Hai hợp chất polyoxygenated steroid phân lập từ loài san hô mềm sinularia cruciata - Võ Quốc Hùng

57 Tạp chí Y Dược học - Trường Đại học Y Dược Huế - Số 9 5. Trần Thiện Trung, Nguyễn Hoàng Bắc, Lê Châu Hoàng Quốc Chương, Đỗ Trọng Hải, Đỗ Trọng Khanh, Nguyễn Tấn Cường (2007), “Kết quả sớm của phẫu thuật điều trị nang đường mật ở người lớn”, Y học TP Hồ Chí Minh, 11(1), tr. 146-153. 6. Phạm Anh Vũ (2002), Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng và kết quả điều trị bệnh giãn đường mật bẩm sinh ở trẻ em tại Bệnh viện Trung ương Huế, Luận văn thạc sĩ y học, Đại học Y Dược Huế - Đại học Huế, Huế. 7. Abramson L.P., Superina R., Radhakrishnan J. (2009), “Choledochal cyst”, Pediatric surgery, 2nd edition, pp. 306-310. 8. Brunicardi F.C. (2002), “Gallbladder and the Extrahepatic biliary system”, Schwartz’s principles of surgery, 8th edition, pp. 2556- 2573. 9. Karrer F.M. (2009), “Complications of hepatobiliary surgery”, Compli53. Tiao G.M. (2007), “Operative treatment of Choledochal cysts”, Mastery of surgery, 5th edition, pp. 2788-2799. HAI HỢP CHẤT POLYOXYGENATED STEROID PHÂN LẬP TỪ LOÀI SAN HÔ MỀM SINULARIA CRUCIATA Võ Quốc Hùng, Nguyễn Thị Hoài Khoa Dược, Trường Đại học Y Dược Huế Tóm tắt Đặt vấn đề: Sinh vật biển là một nguồn dự trữ hợp chất chuyển hóa hết sức phong phú và phức tạp, đồng thời thể hiện nhiều hoạt tính sinh học có giá trị. Trong số đó, San hô mềm cũng là một đối tượng nhiều năng nhưng chưa được nghiên cứu đầy đủ. Nghiên cứu này tiếp tục xác định cấu trúc các thành phần hóa học được phân lập từ loài Sinularia cruciata. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Mẫu San hô mềm Sinularia cruciata, được thu thập tại Khu Bảo tồn biển Cồn Cỏ - Quảng Trị. Phân lập các chất bằng sắc ký cột silica gel pha thường, pha đảo, sắc ký lớp mỏng điều chế, Sephadex LH 20, sắc ký lớp mỏng pha thường và pha đảo. Xác định cấu trúc bằng số liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR, phổ khối lượng ESI-MS. Kết quả - Kết luận: Đã phân lập và xác định được cấu trúc của 2 hợp chất thuộc nhóm polyoxygenated steroid là: (1) ergosta-3β,5α,6β,11α-tetraol (sarcoaldesterol B) và (2) ergosta-1β,3β,5α,6β- tetraol. Hiện chưa có báo cáo nào về tác dụng sinh học của 2 chất này nhưng nhiều nghiên cứu về polyoxygenated steroid cho thấy nhóm chất này sở hữu nhiều tác dụng sinh học quý, trong đó có hoạt tính chống ung thư. Từ khóa: Sinularia cruciata, sarcoaldesterol B , polyoxygenated steroid, San hô mềm, ung thư. Abstract: TWO POLYOXYGENATED STEROIDS FROM SOFT CORAL SINULARIA CRUCIATA Vo Quoc Hung, Nguyen Thi Hoai Faculty of Pharmacy, Hue University of Medicine and Pharmacy Background: Marine organisms are rich sources of complicated and various secondary metabolites which have a lager number of valuable bioactivities. Among those, although soft 58 Tạp chí Y Dược học - Trường Đại học Y Dược Huế - Số 9 corals are potential materials, they have not been deeply investigated yet. This is an ongoing research to determine the chemical constituents of Vietnamese octocorals Sinularia cruciata. Materials and method: The whole bodies of soft coral Sinularia cruciata collected from Con Co, Quang Tri province. Pure compounds were isolated by using column chromatography normal phase and inverse phase, preparative thin layer chromatography, thin layer chromatography and Shephadex LH-20. Structures of them were determined by spectral data of nuclear magnetic resonance (NMR), electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS). Results & Conclusion: Structures of 2 polyoxygenated steroids were identified: (1) ergosta-3β,5α,6β,11α- tetraol (sarcoaldesterol B) and (2) ergosta-1β,3β,5α,6β-tetraol. Till now, there are no reports about biological effects of these compounds. However, this steroidal group has shown many of precious bioactivities, especially anti-cancer. Key words: Sinularia cruciata, sarcoaldesterol B, polyoxygenated steroid, soft coral, cancer. 1. ĐẶT VẤN ĐỀ Bề mặt Trái Đất được bao phủ đến 3/4 diện tích bởi các đại dương rộng lớn, nơi nuôi dưỡng và phát triển mạnh mẽ những hệ sinh thái đa dạng về chủng loại và phong phú về số lượng trong sinh quyển. Môi trường sinh thái biển với đặc thù riêng tiềm tàng những nguồn hợp chất chuyển hóa phức tạp, đồng thời thể hiện nhiều hoạt tính sinh học quý giá. Tuy nhiên, cho đến thời điểm này, số loài sinh vật biển được nghiên cứu vẫn rất khiêm tốn và còn nhiều đối tượng tiềm năng nhưng chưa được khám phá. San hô mềm chính là một trong số những đối tượng như vậy. San hô mềm phát triển rộng khắp tại nhiều nơi trên thế giới. Ở Việt Nam, chúng phân bố nhiều ở các đảo Cát Bà (Hải Phòng), Cồn Cỏ (Quảng Trị), Nha Trang San hô mềm tập trung ở độ sâu từ 5 - 30 m và có 3 giống chiếm ưu thế nhất trong quần thể rạn là Sinularia, Sarcophyton và Lobophytum [3], [6]. Trong nghiên cứu của chúng tôi về thành phần hoá học loài Sinularia cruciata, 4 hợp chất bao gồm 5,8-epidioxycholest- 6-en-3-ol, Cholesterol, 1-O-hexadecyl- glycerol (Chimyl alcohol) và Glycerol 1-O-octadecyl ether (Batyl alcohol) đã được thông báo [2]. Bài báo này tiếp tục công bố quá trình chiết xuất và phân lập 2 hợp chất thuộc nhóm polyoxygenated steroid từ phân đoạn ethyl acetat của Sinularia cruciata. 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu Nguyên liệu là toàn thân San hô mềm – tên khoa học Sinularia cruciata - họ Alcyoniidae. Mẫu thu tại Khu bảo tồn biển Cồn Cỏ - Quảng Trị vào tháng 5 năm 2011. Tên khoa học được xác định bởi PGS.TS. Đỗ Công Thung – Viện Tài nguyên Môi trường biển Hải Phòng. Mẫu được rửa sạch, thái nhỏ, phơi sấy ở 50 – 60oC, xay thành bột thô và bảo quản nơi khô thoáng. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp Tạo dịch chiết toàn phần bằng phương pháp ngâm và chiết siêu âm với máy Amsco Reliance Sonic 550. Chiết xuất phân đoạn bằng các phương pháp chiết lỏng-lỏng, rắn-lỏng. Phân lập các chất tinh khiết bằng sắc ký cột silica gel pha thường (silica gel 60 0,040- 0,063mm (230-400 mesh ASTM), Merck); silica gel pha đảo YMC (30-50 µm, FuJisilisa Chemical Ltd.); Sephadex LH-20, sắc ký lớp mỏng điều chế sử dụng bản mỏng tráng sẵn silica gel 60G F254 (Merck). Theo dõi các phân đoạn bằng sắc ký lớp mỏng pha thường, pha đảo (TLC-Silicagel 60 F 254 Merck). Phát hiện vết chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 366 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H 2 SO4 10% phun đều lên bản mỏng, sấy khô rồi hơ nóng từ từ đến khi hiện màu [1]. Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập 59 Tạp chí Y Dược học - Trường Đại học Y Dược Huế - Số 9 được dựa trên các phương pháp phổ bao gồm: phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT) và hai chiều (HMBC, HSQC); phổ khối lượng ESI-MS [4]. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân đo trên máy Bruker Avance AM500 FT-NMR tại Viện Hoá học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, chất chuẩn nội là tetramethyl silan. Phổ khối lượng đo trên máy LC- MSD-Trap-SL tại Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. 2.2.2. Tiến hành Bột San hô mềm (SHM) khối lượng 11,2 kg được chiết siêu âm 3 đợt với methanol tuyệt đối, mỗi đợt 3 lần, cách nhau 15 phút, mỗi lần trong 1giờ ở 56oC. Dịch chiết thu được đem cô quay hút chân không ở 56oC thành cắn ở dạng cao đặc. Phân tán cắn trong nước, sau đó lắc với các dung môi có độ phân cực tăng dần là n-hexan, chloroform, ethyl acetat và n-butanol. Cô quay cất thu hồi các phân đoạn dung môi dưới áp suất giảm được các cắn, ký hiệu theo thứ tự từ SHM-A đến SHM-D, phần dịch nước còn lại ký hiệu SHM-E. Tiến hành chiết pha rắn cắn SHM-C với hệ dung môi chloroform : aceton lần lượt với tỷ lệ 100:1, 50:1, 25:1, 10:1, 5:1, 1:1 và aceton 100%, thể tích 0,5 lít mỗi hệ, thu được 7 phân đoạn ký hiệu từ C1 đến C7. Phân đoạn C4 được triển khai trên sắc ký cột pha đảo với hệ dung môi aceton : nước (7,5:1). Theo dõi quá trình khai triển bằng sắc ký lớp mỏng, các phân đoạn tương tự nhau được gộp chung. Sau khi cô quay cất loại dung môi được 5 phân đoạn ký hiệu lần lượt từ C4A đến C4E. Phân đoạn C4D được phân tích trên cột Sephadex LH-20 bằng methanol 80 % (v/v, pha trong nước cất) lần lượt thu được 6 phân đoạn ký hiệu từ C4D1 đến C4D6. Sắc ký cột pha thường được sử dụng để phân tích C4D5 với hệ dung môi rửa giải là chloroform : aceton : methanol (12:8:0,5) cho các phân đoạn từ C4D5A đến C4D5D. Tiếp tục phân tách C4D5B bằng sắc ký cột pha đảo với hệ methanol : nước (8:1) được 2 phân đoạn tương đối sạch là C4D5B1 và C4D5B2. C4D5B1 được tinh chế tiếp bằng sắc ký lớp mỏng điều chế triển khai bằng hệ dung môi chloroform : methanol: formic acid (5:1:0,1). Cắt rìa bản mỏng để phun thuốc thử là dung dịch H 2 SO4 10% trong ethanol, hơ nóng. Ghép bản mỏng lại như cũ để xác định vùng chất, sau đó cạo lớp silica gel tương ứng, giải hấp phụ bằng methanol, thu được 7,6 mg chất, ký hiệu C4D5B1 (1). Kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng với 3 hệ dung môi là chloroform: methanol (5:3), chloroform : aceton (2:3) và ethyl acetat : methanol (8,5:3) cho thấy đây là một chất sạch. Phân đoạn C6 sau khi khai triển bằng sắc ký cột pha thường với hệ ethyl acetat : methanol : nước (5:1:0,5) thu được 6 phân đoạn từ C6A đến C6F. C6B được phân tích bằng sắc ký cột pha đảo bởi hệ methanol : nước (6:1) cho 4 phân đoạn từ C6B1 đến C6B4. Quá trình rửa giải C6B3 trên cột sắc ký pha thường với hệ chloroform : methanol (3:2) thu được 5 phân đoạn từ C6B3A đến C6B3E. Trong đó, tại phân đoạn C6B3B nhận thấy có các tinh thể hình kim màu trắng xuất hiện. Lọc rửa tinh thể bằng nước cất, hòa tan hoàn toàn trong hệ chloroform: methanol (3:2) rồi cho dung môi bay hơi để kết tinh tự nhiên. Quá trình trên được lặp lại 2 lần, sau cùng thu được một hợp chất kết tinh ký hiệu C6B3B (2), khối lượng 21,3 mg. Kiểm tra trên sắc ký lớp mỏng với 3 hệ dung môi khác nhau cho thấy đây là một hợp chất tinh khiết. 3. KẾT QUẢ 3.1. Nhận dạng hợp chất C4D5B1 (1) Hợp chất C4D5B1 có dạng chất bột màu trắng. Công thức phân tử được xác định là C 28 H 50 O4 bằng các dữ kiện phổ khối lượng (positive ESI-MS: m/z 473,1 [M + Na]+, 433,1 [M - H 2 O + H]+, 415,1 [M - 2H 2 O + H]+, 397,1 [M - 3H 2 O + H]+). Phổ 1H-NMR của C4D5B1 đặc trưng cho 60 Tạp chí Y Dược học - Trường Đại học Y Dược Huế - Số 9 một hợp chất steroid. Trong đó, sự xuất hiện của ba nhóm oximethin được khẳng định bởi các tín hiệu cộng hưởng tại δ 3,84 (1H, m, H-3), 3,46 (1H, br s, H-6) và 4,01 (1H, m, H-11). Ngoài ra các tín hiệu cộng hưởng tại δ 0,75 (3H, s, H-18), 1,29 (3H, s, H-19), 0,99 (3H, d, J = 7,0 Hz, H-21), 0,83 (3H, d, J = 7,0 Hz, H-26), 0,90 (3H, d, J = 7,0 Hz, H-27) và 0,82 (3H, d, J = 7,0 Hz, H-28) khẳng định sự tồn tại của nhóm methyl và gợi ý cho cấu trúc nhánh bên dạng ergosterol. Phổ 13C-NMR của C4D5B1 xuất hiện các tín hiệu đặc trưng cho một hợp chất steroid có 28 carbon. Trong đó sự xuất hiện tín hiệu của 6 nhóm methyl tại δ 13,40 (C-18), 17,56 (C-19), 19,39 (C-21), 18,12 (C-26), 20,96 (C-27) và 16,00 (C-28) khẳng định sự tồn tại của nhánh bên dạng ergosterol. Ngoài ra, sự có mặt của ba nhóm oximethin và một carbon bậc bốn nối với nguyên tử oxy cũng được xác định bởi các tín hiệu cộng hưởng tương ứng tại δ 69,43 (C- 3), 76,55 (C-6), 68,17 (C-11) và 77,45 (C-5). Các tín hiệu carbon được gán với các tín hiệu proton tương ứng thông qua phổ HSQC. Như vậy có thể sơ bộ xác định, C4D5B1 là một steroid dạng ergosterol chứa 3 nhóm oximethin và một carbon bậc bốn nối với nguyên tử oxy. Nhóm β-hydroxyl tại vị trí C-3 dễ dàng được xác định qua tín hiệu proton đặc trưng tại 3,84 (1H, m, H-3). Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều tương tác xa HMBC được đo nhằm xác định vị trí của các nhóm hydroxyl còn lại. Tín hiệu tương tác HMBC từ proton H-19 sang C-5 khẳng định vị trí của nhóm hydroxyl tại C-5. Nhóm hydroxyl C-6 được xác định bởi các tín hiệu tương tác HMBC từ proton của nó sang carbon C-5, C-8 và C-10. Cuối cùng các tín hiệu tương tác từ proton H-12 sang C-11 và từ proton H-11 sang C-10 cho biết vị trí của nhóm hydroxyl tại C-11. Từ các phân tích nêu trên và sự phù hợp hoàn toàn về số liệu phổ NMR của C4D5B1 với các số liệu đã được công bố [5], có thể khẳng định cấu trúc hóa học của nó là ergosta- 3β,5α,6β,11α-tetraol hay còn được gọi là sarcoaldesterol B. OH HO OH HO 1 3 5 9 10 11 13 17 18 19 20 21 24 25 26 27 28 7 Hình 1. Cấu trúc hóa học của C4D5B1(1) 3.2. Nhận dạng hợp chất C6B3B (2) Hợp chất C6B3B có dạng tinh thể hình kim màu trắng. Công thức phân tử được xác định trùng với công thức phân tử của C4D5B1 bằng các dữ kiện phổ khối lượng (positive ESI-MS: m/z 473,1 [M + Na]+, 450,9 [M + H]+). Số liệu phổ 1H và 13C-NMR của C6B3B tương tự như số liệu của C4D5B1. Tuy nhiên, có sự thay đổi dễ nhận thấy là tín hiệu carbon oximethin C-11 trong phân tử của C4D5B1 tại δ 68,17 đã bị dịch chuyển lên vùng trường thấp tại δ 74,33 trong phân tử của C6B3B. Điều này cho biết nhóm oximethin C-11 đã bị thay đổi vị trí. Phổ HMBC được đo nhằm xác định vị trí của nhóm hydroxyl này. Tín hiệu tương tác HMBC giữa proton H-19 và carbon C-1 (δ 74,33) cho phép khẳng định vị trí thế của nhóm hydroxyl ở C-1. Những phân tích đã nêu cùng với sự phù hợp hoàn toàn về số liệu phổ NMR tại các vị trí tương ứng của C6B3B so với các số liệu đã công bố [10], cho phép khẳng định cấu trúc hóa học của nó là ergosta-1β,3β,5α,6β- tetraol. OH HO OH 1 3 5 9 10 11 13 17 18 19 20 21 24 25 26 27 28 7 OH Hình 2. Cấu trúc hóa học của C6B3B (2) 61 Tạp chí Y Dược học - Trường Đại học Y Dược Huế - Số 9 4. BÀN LUẬN Hai hợp chất đề tài phân lập được đều thuộc nhóm polyoxygenated steroid. Đây là nhóm hợp chất có nhiều hoạt tính sinh học có giá trị. Có thể kể đến các hoạt tính như: ức chế tổng hợp cholesterol, ức chế enzym 5α-reductase, khả năng điều hòa miễn dịch và đáng chú ý nhất là tác dụng kháng tế bào khối u [8]. Các nghiên cứu về hợp chất thuộc nhóm polyoxygenated steroid phân lập từ giống Sinularia đã cho thấy hoạt tính kháng tế bào ung thư chọn lọc trên dòng ung thư biểu mô (KB) và kết tràng (HT-29) với các giá trị ED 50 tương ứng rất thấp 1,9 và 1,5μg/ml [9]. Nghiên cứu khác về những hợp chất thuộc nhóm này đã chứng minh chúng khả năng ức chế mạnh trên cả 3 dòng tế bào ung thư là ung thư máu ở người (HL60), u sắc tố da ác tính (M14) và tế bào ung thư vú (MCF7) với các giá trị EC 50 có ý nghĩa (2,8; 4,3 và 4,9μg/ml) [7]. Điểm đáng chú ý là khi hợp chất thuộc nhóm này được thử tác dụng trên tế bào lympho người bình thường ở máu ngoại vi (PBLs), kết quả cho thấy độc tính đối với tế bào lympho là tối thiểu, nghĩa là đã có sự tác dụng chọn lọc đối với tế bào khối u [7]. Hợp chất ergosta-3β,5α,6β,11α-tetraol (sarcoaldesterol B) (1) đã được phân lập từ một số loài thuộc giống Sarcophyton [5], còn ergosta-1β,3β,5α,6β-tetraol (2) cũng đã được phân lập từ các loài San hô mềm Sarcophyton glaucum và Lobophytum pauciflorum [10]. Tuy nhiên đây là lần đầu tiên chúng được phân lập từ loài San hô mềm Sinularia cruciata Tixier-Durivault thu thập tại vùng biển Việt Nam. Hiện tại chưa có báo cáo nào về tác dụng sinh học của hai hợp chất này. Tuy nhiên, qua vài dẫn chứng trong số rất nhiều nghiên cứu được công bố, có thể thấy rằng polyoxygenated steroid là một nhóm hợp chất đầy triển vọng trong việc tìm kiếm các loại thuốc mới, đặc biệt là thuốc điều trị ung thư hiệu quả và an toàn cho người sử dụng. Cùng với các thành phần đã phân lập trong công bố trước đây [2], có thể thấy San hô mềm nói chung và loài Sinularia cruciata nói riêng chứa đựng nguồn hợp chất chuyển hóa phong phú và có giá trị, cần được nghiên cứu sâu hơn trong thời gian tiếp theo. 5. KẾT LUẬN Từ loài San hô mềm Sinularia cruciata - Alcyoniidae, thu mẫu tại Khu bảo tồn biển Cồn Cỏ - Quảng Trị, đã phân lập được 2 hợp chất trong phân đoạn ethyl acetat bằng các phương pháp sắc ký kết hợp. Cấu trúc của chúng được xác định là ergosta-3β,5α,6β,11α- tetraol (còn gọi là sarcoaldesterol B) (1) và ergosta-1β,3β,5α,6β-tetraol (2). Lời cảm ơn: Công trình nghiên cứu này được hoàn thành với sự giúp đỡ của PGS.TS. Phan Văn Kiệm và các đồng nghiệp tại Viện Hóa Sinh Biển - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam - 18 Hoàng Quốc Việt - Hà Nội. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Nguyễn Văn Đàn, Nguyễn Viết Tựu (1985), Phương pháp nghiên cứu hóa học cây thuốc, Nxb. Y học, Thành phố Hồ Chí Minh, tr. 19-23, 43-52, 58-74. 2. Võ Quốc Hùng, Đoàn Nguyễn Phương Nhi, Nguyễn Đình Quỳnh Phú, Hồ Thị Diệu Trâm, Nguyễn Thị Hoài (2012), Nghiên cứu thành phần hoá học có hoạt tính chống ung thư từ loài San hô mềm Sinularia cruciata – Họ Alcyoniidae, Tạp chí Y học Thực hành, 818-819, 7-11. 3. Châu Văn Minh (2006), “Nghiên cứu khả năng khai thác và sử dụng nguồn dược liệu biển Việt Nam”, Tuyển tập các kết quả chủ yếu của chương trình “Điều tra cơ bản và nghiên cứu ứng dụng công nghệ biển”, Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên, tr. 176-293. 4. Trần Văn Sung (2002), Phổ cộng hưởng từ hạt nhân trong hoá hữu cơ, Nxb. Đại học Quốc gia, Hà Nội, tập 1. 5. Akemi Umeyama, Noboru Shoji, Mai Ozeki, Shigenobu Arihara (1996), “Sarcoaldesterols A and B, Two New 62 Tạp chí Y Dược học - Trường Đại học Y Dược Huế - Số 9 Polyhydroxylated Sterols from the Soft Coral Sarcophyton sp.”, Journal of Natural Products, 59 (9), pp. 894-895. 6. Chau Van Minh, Phan Van Kiem, Nguyen Xuan Nhiem, Nguyen Xuan Cuong, Nguyen Phuong Thao, Nguyen Hoai Nam, Hoang Le Tuan Anh, Do Cong Thung, Dinh Thi Thu Thuy, Hee-Kyoung Kang, Hae-Dong Jang, Young Ho Kim (2011), “Cytotoxic and antioxidant activities of diterpenes and sterols from the Vietnamese soft coral Lobophytum compactum”, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 21, pp. 2155– 2159. 7. Hui Dong, Yu-Lin Gou, R. Manjunatha Kini, Hong-Xi Xu, Shao-Xing Chen, Serena Lay Ming Teo, Paul Pui-Hay But (2000), “A New Cytotoxic Polyhydroxysterol from Soft Coral Sarcophyton trocheliophorum”, Chem. Pharm. Bull., 48 (7), pp. 1087-1089. 8. Jean-Michel Kornprobst (2010), “Cnidaria and Ctenophora”, Encyclopedia of Marine Natural Products, Wiley-Blackwell, Germany, 2, pp. 925-976. 9. Jyh-Horng Sheu, Kuie-Chi Chang, Chang- Yih Duh (2000), “A Cytotoxic 5α,8α- Epidioxysterol from a Soft Coral Sinularia Species”, Journal of Natural Products, 63, pp. 149-151. 10. Masaru Kobayashi, Takaaki Hayashi, Koji Hayashi, Masato Tanabe, Takashi Nakagawa, Hiroshi Mitsuhashi (1983), “Marine sterols. XI. Polyhydroxysterols of the Soft Coral Sarcophyton glaucum: Isolation and Synthesis of 5α-cholestane- 1β,3β,5,6β-tetrol”, Chem. Pharm. Bull., 31 (6), pp. 1848-1855. NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH THẨM ĐỊNH HIỆU LỰC PHƯƠNG PHÁP TIỆT KHUẨN BẰNG NHIỆT ẨM Trương Văn Đạt, Đỗ Quang Dương, Huỳnh Văn Hóa Khoa Dược, Trường Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh Tóm tắt Đặt vấn đề: Quy trình thẩm định phương pháp tiệt khuẩn bằng nhiệt ẩm bao gồm rất nhiều công đoạn. Đánh giá IQ, OQ của thiết bị phải tuân thủ theo các quy trình thao tác chuẩn (SOP) của nhà sản xuất hay nhà cung cấp. Tuy nhiên, hiệu lực của quy trình tiệt khuẩn phải được chứng minh bằng các con số dựa vào hệ số tiệt khuẩn D, giá trị Z, giá trị F và giá trị SAL. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Nghiên cứu tính toán tổng thời gian cần thiết cho một quy trình tiệt khuẩn bằng nhiệt ẩm dựa vào kết quả khảo sát trên 13 nhà máy có sản xuất thuốc vô khuẩn và các tài liệu được công bố. Kết quả: Kết quả nghiên cứu đã tính toán được tổng thời gian tiệt khuẩn C (nếu giả định rằng SAL = 10-6), thời gian này sẽ dùng để so sánh với thời gian thực tế của quy trình tiệt khuẩn. Kết luận: Thời gian thực tế của quy trình tiệt khuẩn càng gần giá trị C thì quy trình có hiệu lực tiệt khuẩn càng cao. Từ khóa: Thuốc vô khuẩn, tiệt khuẩn bằng nhiệt ẩm, giá trị D, giá trị Z, giá trị F, chỉ thị sinh học, quy trình thẩm định. 63 Tạp chí Y Dược học - Trường Đại học Y Dược Huế - Số 9 Abstract: STUDYING THE EFFICIENCY OF MOIST HEAT STERILIZATION VALIDATION PROCESS Truong Van Dat, Do Quang Duong, Huynh Van Hoa Faculty of Pharmacy, Ho Chi Minh City University of Medicine and Phramacy Background: Moist Heat Sterilization validation process comprises several steps. The IQ, OQ have to follow the specified SOPs of manufacturer or equipment supplier. However, the efficiency of the sterilization process must be expressed in numberized values based on sterilization coefficient D, Z value, F value and SAL value. Materials and methods: Studying to calculate the total Moist Heat Sterilization time based on the survey results process validation at 13 pharmaceutical factories having chains of sterile drugs and the other published documents. Results: The researched results were calculated the total sterilization time C (if the assumption that SAL = 10-6), this time will be compared with the real time of the process. Conclusion: The real time of the sterilization process is as similar as the C value, the efficiency of sterilization process is highlier. Keywords: Sterile drug, Moist Heat Sterilization, D value, Z value, F value, Biological indicator, process validation. 1. ĐẶT VẤN ĐỀ Phương pháp tiệt khuẩn bằng nhiệt ẩm (Moist Heat Sterilization) được tiến hành trong một thiết bị chuyên dụng gọi là nồi hấp và tác nhân tiệt khuẩn là hơi nước bão hòa dưới áp suất cao (Hình 1). Phương pháp này thường được áp dụng cho các dạng thuốc dung dịch. Trong suốt quá trình tiệt khuẩn, yêu cầu phải theo dõi nhiệt độ và áp suất bên trong nồi hấp cũng như thời gian thực hiện quy trình tiệt khuẩn. Các thông số này phải chứng minh là có hiệu lực tiệt khuẩn và được thể hiện bằng kết quả thẩm định. Chỉ thị sinh học (CTSH) được sử dụng trong quá trình thẩm định thường là bào tử Bacillus stearothermophilus hoặc Geobacillus stearothermophilus do có tính đề kháng nhiệt cao, nồng độ sử dụng là 106 bào tử [4, 8]. Bài báo nghiên cứu xây dựng quy trình thẩm định hiệu lực quy trình tiệt khuẩn bằng nhiệt ẩm. Hình 1. Nồi hấp tiệt khuẩn 2. PHƯƠNG PHÁP VÀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU Nghiên cứu xây dựng công thức tính toán tổng thời gian tiệt khuẩn lý thuyết đảm bảo cấp độ vô khuẩn cho một quy trình tiệt khuẩn bằng nhiệt ẩm dựa vào kết quả khảo sát thực tế tại 13 nhà máy có dây chuyền sản xuất thuốc vô khuẩn và các công trình khoa học được công bố có liên quan [3]. 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Thẩm định hiệu lực quy trình tiệt khuẩn bằng nhiệt ẩm trong nồi hấp bao gồm : đánh giá lắp đặt (Installation Qualification – IQ), đánh giá vận hành (Operational Qualification – OQ) và đánh giá hiệu năng (Performance Qualification – PQ). 3.1. Đánh giá lắp đặt và vận hành Việc đánh giá lắp đặt, vận hành thiết bị được thực hiện theo quy trình thao tác chuẩn (SOP) của nhà sản xuất cung cấp hoặc SOP riêng của nhà máy, tuy nhiên phải đảm bảo thẩm định đầy đủ các yếu tố sau: thiết bị cơ khí (buồng, van, lọc, bộ lọc, điều áp, bơm chân không, bộ trao đổi nhiệt, bình ngưng tụ,), thiết bị kết nối (điện, nối đất, nguồn cung cấp điện liên tục, nước, không khí, hơi nước sạch, máy cung cấp