Giáo trình Vi sinh vật học - Nguyễn Trung Nhân

n, ở vi khuẩn có khi trong quá trình sinh trưởng, chúng hình thành bào tử, khi đó khối lượng và kích thước tế bào giảm đi so với tế bào sinh dưỡng, ta gọi hiện tượng này là sinh dưỡng âm. Sự phát triển có thể hiểu là sự tăng kích thước tế bào dẫn đến sự phân chia, làm tăng số lượng cá thể trong quần thể. 5.3.2. Đồ thị sinh trưởng của quần thể vi sinh vật trong hệ “kín” (nuôi cấy không liên tục) Hệ “kín” ở đây có nghĩa là trong môi trường không được đổi mới; ta biết trên môi trường đặc (thạch đĩa), một tế bào vi khuẩn sau 24-48 giờ sẽ tạo thành một khuẩn lạc. Khi cấy vi khuẩn vào môi trường dinh dưỡng, chúng sẽ sinh sôi nảy nở cho đến lúc hàm lượng của một chất nào đó cần thiết cho chúng ở môi trường giảm đến mức thấp nhất, khi đó sự sinh trưởng phát triển chậm dần và trì trệ, mặc dù các tế bào vẫn tiến hành vài lần phân chia tiếp theo, nhưng cho các thế hệ tế bào bé hơn và khối lượng nhỏ hơn. Nếu trong cả thời kì đó ta không bổ sung chất dinh dưỡng và loại bỏ những sản phẩm trao đổi chất thì ta có quần thể tế bào trong không gian sống có giới hạn. Sự sinh trưởng trong hệ “kín” như vậy phải tuân theo những qui luật chi phối không chỉ đối với cơ thể đơn bào mà còn đối với cả cơ thể đa bào nữa. 5.3.3. Hiện tượng sinh trưởng kép và hiện tượng sinh trưởng thêm Trong pha suy vong, các vi khuẩn không phân chia nữa, rất nhiều vi khuẩn chết và tự thủy phân chính bởi các enzym do chúng giải phóng ra. Một số nhỏ sống sót có thể thoát chết và lại có thêm vài lần nhân lên nữa phụ thuộc vào các cơ chất do những tế bào tự thủy phân giải phóng ra. Hiện tượng này gọi là hiện tượng sinh trưởng (dốn) thêm. - Nếu trong môi trường tổng hợp gồm hỗn hợp hai loại cơ chất cacbon, thì có thể thấy được sự sinh trưởng không bình thường. Lúc đầu vi khuẩn tổng hợp - 49 - loại enzym để phân giải loại hợp chất dễ đồng hóa hơn, sau đó khi chất này đã cạn, vi khuẩn lại được chất thứ hai cảm ứng để tổng hợp loại enzym phân giải hợp chất cacbon thứ hai này. Trên đồ thị sinh trưởng có hai pha tiềm phát, hai pha tăng tốc, hai pha cấp số, hai pha giảm tốc rồi mới đến pha cân bằng động. Hiện tượng này được Monod mô tả là hiện tượng sinh trưởng kép. 5.3.4. Sự sinh trưởng của vi sinh vật trong nuôi cấy liên tục Khi nuôi cấy vi sinh vật trong hệ “kín”, tức là môi trường không được đổi mới, điều kiện môi trường sống bị thay đổi, hàm lượng chất dinh dưỡng cạn kiệt dần, sự tích lũy các sản phẩm đã qua trao đổi tăng lên không ngừng, đó là nguyên nhân chính làm cho pha sinh trưởng cấp số nhân chỉ kéo dài trong một thời gian ngắn, nguyên nhân làm thay đổi tốc độ sinh trưởng riêng, hình thái và các đặc điểm sinh lí-sinh hóa, điều này rất bất lợi cho công nghệ vi sinh, sản xuất công nghiệp. Để tránh sự ‘già’ của giống, để giữ giống nuôi cấy ổn định trong cùng một trạng thái, ví dụ ở pha log chẳng hạn, bằng cách đưa liên tục các dung dịch dinh dưỡng vào và đồng thời loại bỏ một lượng tương đương dịch huyền phù nuôi cấy ra, đó là nguyên tắc cơ bản cho quá trình nuôi cấy liên tục trong các hệ nồi lên men kiểu Chemostat và Turbidostat. Ưu điểm cơ bản của nuôi cấy liên tục là làm cho tốc độ sinh trưởng riêng của vi sinh vật ở cao nhất trong điều kiện cụ thể và kiểm soát được, thu được lượng sinh khối cao nhất. 5.3.5. Phân lập vi sinh vật và nuôi cấy thuần chủng 5.3.5.1. Kĩ thuật phân lập vi sinh vật Phân lập vi sinh vật trong không khí Phân lập vi sinh vật từ cơ chất rắn. 5.3.5.2. Môt trường nuôi cấy Tính chất của môi trường phụ thuộc vào thành phần của chúng. Người ta sử dụng môi trường vào các mục đích: nghiên cứu, chẩn đoán, lên men công nghiệp...Trong quá trình sinh trưởng phát triển nhiều loại vi sinh vật làm đục dần dần các môi trường lỏng, làm kết tụ hoặc tạo cặn lắng, đóng mặt lỏng trên mặt - 50 - môi trường... Trên môi trường đặc, từ bào tử riêng biệt sẽ phát triển thành khuẩn lạc (colonie); kích thước, mép, cấu tạo bề mặt khuẩn lạc là những tính chất để định loại. Khi chế môi trường đặc, người ta thường bổ sung vào môi trường lỏng hợp chất polisaccharit cao phân tử (agar) chiết từ các loại tảo khác nhau với tỉ lệ 1,5- 2%, hình thành môi trường thạch đặc. + Các loại môi trường: a. Môi trường tự nhiên b. Môi trường tổng hợp c. Môi trường bán tổng hợp - 51 - CÂU HỎI VÀ BÀI TẬP 1. Giới thiệu ngắn gọn các hình thức vận chuyển các chất qua màng. 2. Sự khác biệt giữa các chất chuyển hóa sơ cấp và chuyển hóa thứ cấp, các chất chuyển hóa trung gian là gì? Nêu ứng dụng một số chất chuyển hóa sơ cấp và thứ cấp? 3. Tại sao các axit amin, các purin và pirimidin là những nhân tố sinh trưởng, trong khi glucozơ nói chung không làm chức năng này? 4. Nguyên nhân gì làm cho một chủng vi sinh vật cần phải có pha tiềm phát (pha lag), khi bắt đầu nuôi cấy chúng trong môi trường mới? 5. Nuôi cấy liên tục có lợi thế gì và nhược điểm gì so với nuôi cấy không liên tục? 6. Một vi khuẩn hình cầu có khối lượng khoảng 5.10-13 gam, cứ 20 phút lại nhân đôi một lần. Giả sử nó được nuôi trong các điều kiện sinh trưởng hoàn toàn tối ưu, hãy tính xem sau một khoảng thời gian là bao lâu khối lượng do tế bào vi khuẩn này sinh ra sẽ đạt tới khối lượng của Trái Đất là 6.1027 gam? (lấy ln2 = 0,3).  - 52 - Chương 6: SỰ CHUYỂN HÓA CÁC CHẤT VÀ CÁC QUÁ TRÌNH LÊN MEN Mục tiêu Sinh viên cần hiểu được bản chất của một số quá trình lên men chủ yếu cùng những ứng dụng của các quá trình lên men etylic và lactic. Sinh viên phân tích và hiểu được sự chuyển hóa các chất ở VSV cùng những ứng dụng của nó trong đời sống và sản xuất. 6.1. Sự chuyển hóa các chất trong tế bào vi sinh vật 6.1.1. Phản ứng phân giải-tổng hợp Sự chuyển hóa vật chất của tế bào hoặc của một cơ thể là một quá trình gồm toàn bộ các phản ứng hóa học xảy ra trong tế bào hoặc cơ thể. Các phản ứng này có thể là những phản ứng phân giải (catabolism) hay phản ứng tổng hợp (anabolism) các hợp chất khác nhau, mà tế bào thu được hoặc tiêu tốn năng lượng. Các thức ăn cung cấp cho vi khuẩn chỉ được chúng đồng hóa khi các chất này đi qua được thành (vách) và màng tế bào chất. Phần lớn các chất dinh dưỡng có khối lượng phân tử và kích thước quá lớn khiến chúng khó đi qua các lớp màng ngăn trở này, vì vậy chúng phải được phân cắt thành những đoạn có phân tử khối bé hơn ngay ở bên ngoài thành tế bào vi khuẩn. Sự tiêu hóa sơ bộ này là do các enzym ngoại bào (exoenzym) khác với các enzym nằm trong tế bào là enzym nội bào (endoenzym). 6.1.2. Enzym vi sinh vật Các enzym vi sinh vật được liên kết cư trú ở màng tế bào chất (hoặc nằm trong vùng ngoại vi màng tế bào chất của các vi khuẩn Gram âm) hoặc nằm tự do trong tế bào chất hay ở môi trường ngoại bào. - Các enzym ngoại bào được tiết ra môi trường ngoài. Các enzym ngoại bào phân cắt các phân tử lớn (như enzym amylaza, caseinaza) và những enzym ngoại bào tác nhân gây bệnh (coagulaza, ADN-aza, exotoxin...). - Các enzym nội bào hòa tan khu trú ở trong tế bào chất. Chúng tham gia vào quá trình chuyển hóa trung gian của tế bào (như β-galactosidaza, các enzym - 53 - của quá trình đường phân...) 6.1.3. Sinh tổng hợp Năng lượng được hình thành trong tế bào vi sinh vật nhờ vào năng lượng hóa học (ti thể và vi khuẩn hiếu khí) và năng lượng ánh sáng (diệp lục và vi khuẩn quang hợp), được vi sinh vật sử dụng vào 3 công việc chủ yếu: 1) Tổng hợp ATP từ đó sinh tổng hợp các hợp chất cần cho sinh trưởng của tế bào; 2) Vận chuyển các chất ngược với gradient nồng độ; 3) Chuyển động, quay các tiên mao. Quá trình chuyển hóa các chất sơ cấp, gồm nhiều giai đoạn thông qua hàng loạt các phản ứng trung gian đã xây dựng các thành phần kiến tạo nên các đại phân tử tế bào vi khuẩn. Các chất chuyển hóa thứ cấp được sinh ra từ nhiều loại cơ thể: vi sinh vật, thực vật và động vật. Quá trình tổng hợp các chất chuyển hóa thứ cấp thường kéo dài ở pha sau pha sinh trưởng cấp số, và rất phức tạp. - Sự tổng hợp các chất chuyển hóa thứ cấp được điều khiển bởi tập hợp các gan thường nằm liên kết với các gen điều chỉnh và ức chế ở các plasmit. - Một chất chuyển hóa thứ cấp thường chỉ được tổng hợp nhờ một số nhất định các cơ thể. 6.1.4. Sự chuyển hóa năng lượng 6.1.4.1. Các nguồn năng lượng khác nhau Tùy theo bản chất của nguồn năng lượng sơ cấp, có hai con đường cơ bản để cung cấp cho vi sinh vật: con đường quang dưỡng và hóa dưỡng. 6.1.4.2. Các kiểu chuyển hóa Các vi sinh vật thu năng lượng dùng cho hoạt động sống nhờ hai cơ chất chủ yếu là: quá trình chuyển hóa các chất quang dưỡng và chuyển hóa các chất hóa dưỡng. 6.2. Các kiểu hô hấp 6.2.1. Hô hấp hiếu khí và kị khí Ngày nay, khi đã hiểu rõ cơ chế phân tử của quá trình và đưa vào quy luật - 54 - Mitchell, khái niệm hô hấp và lên men càng được cụ thể hơn: - Hô hấp đối với một vi khuẩn là do nó có một chuỗi vận chuyển electron liên kết ở màng tế bào và sự đi vào của dòng electron theo một chiều (hướng về bên trong của tế bào trong trường hợp các cơ thể nhân sơ) và một dòng tương đương các proton theo chiều ngược lại (hướng ra ngoài cơ thể nhân sơ), mà hợp chất làm chất nhận electron cuối cùng có thể là O2, NO3-, hợp chất hữu cơ... - Lên men để chỉ sự có mặt của chuỗi vận chuyển electron nằm trong tế bào chất, không có sự tự động đi qua của dòng electron hoặc proton ở phần bên này và phần bên kia của màng tế bào (một dòng vận chuyển thứ cấp được thiết lập nếu cần thiết, nhờ năng lượng của ATP). Do đó, hô hấp của một cơ thể là một quá trình vận chuyển electron và proton qua màng với oxi phân tử làm chất nhậnn electron cuối cùng, còn “hô hấp kị khí” dùng để chỉ một quá trình vận chuyển qua màng của các electron và proton cho đến tận chất nhận electron cuối cùng là một chất khác oxi phân tử, như nitrat trong trường hợp hô hấp nitrat, hợp chất hữu cơ như fumarat như hô hấp fumarat, ion SO42- trong hô hấp sunfat... 6.2.2. Lên men Về phương diện chuyển hóa năng lượng, lên men cũng là một quá trình oxi hóa khử, nhưng chất nhận electron cuối cùng là các hợp chất hữu cơ, chứ không phải là các phân tử oxi. Việc vận chuyển electron được thực hiện nhờ NAD+. Ở đây có sự khác biệt rõ rệt so với hô hấp về bản chất của chất vận chuyển electron là NAD và NADP, về sản phẩm cuối cùng... 6.3. Các con đường phân giải gluxit ở vi sinh vật 6.3.1. Con đường phân giải trước pyruvat Tất cả các loại gluxit trước sau rồi sẽ được phân giải. Glucozơ là loại được sử dụng dễ dàng nhất hoặc là có sẵn trong môi trường nuôi cấy hoặc là tạo ra khi phân giải các polisaccharit. 6.3.2. Sự chuyển hóa sau pyruvat Ở các vi sinh vật hiếu khí hoàn toàn thì các hợp chất 3 cacbon này sẽ được - 55 - oxi hóa đến cùng để tạo ra CO2 và H2O; còn nếu pyruvat được các vi sinh vật hoạt động kị khí sử dụng, thì tùy thuộc vào hệ enzym của từng loài mà có các sản phẩm lên men khác nhau. * Hô hấp hiếu khí, chu trình tricacboxylic (chu trình Krebs) Ở vi sinh vật, người ta đã tìm thấy nhiều kiểu hô hấp hiếu khí: - Hô hấp hiếu khí bắt buộc (oxi hóa hoàn toàn) - Hô hấp hiếu khí không hoàn toàn (oxi hóa không hoàn toàn) - Hô hấp vi hiếu khí (oxi hóa ở thế oxi hóa thấp, nồng độ oxi phân tử thấp) - Hô hấp hiếu khí tùy nghi (khi có oxi phân tử thì vi sinh vật hô hấp hiếu khí, khi không có oxi phân tử thì chúng tiến hành lên men hoặc hô hấp kị khí-hô hấp nitrat hoặc hô hấp sunfat). 6.4. Sự chuyển hóa các hợp chất protein 6.4.1. Phân giải các hợp chất protein Các protein phức tạp lúc đầu phải được phân giải ở ngoài tế bào nhờ enzym ngoại bào để tạo thành những đoạn ngắn hơn. Các đoạn polipeptit ngắn và oligopeptit được tế bào hấp thụ và phân giải trong tế bào để thành các axit amin nhờ peptidaza. Những axit amin này hoặc là được tế bào sử dụng để tổng hợp nên protein của chính tế bào hoặc là đi vào con đường chuyển hóa các chất của tế bào để tiếp tục được khử amin. Nhiều vi sinh vật phân giải protein là tác nhân gây thối rữa, chúng cần tiết ra ngoài tế bào các loại proteinaza hoặc proteaza. Nhiều vi sinh vật có khả năng sử dụng axit amin, purin và pyrimidin. Các giống vi sinh vật gây thối rữa tạo ra nhiều proteinaza ngoại bào. 6.4.2. Sự tổng hợp protein Sự tổng hợp protein đã được nói rõ trong các giáo trình sinh hóa, di truyền học. Tuy nhiên với những thành tựu gần đây, sơ đồ này có thay đổi chút ít: ADN Phiên mã (Transciption) Phiên mã ngược (Transcriptase reverse) ARN Dịch mã (Traduction) ProteinADN ARN Protein Phiên mã (Transciption) Phiên mã ngược (Transcriptase reverse) ADN Dịch mã (Translation) r t i - 56 - 6.4.3. Sự chuyển hóa hợp chất cacbon ở vi sinh vật cổ (Archaea) + Các vi sinh vật sinh metan (methanogen): Những vi sinh vật này có khả năng hình thành metan từ cacbonate. Chúng lấy năng lượng cho hoạt động sống của mình từ quá trình oxi hóa kị khí các hợp chất khoáng hay các hợp chất hữu cơ đơn giản như axit formit hat một số axit béo bậc cao. + Các vi sinh vật ưa mặn (Halophil): Các vi sinh vật Halobacterium và Halococcus là những vi sinh vật cổ sống ở biển hiếu khí bắt buộc có hệ thống quang hợp đơn giản nhờ vào Bacteriorhodopsine, chính sắc tố quang hợp này đã hình thành sắc đỏ của các miền biển mặn. + Các vi sinh vật ưa nhiệt và axit (Thermo.acidophil): Những vi sinh vật này sống vừa ở nhiệt độ cao (từ 80-900C hay hơn nữa) và vừa ở pH axit khoảng 2-3. Các loại Thermoproteales kị khí là những chủ nhân đặc biệt của nguồn nước nóng chứa lưu huỳnh, chúng khử lưu huỳnh nhờ các chất hữu cơ làm nguồn electron để tạo thành nước. 6.5. Sơ đồ khái quát các quá trình lên men từ pyruvat Lên men là một quá trình oxi hóa sinh học, trong đó chất nhận hydro cuối cùng là chất hữu cơ. Hợp chất được oxi hóa có thể giữ 2 chức năng; đồng thời là nguồn năng lượng và chất nhận electron. Hình 6.1. Các con đường lên men chính từ pyruvat - 57 - 6.6. Lên men hỗn hợp các axít hữucơ Lên men hỗn hợp các axit hữu cơ chủ yếu do vi sinh vật đường ruột gây ra. Họ vi khuẩn đường ruột (Enterobacteriaceae) theo Brenner (1992) bao gồm 29 giống, 107 loài và khoảng 50 loài đang được định loại. Ở đây chia thành 2 nhánh: những vi khuẩn axetoin-(âm) và những vi khuẩn axetoin + (dương). 6.7. Lên men butyric và axetonobutylic Quá trình lên men này do Clostridium gây ra là chủ yếu, chúng là tác nhân quan trọng của sự phân giải kị khí các hợp chất cacbon trong tự nhiên. Các loài clostridium lên men kị khí với nhiều sản phẩm và con đường khác nhau tùy theo cơ chất sử dụng. Sự lên men glucozơ do Clostridium butyricum và C. acetobutylicum có thể coi là quá trình lên men điển hình của giống Clostridium. Sản phẩm đặc trưng của quá trình lên men butyric là: axit butyric, axit axetic, CO2 và H2. Sản phẩm đặc trưng của quá trình lên men axetonobutylic đi từ glucozơ là: Butanol, axit butyric, axeton và 2-propanol. Sự tăng dần độ axit trong quá trình lên men dẫn đến sự tổng hợp một loại enzym axeto-axetat decacboxylaza, enzym này làm tăng sự tích lũy axeton và butanol. 6.8. Lên men lactic 6.8.1. Khái niệm chung Lên men lactic là quá trình chuyển hóa sinh học kị khí các hợp chất đường thành axit lactic (chủ yếu) và một số sản phẩm khác nữa. 6.8.2. Tác nhân lên men lactic Nhóm vi khuẩn lactic đã được xác định bởi ORLA-JENSEN (1919), bao gồm giống có đặc tính chung là lên men gluxit thành axit lactic. Lên men lactic đồng hình là quá trình lên men mà sản phẩm hầu như chỉ có axit lactic. Lên men lactic dị hình là quá trình lên men, ngoài axit lactic còn có các sản phẩm khác như axit axetic, ethanol, CO2... Tất cả những vi khuẩn lactic đều có đặc điểm chung là: a. Đó là những vi khuẩn gram dương, nói chung là bất động, không sinh - 58 - bào tử, catalaza âm, oxydaza âm, nitratoreductaza âm. b. Khả năng sinh tổng hợp nhiều hợp chất cần cho sự sống của những vi khuẩn này rất yếu, cho nên chúng là những vi sinh vật đa khuyết dưỡng đối với nhiều axit amin, đối với nhiều bazơ nucleic, nhiều loại vitamin... không có khả năng tổng hợp nhân hem của các porphyrine, bình thường chúng không có cytochrome. c. Do đó, chúng là những vi khuẩn kị khí tùy nghi, vi hiếu khí, là loại cơ thể độc nhất có khả năng hiếu khí cũng như kị khí. 6.8.3. Cơ chế của quá trình lên men lactic Phương trình tóm tắt của quá trình lên men lactic đồng hình từ glucoza có thể viết là: C6H12O6 2C3H6O3 + 136 kj (32,4 Kcal) Đường được vi khuẩn lactic lên men chủ yếu thành axit lactic. Khi lên men đồng hình, đường sẽ đi theo con đường EMP để biến thành axit lactic, còn khi lên men lactic dị hình thì con đường Pentosophotphat sẽ được sử dụng để hình thành lactat, ethanol và axetat. 6.8.4. Ứng dụng của quá trình lên men lactic - Sử dụng vi khuẩn lactic để muối chua rau, quả, ủ chua thức ăn gia súc - Sử dụng vi khuẩn lactic để sản xuất sữa chua (yaourt) - Sử dụng vi khuẩn lactic để sản xuất axit lactic - Tác dụng gây hại của vi khuẩn lactic Bia, rượu vang, nước ngọt bị nhiễm vi khuẩn lactic sẽ gây hiện tượng vẫn đục, bị chua. Trong các thiết bị lên men đôi khi xảy ra những điều kiện bất lọi cho sự phát triển của nấm men, nhưng lại thuận lợi cho sự phát triển của vi khuẩn lactic, do đó làm hỏng cả một quá trình lên men rượu, cho ra rượu kém phẩm chất. 6.9. Lên men etylic 6.9.1. Khái niệm chung Lên men rượu là một quá trình sinh hóa phức tạp cần có sự tham gia của nấm men hoặc một số vi sinh vật khác. Trong quá trình lên men rượu, đường - 59 - được biến đổi thành rượu etylic và CO2. Quá trình lên men rượu kèm theo sự hình thành các sản phẩm, đồng thời giải phóng năng lượng (117,6 kJ). Trong phản ứng lên men, đường được chia cắt thành các hợp chất có mạch cacbon đơn giản hơn. Lên men rượu là quá trình vi sinh vật học đã được con người sử dụng từ thời xưa, nhưng bản chất hóa học của nó đến nay mới dần dần sáng tỏ. 6.9.2. Tác nhân của quá trình lên men etylic Tác nhân chính của quá trình lên men rượu là các loại nấm Saccharomyces (viết tắt là S). Các nấm men Saccharomyces thuộc lớp Ascomycetes hình thành bào tử hữu tính trong các túi. Nấm men có thể đơn tản (homothallic) hoặc dị tản (heterothallic), ở trạng thái đơn bội (haplophase) hoặc (và) lưỡng bội (diphophase). Các loài thường dùng trong lên men rượu là: 1. Saccharomyces cerevisiae 2. S. ellipsoides nảy chồi liên tục nên hình thành hệ sợi giả, nấm men của rượu vang nho. 3. S. carlsbergensis, nấm men này còn có tên gọi là S. uvarum, đây là loại nấm men chìm, thường dùng để sản xuất loại bia vàng. 6.9.3. Cơ chế hóa học của quá trình lên men Phương trình tổng quát của quá trình lên men rượu có thể viết: C6H12O6 2C2H5OH + 2CO2 + 113,4kj Phương trình giai đoạn cuối cùng là: CH3CHO+ NADH + H+ CH3CH2OH + NAD+ Thật ra phản ứng của quá trình lên men rượu rất phức tạp, qua hơn 10 phương trình phản ứng khác nhau với sự tham gia của nhiều hệ enzym xúc tác, kết quả cuối cùng cho ta rượu etylic, CO2, và một số sản phẩm khác. 6.9.4. Ứng dụng của quá trình lên men rượu a. Sản xuất công nghiệp rượu etylic b. Sản xuất bia c. Nấm men rượu làm nở bột mì - 60 - d. Sản xuất sinh khối nấm men, sản xuất protein đơn bào e. Sử dụng nấm men trong sản xuất vitamin và enzym f. Nấm men được dùng trong công nghệ ADN 6.10. Lên men metan Sự lên men metan là quá trình phân giải kị khí các chất hữu cơ (có thể từ CO2) trong nước thải, chất thối rữa trong các hầm kín hay thiết bị xử lí nước thải để tạo chất khí metan và CO2. Người ta tính rằng có đến 50-80% chất hữu cơ của bùn được chuyển thành khí sinh học (Biogaz), trong đó 55-70% là metan, 30- 40% là CO2. Quá trình hình thành metan từ các chất hữu cơ có thể chia làm 4 giai đoạn: 1. Pha 1: thủy phân các hợp chất cao phân tử để hình thành các loại đường, các axit béo, các axit amin, pha thủy phân xenluloza, kitin và nhiều hợp chất khác gây ra bởi các giống chủ yếu là Clostridium, Ruminicoccus và Bacteroides. 2. Pha lên men (theo nghĩa rộng) để hình thành các loại axit cacboxylic khác nhau và các loại rượu. 3. Pha hình thành axit axetic (acetogene) kị khí, và axit focmic, hydro, ở đây chủ yếu do các vi sinh vật metan: Metanobacillus, Desulfovibrio, Clostridium. Pha thủy phân axit pyruvic theo sơ đồ sau: 2pyruvat +2H2O 2axetat +2CO2 +2H 4. Pha biến đổi axit axetic hay là pha hình thành metan pha này có thể xảy ra theo nhiều cách khác nhau. * Các vi sinh vật cổ (Archaea) sinh metan Những vi sinh vật cổ này có thể hình thành metan từ CO2. Lên men metan còn xảy ra trong dạ cỏ của động vật nhai lại, tuy nhiên metan ở đây không được sử dụng. Cơ chế của quá trình này cho đến nay có nhiều chỗ còn chưa rõ, nhưng các động vật ăn cỏ đã nhờ quá trình này để cung cấp các chất cần thiết cho đời sống của chúng. 6.11.Tóm tắt các quá trình lên men chính Lên men Vi sinh vật gây lên men Tóm tắt cơ chế, sản phẩm Ghi chú - 61 - Rượu ethanol Saccharomyces cerevisiae Sac.ellipsoids Sac.carlsbergebsis Zymomonas mobilis Một số nấm mốc C6H12O6 2C2H5OH + 2CO2 + 113,4kj Tỉ lệ các sản phẩm ở Saccharomyces: Ethanol: 48,4% CO2: 46,6% Glyxerol: 3,3% Axit xuccinic: 0,6% Sinh khối: 1,2% pH 4,5 Đường có thể lên men Kị khí T0: 25-330C Lượng men giống 0,26% Lactic *Lactic đồng hình: Streptococcus lactis Pediococcus *Lactic dị hình: Leuconostoc Lactobacillus Bìidobacterium Ngoài ra còn một số nấm mốc, vi khuẩn. *Lên men malolactic Leuconostoc oenos và 1 số vi khuẩn khác C6H12O62C3H6O3 + 136kj Trong lên men đồng hình: 1mol lactoza 4lactat+ 5ATP.(2ATP/1Glu) Trong lên men dị hình 1mol lactoza3lactat+ 4ATP.(1ATP/1Glu) Axit hữu cơ axit (axit xitric, axetic...axit malic) - Lên men do Bifidobacterium khác với lên men do vi khuẩn lactic là ở chỗ chúng sinh ra 1 số lớn axit axetic so với axit lactic (3:2) - Lên men lactic đồng hình thì không cho ra CO2, khác với dị hình. - Môi trường giàu axit hữu cơ như axit malic, xitric...quá trình xảy ra sau lên - 62 - men vang Hỗn hợp axit hữu cơ và Butanediol Vi khuẩn họ Enterobacteriaceae (E.coli, Klebsiella, Aerobacter) Glucoza Ethanol +axetat +lactate+ xaccinat +CO2+ H2 Glucoza Butanediol + ethanol+ focmat +lactate +xuccinat +Cl2 pH axit yếu Propionic Propionibacterium (con-đường Xuccinat) Clostridium (con đường Acrylate) và một số vi sinh vật khác glucoza axit propionic+ axit axetic +CO2+ H2O (3lactat2propironat + axetat+ CO2+ 1ATP) Kị khí không bắt buộc Butyric và axeton butylic Cl. Butyricum Cl.pasteurianum Cl.acetobutylicum Glucozaaxetat+ butyrat+ CO2 +H2(3ATP/glucoza) Glucozabutanol+ axetol+ H2+CO2 (2ATP/glucoza) Focmic Vi khuẩn đường ruột Glucoza axit focmic, xuccinic... HCOOHCO2+H2 Metan Metanobacterium Metanococcus Metanosarcina CO2 +4H2CH4+ 2H2O (-32,4 kcal) 4CH3OH 3CH4 + CO2+ 2H2O - 63 - CÂU HỎI VÀ BÀI TẬP 1. Điền vào chỗ dấu chấm thuật ngữ (tập hợp từ) phù hợp nhất: a. Nếu ti thể bị thủng hoặc nứt, quá trình oxi hóa .......................... xảy ra, từng mảnh ti thể .......................... thực hiện hô hấp oxi hóa, vì ........................................ tạo ra một gradien H+. b. Khi oxi hóa hoàn toàn glucozơ ở vi sinh vật có aldolaza, sơ đồ các bước chính có thể viết là .......................... 2. Một số loài Pseudomonas là vi sinh vật hiếu khí bắt buộc, nhưng chúng lại có thể phát triển ở đáy bình chứa môi trường bán lỏng có nitrát. Giải thích. 3. Ribozơ có thể được photphorin hóa và chuyển thành Ribulozơ – 5 – photphát (Ru – 5 – P). a. Kể những sản phẩm của sự lên men lactic dị hình từ đường Riboza. b. Trong quá trình lên men này có bao nhiêu ATP được tạo thành từ một phân tử Ribozơ. 4. Tại sao phần lớn vi sinh vật lại thích thực hiện con đường EMP và chu trình axit tricacboxylic hơn là con đường pentozophotphat? 5. Nêu sơ đồ vận chuyển electron và prôton trong hô hấp ở vi sinh vật nhân sơ và vi sinh vật nhân chuẩn? 6. Có gì khác nhau giữa photphorin hóa cơ chất và photphorin oxi hóa? 7. Giải thích vì sao một vi sinh vật phát triển được trên môi trường chứa các axit amin nhưng không có đường. Nói ngắn gọn làm thế nào vi sinh vật có thể tổng hợp được các loại đường pentozơ và hecxozơ cần cho chúng?  - 64 - Chương 7: VI KHUẨN QUANG HỢP VÀ VI KHUẨN CỐ ĐỊNH NITƠ Mục tiêu Sinh viên cần hiểu được tính đa dạng của các cơ thể và quá trình quang hợp ở VSV, hiểu được vai trò cố định nitơ phân tử của các nhóm VSV, cơ chế hiện biết của sự cố định nitơ. Vận dụng kiến thức để giải thích các biện pháp sử dụng phân vi sinh trong trồng trọt và xử lí môi trường. 7.1. Vi khuẩn quang hợp 7.1.1. Các nhóm chính của vi khuẩn quang hợp Ba kiểu sinh lí của vi khuẩn quang dưỡng Kiểu quang hợp Sắc tố quang hợp Hợp chất biến đổi năng lượng Chất cho electron Nguồn cacbon I. Quang hợp hiếu khí (Cyanobacteria) Diệp lục a NADPH ATP H2O CO2 II. Quang hợp kị khí 1. Vi khuẩn tía S0 2. Vi khuẩn lục S0 a.Chlorobiaceae b.Chloroflexaceae c.Heliobacteria Khuẩn diệp lục a,b Kdl a,c,d,e Kdl a,c Kdl g ATP NADH, ATP ATP ATP,NADH H2, S2-, S2O32- Như trên S2-, S2O32- Chất hữu cơ CO2 hay/và chất hữu cơ CO2 CO2 hay/và chất hữu cơ Chất hữu cơ III.Quang hợp kị khí (phương thức phụ) Vi sinh vật cổ Halobacteria Bacteriorhodopsin ATP Chất hữu cơ Chất hữu cơ 7.1.2. Quang photphorin hóa vòng và không vòng Trong quang hợp hiếu khí có hai loại trung tâm phản ứng PSII và PSI. Hệ quang hợp II làm chức năng quang phân li nước (2H2O phân giải thành 4proton, - 65 - 4electron và một phân tử oxi). Trong quang hợp kị khí chỉ có PSI tham gia với một dòng electron vận chuyển vòng, còn trong quang hợp hiếu khí có sự tham gia PSII, PSI cùng hoạt động dịch chuyển electron từ H2O đến NADP+ đồng thời tạo ra ATP, NADPH và oxi. Quá trình quang hợp ở vi khuẩn diễn ra ở tilacoit. Ở đây có sự tham gia của PSI (đối với vi khuẩn tía, lục) hay cả PSII, PSI cùng tham gia (đối với quang hợp ở lục lạp, vi khuẩn lam). 7.1.3. Sắc tố quang hợp ở vi khuẩn Sở dĩ vi khuẩn lam có cơ chế quang hợp khác với vi khuẩn tía, lục là do chúng có diệp lục a (b), phycobiline (sắc tố hỗ trợ), còn các vi khuẩn quang hợp kị khí lại có khuẩn diệp lục (a,b,c,d,e, tùy loài). 7.1.4. Sự tiến hóa của quá trình quang hợp ở vi khuẩn Các vi khuẩn quang hợp xếp thứ tự từ tiến hóa cao đến tiên hóa thấp hơn là: 1. Quang hợp hiếu khí: ở thực vật, tảo lục và vi khuẩn lam 2. Quang hợp kị khí: vi khuẩn lưu huỳnh màu tía (như Charomatium) 3. Quang hợp không thải oxi: vi khuẩn lục có lưu huỳnh S2O3- + 2H SO3= + H2S 2H2O + CO2 (CH2O) + O2 + H2O Diệp lục a (b) Phycobiline 2H2S + CO2 (CH2O) + 2S + H2O Kdl a, b 2S + 5H2O + 3CO2 3(CH2O) + 2SO4H2 Hoặc 2H2S + CO2 (CH2O) + 2S + H2O Kdl a,c,d (e) - 66 - 7.1.5. Quang hợp kị khí không lưu huỳnh: như Rhodospirillum Xét sự tiến hóa của quá trình và các cơ thể tham gia tổng hợp gluxit trên 3 bình diện chủ yếu: 1.Chất cho electron (H2O, H2S, S, H2...) 2. Giải phóng hay không giải phóng oxi phân tử, từ đó thúc đẩy các cơ thể hiếu khí khác. 3. Nguồn năng lượng phục vụ cho tổng hợp từ năng lượng ánh sáng hay các phản ứng hóa học. 7.1.6. Chu trình cacbon tự nhiên Cacbon tồn tại dưới dạng oxi hóa như CO2, các hợp chất cacbonat và hydrogenocacbonat dưới các đại dương, các ao hồ nước ngọt. Sự biến đổi CO2 thành các hợp chất hữu cơ nhờ quá trình khử được thực hiện nhờ hoạt động quang hợp của cây xanh (phần chủ yếu) và của vi tảo, của vi khuẩn quang hợp. Sự biến đổi các hợp chất cacbon hữu cơ trở về trạng thái vô cơ là nhờ quá trình oxi hóa, đó chính là quá trình hô hấp. Trong chu trình này có vai trò quan trọng của vi sinh vật, các hợp chất hữu cơ trong cơ thể động vật, thực vật và sau khi chết được tích lại ở đất. Có rất nhiều vi sinh vật đặc biệt, cả các loài hiếu khí và kị khí có thể tham gia vào sự phân giải các hợp chất trên. 7.2. Vi sinh vật cố định nitơ 7.2.1. Các nhóm vi sinh vật cố định nitơ phân tử Quá trình cố định nitơ khí quyển là quá trình sinh hóa đặc biệt riêng của một số vi sinh vật sống cộng sinh với thực vật trong các nốt sần hoặc sống tự do ở trong đất, nước. Có thể xếp chúng thành 3 nhóm lớn: 2H2 + CO2 (CH2O) + H2O Hoặc Hợp chất hữu cơ khử + CO2 (CH2O) +HC hữu cơ oxi hóa + H2O Kdl a - 67 - -Vi sinh vật cộng sinh, chủ yếu thuộc về họ vi khuẩn nốt sần (Rhizobiaceae) -Vi khuẩn sống tự do gồm rất nhiều loại khác nhau (hiếu khí và kị khí) -Vi khuẩn lam. a. Vi khuẩn nốt sần (Rhizobiaceae) ở rễ các cây bộ đậu Methylococcus Bradyrhizobium và nốt sần trên rễ Rhizobium và nốt sần trên rễ Hình 7.1. Các dạng vi khuẩn nốt sần b. Vi khuẩn sống tự do cố định đạm gồm nhiều nhóm - 68 - Moraxella Chromobacterium Acinetobacter Hình 7.2. Các dạng vi khuẩn tự do cố định đạm 7.2.2. Cơ chế của quá trình cố định đạm Quá trình cố định nitơ phân tử là một quá trình khử liên tục N2 sản phẩm đầu tiên có thể thu được là NH3, nếu công nhận trong quá trình này có sự vận chuyển hai điện tử, thì các sản phẩm trung gian của nó phải là diimit và hydragin. Quá trình cố định nitơ phân tử được xúc tác bởi hệ enzym nitrogenaza. 7.2.3. Ứng dụng vi sinh vật cố định đạm Sử dụng vi khuẩn cố định đạm chủ động làm giàu nitơ cho đất trở nên phổ biến và trên qui mô công nghiệp. - 69 - CÂU HỎI VÀ BÀI TẬP 1. Viết phương trình tổng quát của quang hợp, chỉ rõ các chất khử trong trường hợp vi khuẩn lam, vi khuẩn Sº tía, lục và vi khuẩn tía, lục. 2. Hệ PSII khác hệ PSI như thế nào về con đường vận chuyển electron, về sắc tố quang hợp. 3. Tại sao nói quang hợp và hô hấp hiếu khí là hai quá trình ngược nhau? 4. Hãy cho định nghĩa ngắn gọn đối với mỗi thuật ngữ: Khử đồng hóa nitrat, khử dị hóa nitrat, nitrat hóa, phản nitrat hóa, cố định nitơ phân tử, nitrogenaza, bacterioid, vùng rễ (Rhizosphere), nốt sần, nốt rễ (myconhize).  - 70 - Chương 8: ĐẠI CƯƠNG VỀ BỆNH TRUYỀN NHIỄM VÀ MIỄN DỊCH Mục tiêu Sinh viên cần hiểu được về bệnh truyền nhiễm, độc tố và độc lực của VSV gây bệnh, cơ chế đề kháng của cơ thể chủ, các loại miễn dịch. Sinh viên phân biệt được kháng nguyên và kháng thể, hiểu được cơ chế đại cương tác động của kháng nguyên và kháng thể; có kỹ năng tìm hiểu môi trường và phòng chống VSV gây bệnh. 8.1. Hệ vi sinh vật của người và động vật 8.1.1.Hệ vi sinh vật trên da và niêm mạc Trên da sinh sống chủ yếu các giống Corynebacteria, Micrococcus, Streptococcus không làm tan máu (St. aureus), các Bacillus, các vi khuẩn dạng coli (Propionibacterium acnes). Ở miệng và phía trên đường hô hấp, một hệ vi sinh vật đặc trưng xuất hiện nhanh chóng sau khi được sinh mấy giờ, trước hết là Streptococcus hemoliticus, sau đó là Neisseria, Staphylococcus, Corynebacteris, có thể còn thấy Lactobacillus, Actinomycetes và một số dạng nấm men. 8.1.2. Hệ vi sinh vật trong đường tiêu hóa Ở ruột lại là nơi phát triển rất phong phú hệ vi sinh vật tùy theo lứa tuổi, ở trẻ bú sữa mẹ thì chủ yếu là hệ vi khuẩn lactic như các giống Stretococcus và Bifidobacterium bifidum (L.bifidus). 8.1.3. Hệ vi sinh vật trong các đường cơ quan sinh dục Lacto bacillus đã xuất hiện ở âm đạo và lưu trú ở đây trong nhiều tuần. Các vi khuẩn kị khí gram dương âm đạo và ổn định trong thời kì kinh nguyệt. Ở đàn ông, hệ vi sinh vật thường ổn định hơn và thấy chủ yếu là Staphylococcus, Micrococcus, Stretococcus và Corynebacterium, chúng có nhiều trong tinh dịch. 8.2. Quá trình nhiễm vi khuẩn gây bệnh (nhiễm trùng) Khái niệm: bệnh truyền nhiễm dùng để chỉ toàn bộ quá trình sinh học diễn ra khi lan truyền xâm nhập và phát triển của vi sinh vật gây bệnh trong cơ thể chủ, làm thay đổi hoạt động sinh sống bình thường. - 71 - Bí mật của bệnh truyền nhiễm đã được vi sinh vật học và y vi sinh vật học phát hiện, do 3 yếu tố sau đây quyết định: - Trạng thái cơ thể - Vi sinh vật gây bệnh - Hoàn cảnh sống 8.3. Sự đề kháng của cơ thể chủ 8.3.1. Cơ chế đề kháng Ta biết cơ thể không thụ động trước sự tấn công của vi sinh vật gây bệnh, cơ thể có nhiều cách ngăn trở sự chui qua, ức chế sự nhân lên của các vi sinh vật gây bệnh trong các mô, các cơ chế đó là: - Cơ chế không đặc hiệu - Cơ chế đặc hiệu 8.3.2. Các tế bào lympho Cơ chế đề kháng đặc hiệu của cơ thể gồm hoạt động của tế bào lympho (T và B) và các kháng thể, cơ chế đặc hiệu có thể miễn dịch tế bào (cơ chế tế bào) hay miễn dịch thể dịch (cơ chế thể dịch). 8.3.3. Kháng nguyên và kháng thể 8.3.3.1. Kháng nguyên (Antigen-KN) Kháng nguyên là chất hóa học có khả năng gây ra trong cơ thể đáp ứng miễn dịch. Kháng nguyên là các chất lạ như các loại protein, các chất độc thực vật (abin, robon, crotin, rixin, curxin...), các chất độc động vật (nọc rắn, nọc ong, nọc rết), các loại enzym, các chất có khối lượng phân tử lớn hơn 10.000 Da. Các kháng nguyên có thể được xếp vào 2 lớp: - Các protein và các polipeptit lớn hơn octopeptit. - Các polisaccharit. Mức độ kháng nguyên của một phân tử phụ thuộc rất nhiều vào độ gần gũi của cá thể nhận và cơ thể sinh ra kháng nguyên. 8.3.3.2. Kháng thể (Anticorp, Antibody-KT) Như trên đã nêu, miễn dịch có thể là miễn dịch thể dịch hoặc miễn dịch tế bào. Các kháng thể là những protein được tổng hợp nhờ các tế bào lympho. Các - 72 - kháng thể có thể tồn tại dưới dạng các phân tử tự do lưu chuyển trong dịch thể của cơ thể miễn dịch hoặc dưới dạng phân tử nằm trong màng tế bào chất của các tế bào lympho B. Các kháng thể tự do được tiết ra nhờ các tế bào biệt hóa của tế bào lympho B. Các kháng thể cố định, loại kháng thể gắn trên màng tế bào chất của các tế bào lympho, trong các tế bào lympho T, chúng hình thành loại miễn dịch tế bào, mà tầm quan trọng của nó đã được khám phá trong 3 thấp kỉ vừa qua. Miễn dịch tế bào không có sự tham gia của kháng thể tự do. 8.3.3.3. Cấu trúc phân tử của các kháng thể (KT) Tất các các kháng thể (KT) là loại protein miễn dịch thuộc họ globulin và viết tắt là Ig (immunoglolubin G). Các Ig là những glucoprotein có ít gluxit. Các immunoglolubolin thường có dạng chữ Y. 8.3.4. Cơ chế tác động của kháng nguyên, kháng thể Cấu trúc phân tử của kháng thể (KT) giúp nó có thể kết hợp với 2 phân tử kháng nguyên (KN) khác nhau. Mặt khác, mỗi phân tử KN với các điểm xác định KN khác nhau của nó lại có thể kết hợp với rất nhiều phân tử KT. Khi các phân tử KT tự do cùng có mặt với KN tương ứng thì chúng tạo ra phản ứng kết tủa (precipitation). Khi các KN được mang trên bề mặt của tế bào (vi khuẩn, hồng cầu,...) các phân tử KT tương ứng mang các thụ thể bề mặt này, thì thấy sự ngưng kết (agglutination) của các tế bào KN. Các hình thức tác động của KT rất đa dạng, các hình thức này có thể là: - Trung hòa độc tố do kết tủa. - Ngưng kết các vi khuẩn hay các loại tế bào khác. - Làm tan các vi khuẩn khi có mặt của bổ thể trong huyết thanh bình thường. - Dẫn dụ và giao nộp các vi khuẩn cho quá trình thực bào của các đại thực bào và tế bào bạch cầu nhờ quá trình biến dụ (opsonization) của các kháng thể. Sự kết hợp giữa kháng nguyên (KN) và kháng thể (KT) để hình thành tổ hợp giữa KN và KT làm bất hoạt các KN có thể bằng nhiều con đường được sơ - 73 - đồ hóa. 8.3.5. Miễn dịch và bệnh lí miễn dịch 8.3.5.1. Miễn dịch tự nhiên (miễn dịch của loài) Loại miễn dịch này do bản thân loài xác định, phụ thuộc vào các nhân tố tế bào có mặt ở trong máu và trong các mô khác nhau, chẳng hạn như các nhân tố protein có mặt trong máu và trong dịch thể. 8.3.5.2. Miễn dịch thu được (riêng đối với từng cá thể) Miễn dịch thu được chống lại tác nhân gây bệnh nhất định không chỉ là đặc hiệu đối với tác nhân gây bệnh này mà còn được kéo dài. Sự kích thích của kháng nguyên đối với cơ thể cảm ứng tổng hợp các kháng thể tương ứng diễn ra trong một thời kì có thể trong thời gian rất dài có bệnh truyền nhiễm, hệ thống miễn dịch bao gồm cả những tế bào ghi nhớ miễn dịch, chính những tế bào này là cơ sở của phòng bệnh miễn dịch. Sự kết hợp của KN và KT có tính đặc hiệu cao, nó phụ thuộc vào sự tương tác của cấu trúc phân tử của KN và KT tương ứng, mối liên hệ giữa KN và KT giống như kiểu liên kết giữa enzym và cơ chất, là những mối liên hệ yếu, không đồng hóa trị như mối liên kết hydro, liên kết ion, liên kết Van derwal, liên kết kị nước. 8.3.5.3. Vacxin và huyết thanh miễn dịch L. Pasteur đã phát hiện: các chủng vi khuẩn gây bệnh đã giảm động lực có thể tạo miễn dịch đối với người được tiêm chủng. Từ đó kĩ thuật chế vacxin và chủng vacxin đã được sử dụng rộng rãi trong y học và phòng bệnh. Sự tiêm huyết thanh miễn dịch trong có chứa các kháng thể lấy từ một cơ thể truyền vào một cơ thể khác là một phương pháp tạo miễn dịch thụ động trrong cơ thể được tiêm huyết thanh miễn dịch (kháng huyết thanh). 8.3.5.4. Bệnh lí miễn dịch (immunopathology) Hệ thống miễn dịch hoạt động trục trặc có thể làm tăng khả năng mắc bệnh, trong đó có những bệnh có thể dẫn đến tử vong. Người ta phân biệt thành các loại: - Bệnh thiếu hụt miễn dịch có thể do kết quả di truyền hoặc ngẫu nhiên (do - 74 - bị chiếu xạ) hay do virút. - Các bệnh tự miễn dịch (autoimmunity) hiếm có, nhưng thường thấy hơn khi cơ thể về già. Loại bệnh này là do tổng hợp kháng thể chống lại với chính các cơ quan cá thể. 8.4. Diệt vi khuẩn gây bệnh bằng các chất kháng sinh Khi cơ thể đang bị vi sinh vật gây bệnh tấn công mạnh thì cần sử dụng ngay các biện pháp để ngăn chặn sự nhân lên của chúng, một phương pháp hiệu quả là sử dụng chất kháng sinh thích hợp với liều lượng được thầy thuốc chỉ dẫn. Các chất kháng sinh là những chất hóa học đặc hiệu có nguồn gốc từ hoạt động sống của sinh vật, có khả năng ức chế hoặc tiêu diệt một các có chọn lọc sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật hoặc tế bào sống nhất định, ngay ở nồng độ thấp. Các chất kháng sinh rất đa dạng về hóa học, khối lượng phân tử của chúng ở trong một dải rộng từ 150 đến 5000Da. - 75 - CÂU HỎI VÀ BÀI TẬP 1. Vi sinh vật gây bệnh đặc trưng (BPS) và vi sinh vật gây bệnh cơ hội (BPO) là gì? Vi khuẩn, vi sinh vật và vi trùng là thuật ngữ giống nhau? 2. Trình bày ngoại độc tố và nội độc tố, cho ví dụ bệnh và vi sinh vật gây bệnh. 3.Trình bày miễn dịch dịch thể và miễn dịch tế bào, cho ví dụ. 4. Trình bày miễn dịch tự nhiên và miễn dịch nhân tạo, cho ví dụ. 5. Trình bày kháng nguyên: đặc điểm, cho ví dụ. Hap ten là gì? 6.Trình bày kháng thể: cấu trúc phân tử? 7. Bệnh tự miễn là gì? Cho ví dụ. 8. Các câu sau đúng hay sai, giải thích: a. Nước lã đun sôi 100ºC là đủ để diệt tất cả các mầm vi sinh vật gây bệnh. b. Nước javel (hypochlorit natri) sẽ mất tác dụng nếu lạm dụng thường xuyên. c. Xà phòng là chất diệt khuẩn. d. Vi sinh vật gây bệnh là vi sinh vật ký sinh.  - 76 - Chương 9: ĐẠI CƯƠNG VỀ DI TRUYỀN-BIẾN DỊ Ở VI SINH VẬT Mục tiêu Sinh viên hiểu được khái niệm về vật chất di truyền ở VSV nhân sơ và nhân chuẩn. Hiểu được hiện tượng biến dị, các kiểu biến dị thường gặp ở vi khuẩn và nguyên nhân của biến dị, biết được ba hình thức chuyển vật chất di truyền từ vi khuẩn cho sang vi khuẩn nhận, biết được một số ứng dụng của công nghệ di truyền VSV. Có năng lực tự nghiên cứu, ứng dụng trong giảng dạy và trong đời sống. 9.1. Vật chất di truyền ở vi khuẩn và vi sinh vật nhân chuẩn Các tính trạng ở vi sinh vật thường được chia thành các nhóm chính: 1. Các đặc điểm hình thái ở từng cá thể như hình dạng, kích thước tế bào, ở từng khuẩn lạc phát triển từ một tế bào, sự hình thành màng nhày, hình thức phân chia, cách phân bố cơ quan chuyển động... 2. Các đặc điểm sinh hóa như thành phần thành tế bào, tỷ lệ các bazơ nitơ trong ADN, trật tự nucleotit trong rARN, sắc tố, chất chuyển hóa và chất trao đổi,... 3. Các đặc điểm nuôi cấy như kiểu hô hấp, kiểu dinh dưỡng, phảm ứng với các tác nhân vật lí môi trường, bền vững với các phage... 4. Các đặc điểm miễn dịch như tính kháng nguyên, đặc điểm huyết thanh, khả năng gây bệnh... 9.1.1. Vật chất di truyền ở vi khuẩn Tổ chức vật chất di truyền ở vi khuẩn lúc sắp phân chia chỉ là một phân tử vòng ADN mà người ta gọi là thể nhiễm sắc trần của vi khuẩn dài khoảng 1mm, với khối lượng phân tử khoảng 3.109 daltons, chứa khoảng 4.500.000 bp. Nó bao gồm hai mạch polinucleotit có 2 cực ngược chiều nhau, và được nhân lên nhờ các enzyme ADN-polimeraza, ligaza... Các ADN của vi khuẩn được tổ hợp với các in Mg2+ hoặc Ca2+ và với các protein. Một số protein (protein P) là loại protamin (gắn với spermine hoặc spermidine). Ngoài ra, phần lớn vi khuẩn còn mang các yếu tố ADN di truyền ngoài - 77 - nhân mà người ta gọi là plasmid, hay các ADN của virút từ các phage chuyển vào. Các yếu tố ADN thể nhiễm sắc hay là ngoài thể nhiễm sắc dưới dạng vòng có khả năng nhân đôi độc lập và cách li trong quá trình nhân đôi của vi khuẩn, người ta gọi chúng là các bản sao (replicon). 9.1.2. Vật chất di truyền ở sinh vật nhân chuẩn Vật chất di truyền ở cơ thể nhân chuẩn cấu tạo thành các nhiễm sắc thể và nằm trong nhân. Nhân tế bào nhân chuẩn có màng nhân và lỗ màng nhân, nơi cho đi qua các tổ hợp protein-ARNm. Ngoài vật chất di truyền ở trong nhân, ở vi sinh vật nhân chuẩn còn thấy vật chất di truyền ngoài nhân, bao gồm vật chất di truyền ở ti thể, ở lục lạp (cơ thể quang hợp), ở các plasmid (thấy ở một số nấm men)... 9.2. Đặc điểm của sự chuyển thông tin di truyền từ ADN sang protein ở vi khuẩn và cơ thể nhân chuẩn Sơ đồ chung của quá trình chuyển thông tin từ ADN sang protein có thể tóm tắt như sau: 9.3. Cơ chế sinh hóa của hiện tượng biến đổi ADN Phân tử ADN trong khi nhân đôi phụ thuộc khác nhiều vào các tác nhân lí- hóa của môi trường, các tác nhân này có thể làm biến đổi, sai lệch các phân tử mang thông tin di truyền của cơ thể. Để sửa chữa những tổn thất đó, tế bào đã huy động một hệ thống enzyme sửa chữa. Có 3 cơ chế hiện biết là: ARNm Protein ADN nhân đôi sửa chữa tái tổ hợp Phiên mã ARNmADN nhân đôi sửa chữa tái tổ hợp Phiên mã mã ARNt ARNr Protein Dịch mã ARNmADN nhânđôi sửa chữa tái tổ hợp - 78 - - Sửa chữa bằng cách loại bỏ trong khi nhân đôi ADN. - Sửa chữa bằng cách tái tổ hợp các phân tử ADN. - Sửa chữa khẩn cấp SOS (xem thêm di truyền học đại cương). Hiện tượng đột biến có thể xảy ra một cách tự nhiên, tần số đột biến tăng lên khi có mặt của nhiều tác nhân vật lí và hóa học mà người ta gọi là các tác nhân gây đột biến. Ba khả năng chủ yếu đã được nghiên cứu kĩ: 1. Thay đổi ADN do thay thế bazơ nitơ 2. Thay đổi ADN do thêm vào hoặc bớt đi. 3. Thay đổi ADN do tia tử ngoại. 9.4. Sự tái tổ hợp di truyền và sự truyền các tính trạng ở vi sinh vật 9.4.1. Một số khái niệm Ở vi khuẩn, tế bào sinh sản bằng cách nhân đôi, hiện tượng hình thành “hợp tử” rất hiếm khi xảy ra, trong quá trình đó một phần hoặc gần như toàn bộ bản sao ADN của vi khuẩn A sẽ được chuyển sang vi khuẩn B. Hệ gen của vi khuẩn nhận B gọi là hệ gen nội, trong khi một phần của gen vi khuẩn cho được gọi là gen ngoại. Bản chất và kích thước của gen ngoại rất khác nhau tùy theo từng loại vi khuẩn và tùy trường hợp, phương thức mà nó xâm nhập. Hiện tượng cận tính là hiện tượng kết hợp giới tính bình thường ở các tế bào nhân sơ và một số tế bào nhân chuẩn. Hiện tượng cận tính có thể được thực hiện bằng cách lại hai tế bào, có sự kết hợp giữa 2 bộ gen và hình thành tế bào lưỡng bội nếu có sự hợp nhân. 9.4.2. Biến nạp (Transformation) Biến nạp chỉ những biến đổi tính trạng của vi khuẩn nhận dưới ảnh hưởng của ADN dung dịch xâm nhập vào vi khuẩn này. Những nghiên cứu về sau này đã chứng minh quá trình biến nạp phụ thuộc vào 2 yếu tố: 1. Chủng vi khuẩn và khả năng trở thành vi khuẩn nhận (vi khuẩn khả biến). 2. Đoạn ADN biến nạp và những tính chất của nó. - 79 - Mặc dù xâm nhập vào tế bào nhận có thể là bất kì đoạn ADN biến nạp, nhưng sự tái tổ hợp chỉ xảy ra trong trường hợp ADN biến nạp lấy từ những chủng vi sinh vật gần gũi. Có thể chia quá trình biến nạp thành 5 giai đoạn: 1. Cố định ADN lên tế bào nhận. 2. Sự xâm nhập của ADN biến nạp vào tế bào khả biến. 3. Sự liên kết của ADN biến nạp với đoạn tương đồng của thể nhiễm sắc của tế bào nhận. 4. Sự đồng hóa phân tử ADN ngoại sinh biến nạp vào ADN nội sinh nhờ tái tổ hợp. 5. Sự nhân lên của thể nhiễm sắc đã được đồng hóa. 9.4.3. Tiếp hợp (Conjugation) Người ta cho rằng sự có mặt của yếu tố giới tính F đã xác định sự hình thành ở tế bào vi khuẩn yếu tố tiếp nhận trên bề mặt tế bào này và được gọi là kháng nguyên F có bản chất là polisaccharit. Hợp chất này có vai trò quan trọng trong việc kết đôi và hình thành cầu tiếp hợp, nó tham gia vào việc hình thành lông giới tính. Chính lông giới tính với cấu tạo ống rỗng đã là cầu nối giữa hai vi khuẩn tiếp hợp, mà tế bào “đực” tuồn ADN qua cầu này sang tế bào “cái”. Vi khuẩn nhận (F) không có yếu tố giới tính do kết quả tiếp hợp với tế bào cho (F+) mà có thể thu được yếu tố F để trở thành tế bào có yếu tố giới tính (F+). Tế bào F+ chứa yếu tố F nằm độc lập trong tế bào chất. 9.4.4. Tải nạp (Transduction) Quá trình tải nạp một hoặc một số gen được chuyển từ tế bào cho sang tế bào nhận nhờ một tác nhân trung gian là Bacteriophage mà được gọi là phage tải nạp. Hiện tượng tải nạp được phát hiện lần đầu vào năm 1951. Khi tham gia tải nạp, phage chỉ chuyển một đoạn nhỏ ADN của tế bào chủ, phage tải nạp là phage ôn hòa chỉ chiếm một phần nhỏ (10-5-10-8) của toàn bộ quần thể phage. Có hai dạng tải nạp. Tải nạp không đặc hiệu là loại tải nạp, khi axit nucleic phage có thể gắn vào bất kì đoạn gen nào của tế bào chủ và do đó có thể chuyển bất kì gen nào sang tế bào nhận. Tải nạp đặc hiệu là loại tải nạp - 80 - chuyển những gen xác định của tế bào cho sang tế bào nhận. 9.5. Một số ứng dụng của công nghệ di truyền vi sinh vật 9.5.1. Các tác nhân gây đột biến Trong môi trường sống quanh ta có rất nhiều nhân tố hóa lí, những sản phẩm thải ra của hoạt động công nghiệp và đời sống, những nhân tố tiềm tàng gây ung thư, đang là mối lo ngại khôn lường. Người ta dự tính rằng có khoảng 80% ung thư của người là do tiếp xúc (hấp thụ, hít thở, ăn uống...) với các tác nhân trên. 9.5.2. Công nghệ di truyền Công nghệ di truyền là vũ khí hiệu nghiệm của con người đang và sẽ tạo ra nhiều sản phẩm giá trị. Một trong số đó là sản xuất các loại protein thế hệ mới nhờ vi khuẩn. Gen cho (từ một tế bào nhân sơ hay nhân chuẩn) có thế được tổng hợp trực tiếp bằng con đường hóa học hay gián tiếp từ phân tử mARN và là bản sao chính xác của nó, để có thể đưa vào vi khuẩn nhận, gne này cần được ghép vào một vecto plasmid, gen lai được đồng thời nhân lên khi vi khuẩn phân chia, như vậy là tạo được dòng vi khuẩn mới, sự dịch mã của gen này là giai đoạn cuối cùng làm cho tế bào vi khuẩn nhận sản xuất rất nhanh một loại protein mới lạ. Sản xuất một loại protein bằng công nghệ di truyền bao gồm 5 giai đoạn chủ yếu: - Tổng hợp hoặc chiết một cách tinh khiết một đoạn ADN cho mã hóa loại protein cần. - Kết ghép đoạn ADN lạ này vào một vectơ (plasmid hay phage) tạo ra một ADN tái tổ hợp. - Đưa vectơ đã ghép với gen lạ vào tế bào vi khuẩn nhận. - Tuyển chọn dòng tế bào tái tổ hợp. - Xác định và làm tinh khiết protein được tổng hợp. Ngày nay công nghệ sinh học mà trong đó chủ yếu là công nghệ vi sinh vật và công nghệ di truyền đang hướng tới việc giải quyết nạn ô nhiễm môi trường, việc sản xuất nguồn năng lượng mới nhờ vi sinh vật tái tổ hợp. Khoa học hiện nay có thể thực hiện việc lai bằng cách hợp nhất hai tế bào trần, kĩ thuật bắn gen - 81 - có thể đưa một gen ngoại lai vào tế bào nhận, trong đó tế bào nhận có thể có vị trí chủng loại phát sinh rất xa với cơ thể cho gen ngoại lai... Kĩ thuật PCR có thể nhân nhanh các đoạn ADN mong muốn; người ta có thế đưa gen cố định đạm từ Agrobacterium tumefaciens vào cây nhờ Plasmid Ti, tạo ra được cây cố định nitơ khí quyển... tất nhiên từ những thí nghiệm ra sản xuất còn là một quá trình cần thời gian và công sức của nhiều người. - 82 - CÂU HỎI VÀ BÀI TẬP 1. Người ta cho các thuật ngữ sau: biến nạp, tải nạp, tiếp hợp, tế bào Hfr và các mô tả sau trong di truyền vi khuẩn: a. Kiểu biến đổi gen, trong đó một tế bào nhận tiếp nhận một vài gen từ phân tử ADN tự do trong dung dịch. b. Kiểu chuyển gen từ tế bào cho sang tế bào nhận phụ thuộc vào sự tiếp xúc trực tiếp giữa hai tế bào. c. Kiểu chuyển gen, trong đó một phage được dùng làm một vectơ để mang ADN từ vi khuẩn cho sang vi khuẩn nhận. d. Một tế bào F+ trong đó plasmid F được gắn vào thể nhiễm sắc của tế bào mang. Hãy sắp xếp các thuật ngữ trên đúng vào các hiện tượng được mô tả. 2. Trình bày một số cơ chế của các tác nhân gây đột biến hiện biết và phương pháp tuyển chọn các chủng đột biến. 3. Nêu các enzym chủ yếu tham gia vào quá trình nhân đôi ADN ở E.coli. 4. Nêu sự khác biệt: exon – intron, monocistron – policistron. 5. Lấy ví dụ về đột biến hình thái, đột biến khuyết dưỡng, đột biến đối kháng. 6. Nêu một số thành tựu của công nghệ di truyền và những ứng dụng.  - 83 - PHẦN B. THỰC HÀNH (Sinh viên chuẩn bị trước theo nội dung hướng dẫn trong giáo trình của Nguyễn Thành Đạt (chủ biên), Mai Thị Hằng, Giáo trình Vi sinh học, Nhà xuất bản Đại học Sư phạm, 2007.) Bài 1. Nhập môn 1. Những chỉ dẫn chung. 2. Hướng dẫn một số thao tác và kỹ thuật vô trùng cơ bản trong thực hành vi sinh vật. 3. Các phương pháp khử trùng. 4. Hướng dẫn thực hiện và đánh giá kết quả thí nghiệm bài 1. Bài 2. Quan sát hình thái tế bào vi sinh vật 1. Các phương pháp cơ bản quan sát hình thái tế bào vi sinh vật. 2. Quan sát hình thái một số tế bào vi sinh vật thường gặp. 3. Hướng dẫn thực hiện và đánh giá kết quả thí nghiệm bài 2. Bài 3. Nghiên cứu một số cấu tạo tế bào vi sinh vật 1. Nội dung. 2. Hướng dẫn thực hiện và đánh giá kết quả thí nghiệm bài 3. Bài 4. Môi trường, phân lập và nuôi cấy vi sinh vật 1. Nội dung. 2. Hướng dẫn thực hiện và đánh giá kết quả thí nghiệm bài 4. Bài 5, 6. Nghiên cứu sự chuyển hóa một số các chất dưới tác động của vi sinh vật 1. Mục tiêu. 2. Nội dung. Nghiên cứu một số quá trình lên men của vi sinh vật: a.Xác định khả năng lên men rựou etylic. b.Xác định khả năng lên men Lactic. - 84 - TÀI LIỆU THAM KHẢO [1]. Nguyễn Lân Dũng (chủ biên), Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty, Vi sinh vât học, Nhà xuất bản Giáo dục, 1997. [2]. Nguyễn Thành Đạt (chủ biên), Mai Thị Hằng, Giáo trình Vi sinh học, Nhà xuất bản Đai học Sư phạm, 2007. [3]. Nguyễn Thành Đạt, Cơ sở sinh học vi sinh vật, Tập I, tập II, Nhà xuất bản Giáo dục, 2005. ...................................