylyse coá ñònh. 56 4.3.5. Tieàm naêng söû duïng Glucoamylase coá ñònh Coù raát nhieàu lyù do ñeå duøng enzyme coá ñònh trong caùc phaûn öùng vôùi tính thöông maïi. Ñaàu tieân, giaù enzyme giaû. Vieäc coá ñònh cho pheùp ñaït khaû naêng saûn xuaát cao. Thöù hai, trong moät soá tröôøng hôïp, enzyme ñöôïc oån ñònh khi coá ñònh. Thöù ba, moät enzyme coá ñònh coù giaù trò trong coâng ngheä trong moät heä thoáng lieân tuïc vôùi theå tích nhoû. Ñieàu naøy coøn toát hôn nöõa trong heä thoáng theo meû (hay heä thoáng lieân tuïc vôùi theå tích lôùn) maø thöôøng laø duøng enzyme hoøa tan. Caùc yeáu toá naøy ñoùng vai troø quan troïng khi quyeát ñònh duøng enzyme hoøa tan hay enzyme coá ñònh. Coù leõ moät soá lôùn taøi lieäu veà khaû naêng trong coâng nghieäp cuûa glucoamylase coá ñònh. Hoï gaén caùc glucoamylase vaøo caùc silica alkylamine xoáp vôùi glutaraldehyde ñeå coù moät hoaït löïc 2500-3000 IU /g, vôù 1 IU coù hoaït löïc taïo 1µmol glucose trong 1 phuùt töø dextrin taïi pH4.5 ôû 60oC. Ñieàu naøy cuõng ñuû ñeå ñaït söï chuyeån hoùa toái ña sau 15-20 phuùt trong 1 bình phaûn öùng lieân tuïc, ít hôn so vôùi saûn xuaát theo meû vôùi enzyme hoøa tan vaø cuõng coù hieäu quaû kinh teá hôn. Haàu nhö trong taát caû caùc tröôøng hôïp, naêng löôïng hoaït hoùa cho hoaït ñoäng cuûa enzyme thì thaáp hôn cho söï phaân raõ enzyme. Raát thuaän tieän khi duøng enzyme coá ñònh taïi caùc nhieät ñoä thaáp hôn khi duøng caùc enzyme hoøa tan. Khi giaûm nhieät ñoä seõ khoâng laøm giaûm hoaït tính nhöng laïi laøm taêng tính oån ñònh. Ñieàu naøy laø quan troïng vôùi enzyme coá ñònh khi phaûi söû duïng haøng tuaàn hay haøng thaùng ñeå coù ñöôïc hieäu quaû kinh teá. Vôùi enzyme hoøa tan thì chæ duøng cho moät meû duy nhaát. Vôùi enzyme coá ñònh, nhieät ñoä söû duïng laø 38-40oC thay vì thöôøng laø 60oC cho enzyme hoøa tan, vaø khoâng bò maát ñi trong quaù trình söû duïng. Vieäc nhieãm khuaån ñöôïc kieåm soaùt baèng caùch röûa vôùi dung dòch chloroform baõo hoøa. Khaùc bieät giöõa enzyme coá ñònh vaø hoøa tan laø söï aûnh höôûng cuûa khaû naêng khuyeách taùn. Caû intraparticle vaø interparticle. 57 4.4. Söû duïng isoamylase vaø pullulanase ñeå khöû nhaùnh 4.4.1. Giôùi thieäu Söï coù maët cuûa caùc lieân keát α(1,6) trong caùc maïch nhaùnh cuûa tinh boät gaây neân nhieàu khoù khaên trong vieäc saûn xuaát dung dòch glucose vaø maltose noàng ñoä cao. Glucoamylase coù theå caét noái α(1,6) nhöng khaù chaäm vaø coù theå taùi taïo laïi chuùng cuøng vôùi caùc noái α(1,3). Coù hai enzyme duøng trong saûn xuaát ñöôøng maltose noàng ñoä cao laø α-amylase vaø β-amylase töø naám moác. Hai enzyme naøy khoâng taùc duïng leân α(1,6). Keát quaû laø khoâng ñaït hieäu suaát taïo glucose toái ña. Caùc phaûn öùng nghòch ñöôïc xuùc taùc bôûi glucoamylase luoân xaûy ra taïi caùc maïch nhaùnh baét ñaàu töø noái α(1,6) cuûa amylopectin vaø caùc dextrin maïch ngaén. Caùc amylopectin vaø dextrin maïch ngaén naøy coøn laïi sau khi α-amylase vaø β-amylase töø naám moác thuûy phaân caùc noái α(1,4). Coù theå giaûi quyeát caùc vaán ñeà naøy baèng söï thuûy phaân noái α(1,6). Cuøng vôùi glucoamylase, noàng ñoä cao nhaát cuûa glucose coù theå ñaït tôùi tröôùc khi phaûn öùng nghòch ñaûo (taát yeáu) xaûy ra vaø saûn phaåm cuûa phaûn öùng naøy trôû neân nhieàu hôn. Veà maët lyù thuyeát, α-amylase vaø β-amylase naám moác chuyeån hoùa thaønh maltose hoaøn toaøn . Vôùi glucoamylase thì hai enzyme thuûy phaân laø pullulanase vaø isoamylase seõ ñoùng vaøi troø chính trong vieäc naøy. Vôùi 1 trong 2 enzym saûn xuaát maltose, glucoamylase coù theå ñöôïc theâm vaøo ñeå saûn xuaát dòch ñöôøng DE 62. vôùi yeâu caàu noàng ñoä maltose cao hôn thì pullulanase hay isoamylase coù theå ñöôïc theâm vaøo ñeå chuyeån maltose thaønh glucose khi noù caét noái α(1,6). Trong phaàn naøy, ta seõ tìm hieåu tính chaát cuûa 2 enzyme thuûy phaân khöû nhaùnh cuõng nhö vieäc söû duïng chuùng ñeå gia taêng hieäu suaát taïo glucose khi keát hôïp vôùi glucoamylase. 4.4.2. Tính chaát cuûa phaân töû isoamylase vaø pullulanase Isoamylase [EC 3.2.1.68, glucogen 6-glucanohydrolase], ñöôïc taïo bôûi Pseudomonas coù M = 90 000 (139 140) ñöôïc hình thaønh töø 2 tieåu ñôn vò vôùi kích thöôùc baèng ½ phaân töû isoamylase. Isoamylase khoâng coù caàu disulfide hay caùc cofactor kim loaïi, khoâng coù sulfhydryl hay caùc nhoùm carboxyl. Coù hoaït tính cao nhaát taïi pH3-4 vaø tính oån ñònh cao nhaát ôû pH4-4.5. Hoaït tính cao nhaát laø sau 1 giôø tai 50-55oC. Pullulanase [EC 3.2.1.41 pullulan 6-glucoanohydrolase] laø moät loaïi enzyme gaàn ñaây môùi ñöôïc theâm vaøo ñeå oån ñònh caùc enzyme tinh boät. Coù nhieàu nguoàn taïo pullulanase: Escherichia intermedia, Streptococcus mitis, Streptomyces, Bacillus. Tuy nhieân, cuõng nhö isoamylase, pullulanase taïo bôûi Klebsiella aerogenes laø chuû ñeà cuûa nhieàu nghieân cöùu. K.aerogenes pullulanase coù hoaït tính cao nhaát ôû khoaûng pH5.5-6.5 trong voøng 1 giôø taïi 50oC vaø söï oån ñònh cuûa noù keùo daøi ñeán khoaûng pH kieàm. 4.2.3. Tính chaát cuûa isoamylase vaø pullulanase Hai enzyme naøy coù hoaït tính treân cuøng moät loaïi noái vaø thöïc hieän cuøng moät chöùc naêng. Caùch roõ nhaát ñeå phaân bieät chuùng laø pullulanase taùc duïng maïnh leân pullulan, coù hoaït tính treân amylopectin vaø caùc dextrin maïch ngaén vaø ít coù taùc duïng leân glycogen. Isoamylase thì ngöôïc laïi, haàu nhö khoâng coù hoaït tính treân pullulan, coù hoaït tính treân amylopectin vaø moät soá dextrin maïch ngaén, coù hoaït tính maïnh vôùi glycogen. Isoamylase coù Vmax treân pullulan laø ≤1%, Km cuûa pullulane cao gaáp 20 laàn so vôùi hoaït tính treân amylopectin khaùc nhau vaø vôùi caùc glycogen. Pullulanase coù Vmax treân pullulan >10 laàn so vôùi Vmax treân amylopectin vaø glycogen; Km treân amylopectin vaø glycogen cao gaáp haøng traêm laàn so vôùi Km treân pullulan. Vieäc giaûm amylopectin hay glycogen thaønh caùc dextrin maïch ngaén bôûi α−amylase hay β-amylase taïo hieäu quaû cao trong vieäc gia taêng tæ leä pullulanase taán coâng hôn laø isoamylase. Khi nguyeân lieäu vôùi caùc noái α(1,4) laø chuû yeáu bò caét bôûi α-amylase hay β-amylase hay glucoamylase, chuùng ta caàn hieåu hieäu quaû cuûa isoamylase vaø pullulanase khi caét caùc noái α(1,6) coøn laïi. Caùc pullulanase coù öu theá taán coâng leân caùc phaân töû nhoû toát hôn isoamylase. Tuy nhieân, maëc duø pullulanase coù theå caét caùc noái α(1,6) treân caùc ñoaïn nhoû nhö 62-α-maltosylmaltose (I) vaø coù hoaït tính nhö theá treân pullulan cuûa cô chaát vôùi ½ maltotriosyl vaø coù toái thieåu 2 glucose khöû treân maïch nhaùnh, isoamylase coù hoaït tính treân chuùng yeáu hôn so vôùi treân amylopectin hay glycogen vôùi caùc maïnh nhaùnh nhoû. 58 I II III Chæ coù pentaose coù theå taán coâng vôùi moät vaän toác thaáy roõ nhö ôû II, vaø coù öu theá hôn laø pullulanase taán coâng treân maïch nhaùnh coù toái thieåu laø glucose thöù 3 töø ñaàu khöû cuûa chuoãi coù noái α(1,4). 59 Coù moät soá yù kieán khoâng ñoàng nhaát veà hình thöùc hoaït ñoäng cuûa 2 enzyme naøy, nhöng ñeàu thoáng nhaát laø chuùng ñeàu gaén vaø taán coâng vaøo beân trong maïch. Vôùi pullulanase, khi söû duïng pullulan laøm cô chaát, ñieàu naøy ñöôïc xaùc ñònh bôûi söï giaûm nhanh choùng ñoä nhôùt cuøng luùc vôùi söï hình thaønh maltotriose. Tuy nhieân, vôùi caùc polysaccharide ngaãu nhieân nhö amylopectin vaø glycogen, söï taán coâng döôøng nhö theo moät traät töï, khi caùc enzyme thuûy phaân coù theå coù khoù khaên ôû beân trong phaân töû. Söï kieän naøy coù theå xuaát hieän trong suoát phaûn öùng cuûa isoamylase leân glycogen hay cuûa pullulanase leân caû glycogen vaø amylopectin. Pullulanase vaø coù leõ laø caû isoamylase seõ phaûn öùng vôùi caùc polysaccharide khaùc nhau moät caùch ngaãu nhieân tuyø theo töøng chuoãi ña daïng hôn laø moät söï ña daïng trong cô cheá taán coâng. 4.2.4. Caùch söû duïng isoamylase vaø pullulanase cuøng vôùi glucoamylase Caùc enzyme khöû nhaùnh nhö 2 enzyme naøy coù theå laøm gia taêng noàng ñoä glucose trong suoát quaù trình thuûy phaân dextrin bôûi glucoamylase baèng caùch hoã trôï glucoamylase ñeå beû gaõy caùc noái α(1,6). Do ñoù, sau naøy, coù theå thuûy phaân moät caùch nhanh choùng α(1,4) tröôùc khi phaûn öùng nghòch ñaûo trôû neân nghieâm troïng. Trong khi löïa choïn 2 enzyme phaûi bieát kích thöôùc trung bình cuûa phaân töû maïch nhaùnh trong nguyeân lieäu töø söï thuûy phaân bôûi α-amylase. Neáu laø caùc phaân töû lôùn thì isoamylase coù öu theá vaø seõ maïnh hôn treân caùc phaân töû amylopectin vaø coù hoaït tính maõnh lieät vôùi caùc β-dextrin maïch ngaén töø amylopectin. Treân caùc ñoaïn nhoû hôn thì pullulanase seõ coù hoaït tính toát hôn isoamylase. 4.2.5. β-amylase (α-1,4-glucan-mantohidrolase 3.2.1.2). β-amylase xuùc taùc söï thuûy phaân caùc lieân keát α-1,4 glucan trong tinh boät, glucogen vaø polysaccharide ñoàng loaïi, phaân caét tuaàn töï töøng goác maltose moät töø ñaàu khoâng khöû cuûa maïch. Maltose taïo thaønh coù caáu hình β, vì theá amylase naøy ñöôïc goïi laø β- amylase. Theo caùc ñaëc tính taùc duïng leân tinh boät, β-amylase khaùc α−amylase ôû moät soá ñieåm: haàu nhö khoâng thuûy phaân haït tinh boät nguyeân laønh maø thuûy phaân maïnh meõ hoà tinh boät. β-amylase phaân giaûi 100% amylose thaønh maltose vaø phaân giaûi 54-58% amylopectin thaønh maltose. Quaù trình thuûy phaân amylopectin ñöôïc tieán haønh töø ñaàu khoâng khöû cuûa caùc nhaùnh ngoaøi cuøng. Moãi nhaùnh ngoaøi coù töø 20-26 goác glucose neân taïo thaønh ñöôïc 10-12 phaân töû maltose. Khi gaëp lieân keát 1,4-glucoside ñöùng keá caän lieân keát α-1,6-glucoside thì β-amylase ngöøng taùc duïng. Phaàn saccharide coøn laïi laø dextrin phaân töû lôùn coù chöùa nhieàu lieân keá α-1,6-glucoside vaø ñöôïc goïi laø β dextrin, α dextrin cho maøu tím ñoû vôùi iode. Ñoä nhôùt cuûa dung dòch giaûm chaäm. Taùc duïng cuûa β-amylase leân tinh boät coù theå bieåu dieãn baèng sô ñoà sau: β-amylase Tinh boät 54-58% maltose + 42-46% β dextrin (Glucogen) Neáu cho caû α-amylase vaø β-amylase cuøng ñoàng thôøi taùc duïng leân tinh boät thì tinh boät bò thuûy phaân tôùi 95%. β-amylase laø moät albumin. Taâm xuùc taùc cuûa noù coù chöùa nhoùm –SH vaø –COOH cuøng vôùi voøng imidazol cuûa caùc goác histidin. β-amylase laø enzyme ngoaïi phaân (exoenzyme), coù aùi löïc vôùi caùc lieân keát 1,4-glucoside caùc ñaàu khoâng khöû cuûa maïch moät lieân keát α−1,4. Khaùc vôùi α-amylase, noù raát beàn khi khoâng coù Ca2+, β-amylase bò kìm haõm bôûi Cu2+, Hg2+, urea, iodoacetamide, iodine, ozon…pH toái thích trong dung dòch tinh boät thuaàn khieát cuûa β-amylase laø 4.6 coøn trong dung dòch naáu (khoâng soâi) laø 5.6. Nhieät ñoä toái thích trong dung dòch tinh boät thuaàn khieát 40-50oC, song trong dòch naáu laïi laø 60- 65oC, β-amylase bò voâ hoaït ôû nhieät ñoä 70oC. β-amylase chæ phoå bieán trong theá giôùi thöïc vaät, ñaët bieät coù nhieàu trong caùc haït naûy maàm. Trong vi khuaån khoâng coù β- amylase amylase. Coøn söï toàn taïi cuûa β-amylase trong naám sôïi cho ñeán naøy vaãn chöa ñöôïc chöùng minh hoaøn toaøn. 4.2.6. Oligo-1,6-glucosilase hay dextrinnase tôùi haïn (dextrin-6-glucanhydrolase, 3.2.1.10) Enzyme naøy thuûy phaân caùc loaïi lieân keát trong izomaltose, panose vaø caùc 60 61 dextrin tôùi haïn vaø coù theå chuyeån hoùa caùc cô chaát naøy ñeán caùc ñöôøng leân men ñöôïc. Caùc loaøi naám sôïi Asp.awamori, Asp.oryzae, Asp.usamii sinh toång hôïp enzyme naøy maïnh hôn caû. Coù taùc giaû thu ñöôïc enzyme naøy ôû daïng keát tinh nhöng söï toàn taïi cuûa noù vaãn chöa ñöôïc chöùng minh trieät ñeå. Enzyme naøy cuõng coù trong haït naûy maàm (ñaïi maïch naûy maàm vaø thoùc naûy maàm). Ngoaøi oligo-1.6-glucosidase ra, heä dextrinase cuûa haït coác naûy maàm, cuûa moâ ñoäng vaät vaø naám men, coøn coù chöùa amylopectin-6-glucosidase hay R-enzyme (amilopectin-6-glucanhydrolase, 3.2.1.9) vaø dextrin-1,6-glucosidase hay amylo-1,6-glucosidase (dextrin-6-glucanhydrolase, 3.2.1.33), caû hai enzyme naøy ñeà phaân caét caùc lieâh keát α−1,6 glucoside trong amylopectin, glucogen vaø dextrin tôùi haïn. Chuùng thuûy phaân dextrin saâu saéc hôn α ,β-amylase, do vaäy maø maltose ñöôïc tích tuï nhieàu trong dòch thuûy phaân. Caùc dextrinase hoaït ñoäng toái thích ôû nhieät ñoä 40oC vaø pH 5.1. 4.2.7. α−glucosidase hay maltase (α−D, glucoside-glucohydrolase, 3.2.1.20) Nhieàu loaøi naám sôïi saûn sinh enzyme naøy, gioáng nhö glucoamylase, noù thuûy phaân maltose thaønh glucose, nhöng khoâng thuûy phaân tinh boät, moät soá taùc giaû cho raèng noù coù hoaït tính glucosyltransferase, töùc laø coù khaû naêng chuyeån caùc goác glucosyl sang ñöôøng vaø röôïu. Khi nghieân cöùu caën keõ veà tính chaát cuûa caùc maltase taùch töø canh tröôøng beà maët cuûa Asp.oryzae, caùc nhaø nghieân cöùu Nhaät cho bieát raèng maltase vaø glucozyltransferase laø moät enzyme ñoàng nhaát vöøa coù khaû naêng thuûy phaân lieân keát α−1,4 trong caùc glucopiranoside vöøa coù khaû naêng chuyeån caùc goác glucosyl sang ñöôøng vaø röôïu. 4.2.8. Transglucosyldase (α-1,4-glycan:D-glucose-4-glucoziltransferase, 2.4.1.3) Ôû nhieàu loaøi naám sôïi Aspergillus, transglucosyldase luoân luoân töông taùc vôùi glucoamylase. Noù coù caû hoaït tính transferase laãn hoaït tính thuûy phaân. Vì theá söï coù maët cuûa noù trong dung dòch thöôøng gaây neân nhöõng nhaàm laãn veà söï toàn taïi cuûa glucoamylase. Transglucosyldase thöïc hieän vieäc chuyeån caùc goác glucosyl sang caùc nhoùm mono, di vaø oligosaccharide, xuùc taùc taïo thaønh caùc lieân keát α-1,4 vaø α-1,6 glucoside. Transglucosyldase khoâng nhöõng chæ thuûy phaân maltose thaønh glucose maø 62 coøn toång hôïp isomaltose, isotriose vaø panose, töùc laø coù khaû naêng chuyeån goác glucose vaø gaén noù vaøo phaân töû maltose hoaëc phaân töû glucose khaùc nhau baèng lieân keát α-1,6 ñeå taïo thaønh panose hoaëc isomaltose. Rodzevit vaø Butova (1965) tìm thaáy trong canh tröôøng naám sôïi Asp.niger, Asp.oryzae, Asp.awamori coù glucosyltransferase, ñoàng thôøi cho bieát raèng enzyme naøy xuùc taùc toång hôïp caùc oligosaccharide vôùi caùc lieân keát α-1,4 vaø α-1,6 töø maltose. Caùc taùc giaû cho raèng, trong caùc VSV treân coù hai heä transglucosidase. Moät heä toång hôïp caùc saûn phaåm coù lieân keát α-1,4 glucoside kieåu maltose vaø chuyeån caùc goác glucose töø maltose tôùi vò trí C4 cuûa goác glucose cuoái: n-maltose-(1,4- α−glucose)n + n-glucose. Heä thöù nhaát beàn ôû pH 8.5 coøn heä thöù hai thì voâ hoaït hoaøn toaøn ôû pH naøy trong hai giôø. Ôû pH 3.3 trong thôøi gian moät giôø, hoaït löïc transglucosidase cuûa caû hai heä ñeàu khoâng ñoåi. Transglucosyldase cuûa naám sôïi bò voâ hoaït hoaøn toaøn ôû pH = 1.9-2.0 sau 24 giôø. Caùc chuûng naám sôïi khaùc nhau thì khaùc bieät nhau veà hoaït löïc transglucosylase. Caùc loaøi Rhizopus coù öu theá hôn caùc loaøi Aspergillus laø khoâng taïo transglucosylase. Söï coù maët cuûa transglucosylase trong caùc cheá phaåm amylase (duøng trong coâng nghieäp maät tinh boät, ñöôøng glucose, coâng nghieäp röôïu…) laø ñieàu khoâng mong muoán. Glucoamylase xuùc tieán söï thuûy phaân tinh boät, coøn transglucosylase laïi toång hôïp isosaccharide töø caùc saûn phaåm thuûy phaân naøy, do ñoù maø noù laøm giaûm bôùt möùc ñoä thuûy phaân saâu saéc tinh boät vaø laøm cho dòch thuûy phaân coù vò ñaéng. 5. THÍ DUÏ VEÀ VIEÄC SÖÛ DUÏNG HEÄ ENZYME AMYLASE TRONG SAÛN XUAÁT COÂNG NGHIEÄP DUNG DÒCH ÑÖÔØNG COÙ NOÀNG ÑOÄ CAO (LAØM NGUYEÂN LIEÄU CHUAÅN BÒ CHO CAÙC QUAÙ TRÌNH LEÂN MEN TIEÁP SAU) SÔ ÑOÀ QUI TRÌNH SAÛN XUAÁT COÂNG NGHIEÄP DUNG DÒCH GLUCOSE NOÀNG ÑOÄ CAO TÖØ TINH BOÄT MÌ Boät mì daïng öôùt / khoâ Hoøa troän vôùi nöôùc Loïc (loaïi boû caùc chaát raén taïp) Phoái troän enzyme a-amylase theo tæ leä thích hôïp 63 d=~1.2 DS=~33.5% (w/v) Khuaáy troän lieân tuïc Chænh ph5.8 (NaOH) 95oC (hôi nöôùc 125oc) 64 Boàn phaûn öùng dòch hoùa Löu trong oáng löu nhieät trong khoaûng thôøi gian thích hôïp Chænh ph 4.4 (H2SO4) Phoái troän enzyme glucoamylase theo moät tæ leä thích hôïp Löu trong boàn chöùa trong khoaûng thôøi gian thích hôïp Dòch glucose noàng ñoä cao (glucose/caùc DP ≥ 96%) %DP 0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0.09 0.11 0.13 0.17 0.07 0.11 0.13 0.17 0.07 0.09 0.13 0.17 0.07 0.09 0.13 0.17 0.05 0.08 0.11 0.15 0.05 0.08 0.11 0.15 107 107 107 107 113 113 113 113 118 118 118 118 125 125 125 125 132 132 132 132 141 141 141 141 90.00 91.00 92.00 93.00 94.00 95.00 96.00 97.00 98.00 99.00 100.00 DP3 DP2 DP4 DP5 Tæ leä caùc DP hình thaønh sau quaù trình dòch hoùa do Enzyme Liquosupra zyme thuûy phaân cô chaát tinh boät theo caùc ñieàu kieän khaùc nhau (Phaân tích baèng phöông phaùp HPLC, detector RI) 2 %DP_RT60 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 1.50 1.75 2.00 2.25 2.50 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60 0.09 0.11 0.13 0.17 0.07 0.11 0.13 0.17 0.07 0.09 0.13 0.17 0.07 0.09 0.13 0.17 0.05 0.08 0.11 0.15 0.05 0.08 0.11 0.15 107 107 107 107 113 113 113 113 118 118 118 118 125 125 125 125 132 132 132 132 141 141 141 141 95.00 95.50 96.00 96.50 97.00 97.50 98.00 DP5 DP3 DP2 DP4 glu Tæ leä caùc DP hình thaønh sau quaù trình ñöôøng hoùa (60 giôø) do enzyme AMG-E 0.35L/tDS thuûy phaân cô chaát coù ñöôïc sau dòch hoùa tinh boät theo caùc ñieàu kieän dòch hoùa khaùc nhau (Phaân tích baèng phöông phaùp HPLC, detector RI) 3 4 5 Keát quaû ñöôøng hoùa baèng AMG-E 0.35L/tDS taïi caùc thôøi ñieåm vôùi cô chaát töø keát quaû thuûy phaân bôûi enzym Termamyl SC 0.11L/tDS