Giáo trình Thực hành Vi sinh vật học

nhiệt khô Các hộp petri, ống hút thủy tinh bền với nhiệt có thể được khử trùng bằng phương pháp sấy ở 1700C trong 2 giờ trong tủ sấy. Trong trường hợp này, các ống hút cần được nhét nút bông không thấm nước ở đầu hút. Hộp petri, ống hút, các dụng cụ cần khử trùng khác được gói kín bằng giấy hoặc giấy nhôm trước khi sấy. IV. PHA CHẾ MÔI TRƯỜNG 1. Khái niệm chung Môi trường dinh dưỡng là hỗn hợp gồm các chất dinh dưỡng và các chất có nhiệm vụ duy trì thế oxi hóa khử, áp suất thẩm thấu của tế bào và sự ổn định pH của môi trường. 2. Các yêu cầu cơ bản của môi trường dinh dưỡng Bất kỳ một môi trường dinh dưỡng nào để nuôi cấy vi sinh vật cũng cần đạt được các yêu cầu cơ bản sau đây: - Có đủ chất dinh dưỡng cần thiết - Có độ pH thích hợp - Có độ nhớt nhất định 7 - Hoàn toàn vô khuẩn - Không chứa các yếu tố độc hại 3. Phương pháp làm môi trường 3.1 Nguyên tắc Khi điều chế môi trường, ta dựa trên các nguyên tắc sau đây: - Dựa trên cơ sở nhu cầu về các chất dinh dưỡng và khả năng đồng hóa các chất dinh dưỡng của từng loại vi sinh vật. - Đảm bảo sự cân bằng về áp suất thẩm thấu giữa môi trường và tế bào vi sinh vật nên cần điều chỉnh tỷ lệ và nồng độ các chất trong thành phần môi trường. - Đảm bảo các điều kiện hóa lý cần thiết cho các hoạt động trao đổi chất của vi sinh vật. 3.2 Các bước làm môi trường dinh dưỡng a. Pha chế Cân, đong chính xác từng thành phần của môi trường và pha chế đúng theo trình tự đã hướng dẫn. + Với môi trường lỏng: các chất cân đong xong cho hòa tan vào nước + Với môi trường đặc: là môi trường lỏng có bổ sung thêm agar (1,5 – 2,5%). Cân hóa chất cho hòa tan vào nước, bổ sung lượng nước đủ theo công thức. Cho agar vào, đun sôi và khuấy đều cho đến khi agar vừa tan. b. Làm trong môi trường Môi trường nuôi cấy vi sinh vật – nhất là môi trường lỏng cần phải hoàn toàn trong để dễ quan sát sự phát triển của chúng. Có thể làm trong môi trường bằng những phương pháp sau: + Với môi trường lỏng: người ta lọc qua vải màn nhiều lớp, qua bông thấm nước hoặc qua giấy lọc. + Với môi trường đặc thường lọc qua vải màn 2 lớp hoặc giấy lọc trong điều kiện có phễu lọc nóng. c. Điều chỉnh pH của môi trường Độ pH của môi trường tùy theo đối tượng vi sinh vật nuôi cấy và tùy theo yêu cầu khảo cứu. Vì vậy khi làm môi trường cần điều chỉnh pH cho thích hợp. Muốn điều chỉnh pH của môi trường, người ta dùng HCl, NaOH 0,1N hoặc nồng độ 10%. Cũng có thể dùng các chất khác như H3PO4, H2PO4, H2SO4, KOH. 8 Để kiểm tra pH của môi trường tốt nhất là dùng máy đo pH. Phương pháp này nhanh nhạy và độ chính xác cao. Trong phòng thí nghiệm, người ta thường dùng chỉ thị màu xanh bromotinol (ở pH = 7,3 chỉ thị màu xanh có màu lam lục. Ơ pH  6 có màu vàng, ở pH  7,6 có màu lam lục) hay giấy quỳ để đo pH. Phương pháp này tiện lợi, nhanh nhưng độ chính xác không cao. d. Phân phối môi trường vào dụng cụ Người ta thường phân phối môi trường vào ống nghiệm, đĩa petri, bình tam giác. Nếu là môi trường đặc, cần phải đun cho agar vừa tan rồi mới phân phối vào dụng cụ. Khi phân phối môi trường vào các dụng cụ thì cần phải chú ý: + Đối với ống nghiệm: nếu dùng làm môi trường thạch nghiêng thì lượng môi trường cần được phân phối chiếm ¼ thể tích ống nghiệm. + Nếu dùng làm thạch đứng thì lượng môi trường là 1/2 - 1/3 thể tích ống nghiệm. + Đối với bình cầu hay bình tam giác, lượng môi trường được phân phối chiếm 1/2 - 2/3 thể tích của bình. + Các thao tác phải nhanh, gọn, khéo léo để môi trường không dính lên miệng dụng cụ hoặc nút bông và việc phân phối cần thực hiện xong trước khi môi trường bị đông đặc. e. Khử trùng môi trường Tùy theo tính chất và điều kiện cụ thể của từng loại môi trường mà chế độ và phương pháp khử trùng khác nhau như sau: + Phương pháp Pasteur + Phương pháp Tyndal. + Phương pháp lọc bằng dụng cụ lọc vô khuẩn. + Phương pháp hấp bằng hơi nước bão hòa ở áp suất cao f. Phương pháp làm môi trường đặc - Làm thạch nghiêng Sau khi khử trùng xong, ta lấy các ống nghiệm còn lỏng đặt nghiêng trên thước gỗ hoặc que thủy tinh sao cho thạch trong ống nghiêng tới 2/3 chiều dài của ống. Tuyệt đối không để thạch chạm vào nút bông. Để yên cho đến khi thạch đông đặc. Yêu cầu mặt thạch phải phẳng, nhẵn, không bị đứt (hình 3a) - Làm thạch đứng Cho các ống nghiệm với lượng môi trường đặc chiếm ½ đến 2/3 ống nghiệm. Thạch còn nóng ta để đứng ống thạch vào giá, để yên cho đến khi môi trường nguội và đông đặc (hình 3b). 9 - Đổ thạch vào đĩa petri (hình 4) Trong toàn bộ qui trình đổ thạch vào đĩa petri đều thực hiện trong tủ cấy vô trùng và gồm các thao tác sau: + Mở bao gói giấy các đĩa petri + Tay phải cầm dụng cụ chứa môi trường + Tay trái lấy nút bông ra và hơ miệng bình trên ngọn đèn cồn. + Nghiêng bình và rót nhẹ môi trường vào đĩa petri sau khi tay trái mở hé nắp trên của đĩa + Đậy nắp trên lại, xoay tròn đĩa petri để môi trường được phân phối đều trên mặt đĩa. + Để yên cho môi trường nguội và đông đặc. + Lật ngược hộp cho đáy lên trên. Chú ý: Thao tác đổ thạch phải hết sức khẩn trương và khéo léo để hạn chế sự nhiễm khuẩn. Mặt thạch phải phẳng, nhẵn, có độ dày khoảng 2 mm. Sau 1 – 2 ngày kiểm tra xem môi trường có nhiễm khuẩn không rồi mới sử dụng. Nhớ viết vào nhãn tên môi trường, ngày pha chế. Hình 1: Cách đặt thạch nghiêng (a); Cách đặt thạch đứng (b) Hình 2: Cách đổ thạch vào đĩa petri g. Bảo quản và kiểm tra môi trường Môi trường chưa dùng cần được bảo quản ở chỗ mát, hạn chế tác dụng của ánh sáng, nhiệt độ từ 0 – 50 C và không để môi trường bị khô. Trước khi sử dụng, để kiểm tra độ vô khuẩn của môi trường người ta thường đặt chúng vào tủ ấm 370C, trong 48 – 72h. Sau lấy ra quan sát loại bỏ các môi 10 trường có vi sinh vật phát triển và chỉ sử dụng những ống nghiệm, những đĩa petri có môi trường đạt yêu cầu. 3.3 Pha chế một số môi trường thông dụng a. Môi trường PGA (potato glucose agar): dùng nuôi cấy nấm mốc. - Khoai tây 200g. - Glucose 20 g. - Agar 20g. - Nước cất 1000ml. - pH 6,5 Cách pha chế: - Cân lượng cần thiết các thành phần môi trường đủ cho 1000 ml môi trường PGA - Khoai tây gọt sạch vỏ và rửa sạch, dùng dao cắt thành các lát, nấu sôi rồi lọc lấy nước chiết - Cho glucose vào dịch chiết khoai tây và làm tan hoàn toàn. Bổ sung lượng nước cho đủ theo công thức - Cho agar vào, đun sôi và khuấy đều cho đến khi agar tan hoàn toàn. - Dùng phễu thủy tinh, rót môi trường vào ống nghiệm để làm thạch nghiêng. Đậy ống nghiệm bằng nút bông. - Khử trùng 1 atm/15 phút. - Sau khi hấp vô trùng xong, lấy ra và để nghiêng một góc 20o. Để nguội cho môi trường đặc lại. b. Môi trường peptone lỏng: nuôi cấy vi khuẩn. - Cao thịt 5 g - Peptone 10 g - Nước cất 1000 ml Cách pha chế: - Cân đúng các thành phần trên cho vào trong cốc chứa 1000ml nước cất. Đem đun nhẹ cho tan đều. - Dùng phễu thủy tinh rót vào mỗi ống nghiệm 5ml. - Đậy nút bông, gói giấy và hấp vô trùng 1 atm/15 phút. Nếu pha môi trường peptone đặc thì bổ sung thêm 20 gam agar/1 lít. c. Môi trường PCA (Plate Count Agar). 11 - Cân chính xác 23,5 g môi trường bột tổng hợp khô cho vào cốc chứa khoảng 600 ml nước cất, đun cho tan môi trường trên bếp điện. - Khi môi trường đã tan đều bổ sung thêm nước cất cho đủ 1000 ml. - Phân vào 9 bình tam giác mỗi bình khoảng 60 – 80 ml môi trường. - Tất cả đều làm nút bông, gói giấy và hấp vô trùng 121oC/15 phút. d. Môi trường Gause: dùng để nuôi cấy xạ khuẩn - Tinh bột tan 20,0 g - K2HPO4 0,5 g - MgSO4.7H2O 0,5g - KNO3 1 g - NaCl 0,5 g - FeSO4 0,1g - Thạch 20 g - Nước 1000 ml - pH 7,2 - 7,4 e. Môi trường Hansen: dùng để nuôi cấy nấm men - Glucose 50g - Peptone 10 g - KH2PO4 3g - MgSO4 3g - Agar 20 g - Nước cất 1000 ml - pH 6 V. THỰC HÀNH VÀ BÁO CÁO KẾT QUẢ - Thực hành bao gói và khử trùng các loại dụng cụ: ống nghiệm, ống hút, que gạt, đĩa petri, bình tam giác... - Thực hành pha môi trường dinh dưỡng nuôi cấy vi sinh vật. Câu hỏi: 1. Trình bày mục đích và nguyên tắc cơ bản của việc bao gói dụng cụ? 2. Trình bày nguyên tắc hoạt động và các bước sử dụng nồi hấp vô trùng? 3. Trình bày những nguyên tắc và yêu cầu cơ bản của việc pha chế môi trường dinh dưỡng? 4. Trình bày các bước chế môi trường dinh dưỡng mà nhóm được phân công? 12 BÀI 2: PHÂN LẬP VI SINH VẬT I. MỤC ĐÍCH YÊU CẦU - Nắm vững nguyên tắc và mục đích của việc phân lập vi sinh vật - Thực hiện được các bước phân lập và làm thuần các chủng vi sinh vật II. VẬT LIỆU - Cỏ khô ngâm trong nước 2 – 3 ngày; bánh men cơm rượu; nước trái cây (thơm, nho) để 2 ngày; cơm nguội để 4 - 5 ngày. - Môi trường thạch đĩa (Hansen, PGA, peptone, Gause/Czapek – dox), thạch nghiêng (PGA) để phân lập - Đèn cồn, gòn thấm, giấy vệ sinh - Que gạt vô trùng, que cấy vòng, que cấy móc - Các ống nghiệm chứa 9ml nước cất vô trùng - Các bình tam giác chứa 99ml nước cất vô trùng - Nhãn dán (hoặc bút ghi ống nghiệm) - Pipet 1ml vô trùng - Giá để ống nghiệm III. KHÁI NIỆM Trong thiên nhiên, hoặc trong các vật phẩm nghiên cứu, vi sinh vật thường tồn tại ở dạng hỗn hợp gồm nhiều loài khác nhau. Muốn nghiên cứu về hình thái, sinh lý, sinh hóa hoặc sử dụng vào thực tiễn một loài nào đó thì cần phải đưa chúng về dạng thuần khiết. Phân lập vi sinh vật là quá trình tách riêng các loài vi sinh vật từ quần thể ban đầu và đưa về dạng thuần khiết. Đây là một khâu có ý nghĩa rất quan trọng trong việc nghiên cứu và ứng dụng vi sinh vật. Vi sinh vật ở dạng thuần khiết là giống vi sinh vật được tạo ra từ 1 tế bào ban đầu. IV. PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP VI SINH VẬT THUẦN KHIẾT Nguyên tắc: tách rời các tế bào vi sinh vật, nuôi cấy các tế bào trên trong môi trường dinh dưỡng đặc trưng để cho khuẩn lạc mọc riêng rẽ, cách biệt nhau. Với hầu hết các loại mẫu nghiên cứu. Quá trình phân lập vi sinh vật ở dạng thuần khiết gồm các bước cơ bản sau: - Tạo ra các khuẩn lạc riêng rẽ từ một quần thể vi sinh vật trong thiên nhiên như đất, nước, không khí, những mẫu vật và sản phẩm khác 13 - Phân lập vi sinh vật thuần khiết - Kiểm tra độ thuần khiết. 1. Tạo ra các khuẩn lạc riêng rẽ (từ quần thể vi sinh vật) trên các môi trường phân lập Bước đầu là làm sao cho chúng mọc tách rời nhau. Để đạt được mục đích này người ta phải pha loãng mẫu cần phân lập. Nếu mẫu ở trạng thái đặc phải đưa về dạng lỏng bằng cách: + Nghiền mẫu + Hòa tan mẫu trong nước cất vô trùng Sau đó thực hiện như mẫu ở dạng lỏng. + Tiếp tục pha loãng ở nồng độ cần thiết. + Cấy mẫu trên môi trường đặc trưng của nó Mỗi loài vi sinh vật có tính đặc trưng trên môi trường dinh dưỡng. Lợi dụng tính chất này người ta tạo ra môi trường mà ở đó chỉ phát triển bình thường một nhóm vi sinh vật nhất định. Các vi sinh vật khác hoặc bị kiềm hãm phát triển hoàn toàn hoặc từng phần. Ví dụ: cần phân lập nấm mốc hoặc xạ khuẩn thì phân lập trên môi trường có thêm chất kháng sinh để ức chế vi khuẩn. 2. Phân lập vi sinh vật trên môi trường đặc ở đĩa petri a. Đối với vi sinh vật hiếu khí - Trãi mẫu bằng phương pháp gạt: + Hút 0,1 ml dịch mẫu đã pha loãng cho vào đĩa petri có môi trường thích hợp. + Dùng que gạt thủy tinh phân phối dịch mẫu trãi đều khắp mặt thạch. + Tiếp tục sử dụng que gạt này gạt mẫu cho đều khắp mặt thạch đĩa petri thứ 2 rồi đĩa thứ 3. + Đặt các đĩa petri 1, 2, 3 trên vào tủ ấm ở nhiệt độ thích hợp. Sau 1 thời gian nhất định, tùy giống vi sinh vật ta sẽ nhận được các khuẩn lạc riêng rẽ từ các đĩa thứ 2 và 3. - Trãi mẫu bằng phương pháp ria: + Khử trùng que cấy vòng, để nguội + Lấy một ít dịch tế bào ria các đường trên hộp petri như hình vẽ + Sau mỗi đường ria, đốt que cấy và làm nguội trước khi thực hiện đường ria tiếp theo 14 + Gói đĩa petri và đem ủ ở nhiệt độ thích hợp. Sau 1 thời gian nhất định, tùy giống vi sinh vật ta sẽ nhận được các khuẩn lạc riêng rẽ từ các đường ria. Hình 3: Phân lập bằng kỹ thuật ria b. Đối với vi sinh vật kỵ khí. + Dùng môi trường đặc trong ống nghiệm đem chưng cách thủy để loại bỏ không khí trong môi trường. + Để nguội môi trường còn 45 – 500C. + Hút 0,1 ml dịch nghiên cứu cho vào ống môi trường, đậy nút lại, lắc đều. + Rót nhanh môi trường ở ống nghiệm vào nắp dưới của đĩa pêtri và đậy thật nhanh nắp lại, sao cho giữa mặt nắp và môi trường không còn không khí. + Dùng parafin hàn kín phần tiếp xúc giữa 2 nắp của đĩa petri và ủ ở nhiệt độ thích hợp. + Sau khi vi sinh vật phát triển, chọn các khuẩn lạc riêng rẽ trong khối môi trường, dùng que cấy cắt cả khối môi trường rồi cấy vào môi trường lỏng thích hợp. 3. Kiểm tra độ thuần khiết của giống phân lập Độ thuần khiết của các giống đã phân lập sẽ được kiểm tra vết cấy, kiểm tra độ thuần của khuẩn lạc. a. Kiểm tra vết cấy Quan sát sự sinh trưởng của vi sinh vật qua vết cấy trên môi trường đặc. 15 + Nếu vết cấy có bề mặt và màu sắc đồng đều, thuần nhất chứng tỏ giống mới phân lập đã tinh khiết thì giữ lại. + Nếu vết cấy không thuần nhất thì loại bỏ b. Kiểm tra lại độ thuần chủng của các khuẩn lạc + Chọn các khuẩn lạc riêng rẽ trên môi trường thạch nghiêng. + Tách các khuẩn lạc này ra và hòa tan, pha loãng ở nồng độ cần thiết trong nước cất vô trùng. + Nhỏ một giọt dịch trên vào đĩa petri có môi trường. + Dùng 1 que gạt phân phối giọt dịch đều khắp mặt thạch đĩa petri thứ nhất, rồi đĩa thứ 2, thứ 3. + Đặt các đĩa petri vào tủ ấm với nhiệt độ và thời gian thích hợp tùy loại vi sinh vật. + Sau đó lấy ra quan sát các khuẩn lạc riêng rẽ. Sự thuần khiết của khuẩn lạc là biểu hiện sự thuần khiết của giống. Ngoài ra, độ thuần khiết của các giống phân lập có thể được kiểm tra bằng kính hiển vi, được tiến hành như sau: chuẩn bị các tiêu bản cố định nhuộm màu tế bào hoặc các tiêu bản tế bào sống để kiểm tra. Các giống thuần khiết của nhiều loại vi khuẩn Pseudomonas, Bacterium, Bacillus. Thường đồng nhất về hình thái, chỉ khác nhau ít nhiều về kích thước giữa các tế bào. Tế bào của nhiều vi sinh vật khác như Mycobacterium, Nocardia, Corynebacterium rất đa dạng vì vậy rất khó xác định độ tuần khiết của chúng khi soi kính hiển vi. V. PHÂN LẬP MỘT SỐ GIỐNG VI SINH VẬT 1. Phân lập nấm men - Nguồn phân lập + Men bánh mì: men cái bánh mì (dạng paste hoặc bột) hòa tan trong nước cất vô trùng, sau đó pha loãng vài lần trước khi sử dụng. + Men rượu hoặc men cơm rượu: bánh men bẻ đôi, cạo lấy phần bột ở giữa, hòa trong nước cất vô trùng, pha loãng vài lần trước khi sử dụng. + Men trái cây: cho vào ống nghiệm sạch một ít nước mía hoặc trái cây tươi (thơm, nho), dầm lấy nước. Bọc miệng ống nghiệm bằng giấy. Để ở nhiệt độ phòng 24 giờ, khi dịch trong ống nghiệm bắt đầu sủi bọt, pha loãng vài lần trước khi sử dụng. - Môi trường phân lập: Hansen. - Tiến hành phân lập + Trãi mẫu bằng phương pháp ria: 16 Chuẩn bị nguồn phân lập như phần trên. Dùng que cấy vòng lấy một ít dịch tế bào nấm men (tương đương một vòng đầu que cấy). Dàn đều một cạnh petri. Đốt đầu que cấy để khử trùng và bắt đầu kéo thành những đường zic-zắc khởi đầu từ cạnh có dàn tế bào nấm men. Tuần tự tiến hành ở 3 vùng kế tiếp. Gói hộp petri, ủ ở nhiệt độ phòng trong 2 ngày. + Trãi mẫu bằng que gạt : Cho lên mặt thạch petri 0,1 ml dịch tế bào nấm men. Dùng que gạt đã nhúng cồn khử trùng để dàn dịch tế bào nấm men cho đều khắp bề mặt thạch (có thể gạt tiếp trên đĩa thứ 2 và 3) Gói petri, ủ ở nhiệt độ phòng trong 2 ngày. - Làm thuần Sau hai ngày ủ ở nhiệt độ phòng, quan sát các khuẩn lạc xuất hiện trên môi trường Hansen. Chọn khuẩn lạc có đặc tính điển hình của nấm men (khuẩn lạc to, màu đục sữa, khô, gồ cao) Dùng qua cấy vòng tách khuẩn lạc nói trên sang petri chứa môi trường Hansen khác (nếu đường cấy trên petri đầu tiên nhiễm nhiều) hoặc ria trên ống thạch nghiêng (nếu khuẩn lạc rời và ít nhiễm) Tiếp tục cấy nhiều lần cho đến khi các khuẩn lạc đồng nhất. Giống được xem là thuần khi tất cả các khuẩn lạc hiện diện trên môi trường đều có chung đặc tính về hình thái. Quan sát dưới kính hiển vi không có tế bào lạ. 2. Phân lập nấm mốc Aspergillus oryzae, Aspergillus niger và Mucor - Nguồn phân lập: có thể phân lập nấm mốc này trên cơm nguội, xôi làm mốc tương, bánh mì để khô vài ngày. - Môi trường phân lập: PGA - Tiến hành phân lập: Dùng que cấy móc (đã khử trùng), gạt nhẹ lên hệ sợi tơ hoặc trên bào tử đính (dạng bụi phấn), chuyển sang ống nghiệm thạch nghiêng. Đánh ngược phần lưng móc lên thành bên trong của ống nghiệm cho bào tử rơi xuống hay cắm đầu móc xuống mặt thạch thành ba điểm theo chiều dọc mặt thạch. Ủ ở nhiệt độ phòng trong 2 ngày. Sau hai ngày, lấy ra quan sát. Nếu trên mặt thạch chỉ có một loại tơ hoặc bào tử nấm mốc phân lập là dạt. Còn nếu lẫn nấm mốc khác hoặc vi khuẩn, thì cần tiếp tục cấy chuyền cho đến khi thuần khiết (chỉ còn loại nấm mốc mong muốn). Thông qua màu sắc của mốc để nhận diện. + Mốc có màu trắng: có thể là Mucor hay Rhizopus 17 + Mốc có màu đen có thể là Aspergillus niger + Mốc có màu xanh lục có thể là Aspergillus oryzae hay Penicillium 3. Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis - Nguồn phân lập: cỏ khô Lấy cỏ khô cắt nhỏ, cho vào bình tam giác. Đổ nước sạch vào cho ngập cỏ. Đun sôi 15 phút để diệt các tế bào sinh dưỡng và các tế bào không sinh bào tử. Đậy nút bông, để tủ ấm ở nhiệt độ 25 – 26 0C. Sau 2 – 3 ngày thì thấy xuất hiện lớp váng xám có nhiều vi khuẩn Bacillus subtilis vì cỏ khô bao giờ cũng có bào tử của vi khuẩn này. - Môi trường: peptone - agar. - Tiến hành phân lập và làm thuần: trãi mẫu bằng phương pháp gạt hoặc phương pháp ria. Sau đó để trong tủ ấm ở nhiệt độ sau 2- 3 ngày lấy ra chọn khuẩn lạc riêng rẽ để cấy chuyền. 4. Phân lập xạ khuẩn - Nguồn phân lập: đất, nước, trên các cơ chất động vật, thực vật - Môi trường phân lập: môi trường Gause hoặc môi trường Czapek – dox. Trên môi trường đôi khi có cả vi khuẩn mọc cùng xạ khuẩn nên cần phân biệt: + Khuẩn lạc vi khuẩn nhày, ướt + Khuẩn lạc xạ khuẩn bông, xốp, có dạng sợi - Tiến hành: trãi mẫu bằng phương pháp gạt hoặc phương pháp ria. Sau đó để trong tủ ấm 280C từ 7 – 15 ngày mới lấy ra chọn khuẩn lạc riêng rẽ để cấy chuyền. VI. THỰC HÀNH VÀ BÁO CÁO KẾT QUẢ Thực hành phân lập và làm thuần vi khuẩn, nấm men, nấm mốc, xạ khuẩn Câu hỏi: 1. Mục đích của việc phân lập? 2. Nêu các bước tiến hành phân lập và làm thuần các chủng vi sinh vật từ tự nhiên? 3. Quan sát và ghi nhận kết quả thu được? 18 BÀI 3: NUÔI CẤY, QUAN SÁT SỰ PHÁT TRIỂN CỦA VI SINH VẬT I. MỤC ĐÍCH YÊU CẦU - Nắm vững các nguyên tắc và mục đích của việc nuôi cấy vi sinh vật - Thực hiện được các thao tác cấy truyền từ ống giống sang các loại môi trường thạch nghiêng, thạch đứng, thạch đĩa - Theo dõi, quan sát và ghi nhận sự phát triển của vi sinh vật trên các loại môi trường nuôi cấy. II. VẬT LIỆU - Bút ghi ống nghiệm, gòn thấm - Que cấy vòng, que cấy móc - Đèn cồn, giá để ống nghiệm - Các ống môi trường thạch nghiêng (Peptone, Hansen, PGA), thạch đĩa (Peptone, Hansen, PGA), môi trường lỏng (Peptone, Hansen, PG) - Các ống giống vi khuẩn (E. coli, Bac. subtilis, Streptococcus), nấm men (Saccharomyces.), nấm sợi (Aspergillus, Penicillium, Mucor, Rhizopus) III. PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY VI SINH VẬT 1. Khái niệm Quá trình nuôi cấy vi sinh vật thực chất gồm 2 khâu: nuôi và cấy - Nuôi là quá trình đảm bảo và duy trì những điều kiện thuận lợi nhất cho sự hoạt động và phát triển của vi sinh vật. - Cấy là những thao tác chuyển vi sinh vật từ môi trường đang sống sang môi trường thuận lợi hơn cho sự phát triển của chúng. Hai khâu này không thể tách rời nhau trong quá trình nghiên cứu và ứng dụng của vi sinh vật. 2. Mục đích của việc nuôi cấy - Phát hiện sự có mặt của vi sinh vật trong các vật liệu nghiên cứu - Tiến hành việc nhân giống vi sinh vật một cách nhanh chóng - Cấy truyền từ canh trường cũ sang canh trường mới để giữ giống - Nghiên cứu các đặc tính sinh học của vi sinh vật. 3. Nguyên tắc - Mọi thao tác nuôi cấy đều phải thực hiện trong điều kiện vô trùng để tránh tạp nhiễm. - Môi trường và dụng cụ nuôi cấy phải được khử trùng triệt để. 19 - Duy trì tốt các điều kiện nuôi cấy để vi sinh vật phát triển 4. Các phương pháp nuôi cấy a. Phương pháp chung của việc cấy chuyền Ví dụ: cấy truyền từ ống nghiệm chứa giống sang ống nghiệm chứa môi trường Gồm các thao tác chính sau: - Đốt đèn cồn lên - Tay trái cầm 2 ống nghiệm: ống giống nằm ở ngoài, ống môi trường ở trong, giữ cả hai ống hơi nghiêng. - Tay phải cầm que cấy và khử trùng trên ngọn đèn cồn cho đến khi nóng đỏ dây cấy. - Dùng ngón út và ngón áp út kẹp nút bông vào lòng bàn tay xoay nhẹ, kéo nút bông ra và giữ trên tay đến khi đậy lại - Hơ nóng để khử trùng không khí ở miệng 2 ống nghiệm - Đợi khi que cấy vừa nguội, khéo léo đưa que cấy tiếp xúc với khuẩn lạc trong ống giống. - Rút que cấy ra, không để que cấy chạm vào thành ống nghiệm và đưa vào ống nghiệm môi trường để thực hiện thao tác cấy truyền. - Rút que cấy ra, khử trùng lại phần không khí nơi miệng ống nghiệm rồi đậy nút bông lại. - Để các ống nghiệm vào giá, đốt lại que cấy trên đèn cồn rồi để vào chỗ cũ. - Dán nhãn ghi tên giống vi sinh vật, ngày cấy, tên môi trường vào thành ống nghiệm Chú ý: Cách cấy truyền này có thể tiến hành từ canh trường đặc (hoặc lỏng) sang môi trường đặc (hoặc lỏng) Nếu ống giống là canh trường lỏng, ngoài việc dùng que cấy còn có thể dùng pipet để hút canh trường. Pipet phải được chuẩn bị và làm vô khuẩn trước (rửa sạch, sấy khô, bọc giấy, khử trùng). Khi dùng tháo giấy ra và dùng ngay. Dùng xong cắm pipet vào dung dịch khử khuẩn. b. Phương pháp cấy trên thạch nghiêng Phương pháp này dùng để cấy truyền các vi sinh vật hiếu khí. 20 Thông thường dùng que cấy vòng, trình tự tiến hành giống như trên. Nhưng sau khi lấy được giọt canh trường vi sinh vật vào đầu que cấy rồi, ta tiếp tục như sau: - Đưa đầu que cấy vào tận đáy ống nghiệm - Nhẹ nhàng hòa giọt canh trường vi sinh vật vào giọt nước ngưng tụ ở đáy ống nghiệm. - Nhẹ nhàng và từ từ kéo đầu que cấy trên mặt thạch từ đáy lên trên theo các kiểu như sau: + Theo kiểu hình chữ chi + Theo hình vòng xoắn + Theo đường vạch ngang song song. Hình 4: Một số kiểu cấy trên ống thạch nghiêng c. Cấy đâm sâu trên thạch đứng Phương pháp này dùng để cấy các vi sinh vật kị khí. Khi cấy ta dùng que cấy nhọn và đâm sâu vào môi trường. Cách tiến hành tương tự như trên, chỉ thay đổi một ít như sau: - Quay ngược ống môi trường cho miệng ống nghiệm hướng xuống dưới để tránh nhiễm lúc cấy. - Đưa que cấy đã có vi sinh vật đâm sâu vào dọc theo ống thạch cho đến tận đáy ống nghiệm. Tùy yêu cầu mà có thể đâm 1 – 3 đường, có thể đâm chính giữa ống hoặc sát thành ống. - Khi cắm que cấy vào cũng như khi rút ra, chú ý giữ que cấy thẳng, làm nhẹ nhàng không làm cho môi trường bị nứt nẻ. 21 Hình 5: Cấy đâm sâu vào thạch đứng d. Phương pháp cấy trên đĩa petri Có thể cấy trên đĩa petri theo một trong hai cách: dùng que cấy vòng, dùng pipet. Trong phạm vi bài này chúng ta chỉ thực hiện theo cách dùng que cấy vòng và trình tự được thực hiện như sau: - Để đĩa petri lên bàn - Dùng que cấy lấy canh trường vi sinh vật theo thư tự và yêu cầu vô trùng như đã nêu phần trên - Tay trái hé mở nắp hộp vừa đủ để cho đầu que cấy vào - Nhẹ nhàng và nhanh chóng lướt que cấy trên mặt thạch theo các kiểu: + Theo hình chữ chi trên toàn bộ bề mặt thạch + Theo những đường song song + Theo 4 hình chữ chi ở bốn góc của đĩa thạch. Trong quá trình cấy, vì lượng vi sinh vật sẽ bị giảm dần theo đường cấy nên khi vi sinh vật phát triển, càng gần cuối đường số khuẩn lạc càng thưa dần. Hình 6: Các kiểu cấy trên thạch đĩa 22 IV. CÁC ĐIỀU KIỆN NUÔI VI SINH VẬT Để đảm bảo vi sinh vật phát triển tốt, sau khi cấy xong phải quan tâm đến các điều kiện nuôi dưỡng. Có nhiều điều kiện ảnh hưởng đến sự phát triển của vi sinh vật, nhưng đáng chú ý nhất là những điều kiện sau: 1. Nhiệt độ Tùy loài vi sinh vật, chọn nhiệt độ tối thích cho sự phát triển của chúng và duy trì sự ổn định nhiệt độ đó. Dựa vào nhiệt độ tối thích cho sự phát triển của vi sinh vật, người ta chia chúng làm 3 nhóm sau đây: + Vi sinh vật ưa ấm có nhiệt độ tối thích 20 – 370C + Vi sinh vật ưa nóng có nhiệt độ tối thích 55 - 600C + Vi sinh vật ưa lạnh có nhiệt độ tối thích 10 – 150C Để duy trì nhiệt độ thích hợp, ta sử dụng các tủ hoặc phòng ấm có bộ phận điều chỉnh nhiệt độ tự động luôn luôn duy trì nhiệt độ ở mức nhất định nào đó. 2. Độ ẩm Để đảm bảo độ ẩm cho vi sinh vật phát triển ta có thể thực hiện bằng các cách sau: - Khi chuẩn bị môi trường phải đảm bảo đủ lượng nước - Phun nước vô khuẩn vào phòng nuôi hoặc để nước bốc hơi trong tủ ấm. 3. Điều kiện hiếu khí và yếm khí: - Nuôi hiếu khí Cung cấp thường xuyên và đầy đủ oxy cho vi sinh vật có thể thực hiện bằng các biện pháp: + Lớp môi trường nuôi cấy có độ dày vừa phải (2 – 8cm) có thể nuôi trong ống nghiệm, khay, bình tam giác. + Các bình chứa canh trường được lắc thường xuyên trong quá trình nuôi để cung cấp thêm oxy cho vi sinh vật. + Nếu nuôi cấy sâu trong môi trường lỏng, thì phải tiến hành sục khí thường xuyên hay định kỳ. - Nuôi kỵ khí Ngăn cách không cho vi sinh vật tiếp xúc với oxy bằng cách: + Sau khi cấy xong ta đổ lên bề mặt môi trường một lớp dầu paraphin, dầu vazơlin hoặc lớp thạch dày khoảng 2 cm. Cách này đơn giản dễ áp dụng. Chú ý: dầu và thạch phải vô khuẩn, dầu phải trung tính. + Cấy đâm sâu trong môi trường đặc 23 + Nuôi cấy trong bình hút chân không, có thể dùng những ống nghiệm đặc biệt gieo cấy xong hút hết không khí rồi hàn kín lại. + Đun sôi môi trường 20 – 30 phút rồi làm nguội nhanh để đuổi hết oxy trong đó. + Dùng hóa chất để loại trừ oxy của không khí trong dụng cụ nuôi. + Có thể nuôi vi sinh vật hiếu khí cùng vi sinh vật kỵ khí. Phương pháp này thì khó áp dụng. V. QUAN SÁT ĐẶC TÍNH SINH LÝ CỦA VI SINH VẬT NUÔI CẤY Vi sinh vật khi phát triển trên môi trường thường hình thành các khuẩn lạc, và các đặc điểm sinh lý khác đặc trưng cho loài vi sinh vật đó. Việc quan sát này hết sức quan trọng trong việc phân loại và những nghiên cứu về sinh hóa, di truyền của loài đó. Việc quan sát có thể thực hiện bằng mắt thường, kính lúp, kính hiển vi quang học. 1. Quan sát đặc tính phát triển của vi sinh vật trên môi trường đặc. Khi quan sát sự phát triển của vi sinh vật trên môi trường đặc cần ghi nhận các đặc điểm sau đây: - Hình dạng khuẩn lạc (dạng tròn, dạng rễ cây, dạng không đều hay dạng bầu dục) - Kích thước khuẩn lạc (tính bằng mm). Nếu là dạng khuẩn lạc tròn ta đó đường kính khuẩn lạc. Nếu không phải hình tròn ta đo chiều dài nhất. - Màu sắc: ghi màu sắc khuẩn lạc tạo thành, và màu của môi trường - Bề mặt khuẩn lạc: ghi nhận bề mặt khuẩn lạc bóng, xù xì, gấp nếp hay gồ ghề - Mép khuẩn lạc: bằng phẳng, lượn sóng hay răng cưa. - Độ đặc: dạng mỡ, bột nhão, dạng nhớt, dạng màng 2. Quan sát đặc tính phát triển của vi sinh vật trong môi trường lỏng. Sự sinh trưởng của vi sinh vật trong môi trường lỏng ở điều kiện nuôi cấy ổn định có tính chất đồng nhất hơn trong môi trường đặc. Khi quan sát vi sinh vật phát triển trong trong môi trường lỏng cần ghi nhận: - Sinh trưởng yếu, vừa, hay mạnh mẽ. - Đục môi trường: đục đồng đều, dạng bông . - Khả năng tạo váng: dạng váng vòng hay dạng kín, váng mỏng hay dày, phẳng hay xù xì, nhẵn nhụi hay gấp nếp, khô hay nhày, nổi hay chìm. - Khả năng tạo thành cặn tủa: ít hay nhiều, xốp hay đặc. 24 VI. THỰC HÀNH VÀ BÁO CÁO KẾT QUẢ - Thực hành thao tác cấy truyền vi khuẩn, nấm men từ ống giống sang môi trường thạch nghiêng, đĩa petri và môi trường lỏng. Nuôi ủ ở nhiệt độ phòng và theo dõi sự phát triển. - Thực hành thao tác cấy truyền nấm mốc từ ống giống sang môi trường thạch đĩa và thạch nghiêng (cấy 3 điểm). Nuôi ủ ở nhiệt độ phòng và theo dõi sự phát triển. Câu hỏi 1. Nêu rõ nguyên tắc và mục đích của việc cấy truyền vi sinh vật từ ống giống sang môi trường? 2. Trình bày tóm tắt thao tác cấy truyền vi sinh vật từ ống giống sang môi trường thạch nghiêng và thạch đĩa? 3. Nêu và phân tích các điều kiện chính trong quá trình nuôi vi sinh vật? 4. Sau thời gian nuôi cấy 3 – 5 ngày quan sát và ghi nhận sự phát triển của vi khuẩn, nấm men, nấm mốc? 5. Mô tả hình dạng, màu sắc khuẩn lạc của vi khuẩn, nấm men, nấm sợi trên môi trường đặc? 25 BÀI 4: ĐẾM SỐ LƯỢNG TẾ BÀO VI SINH VẬT I. MỤC ĐÍCH YÊU CẦU - Nắm được các bước thu và pha loãng mẫu nghiên cứu trước khi tiến hành đếm số lượng vi sinh vật. - Nắm vững các nguyên tắc và cách tiến hành đếm số lượng tế bào vi sinh vật theo phương pháp xác định trực tiếp và gián tiếp. II. VẬT LIỆU - Quả bóp cao su, đèn cồn - Đĩa petri có sẵn môi trường (hoặc chuẩn bị đĩa petri vô trùng và bình môi trường đã khử trùng) (môi trường Hansen, môi trường peptone agar) - Giá ống nghiệm - Pipet 1ml, 5ml, 10 ml vô trùng - Phòng đếm hồng cầu - Que gạt vô trùng - Mẫu cần kiểm tra (dịch nuôi cấy vi khuẩn và nấm men sau 3 – 5 ngày, bánh men cơm rượu) - Các ống nghiệm chứa 9 ml nước cất vô trùng - Một số bình tam giác chứa 99 ml nước cất vô trùng - Cối, chày, bình tam giác vô trùng III. THU VÀ PHA LOÃNG MẪU Muốn biết số lượng chung của các nhóm vi sinh vật cũng như số lượng riêng của mỗi nhóm thành phần trong bất kỳ một mẫu vật nào thì người ta phải đếm số lượng tế bào của chúng. Khi xác định số lượng vi sinh vật trong đất, nước, không khí, trong dịch nuôi cấy hoặc trong các vật phẩm khác, người ta có thể dùng nhiều phương pháp. Sau đây là hai phương pháp thường dùng hơn cả đó là: - Phương pháp xác định trực tiếp số lượng tế bào bằng phòng (buồng) đếm hồng cầu - Phương pháp xác định gián tiếp số lượng tế bào bằng cách đếm số khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch. Cả hai phương pháp trên đều phải tiến hành qua hai giai đoạn sau đây: 26 1. Thu mẫu Tùy theo loại vật phẩm cần xác định mà ta lấy mẫu để nghiên cứu với số lượng và khối lượng khác nhau cho phù hợp. Việc thu mẫu phải bảo đảm các yêu cầu sau đây: - Lấy mẫu có tính chất đại diện. - Lượng mẫu lấy vừa phải, đủ để phân tích các đặc tính lý, hóa, sinh học. - Dụng cụ lấy mẫu và chứa mẫu phải vô trùng. - Lấy mẫu xong phải phân tích ngay và không được để quá 24 giờ. - Mẫu lấy phải ghi vào nhãn ký hiệu và ghi vào sổ những đặc điểm của mẫu và nơi thu mẫu. 2. Pha loãng mẫu Chuẩn bị một số bình tam giác chứa 99 ml nước cất vô trùng, một số ống nghiệm chứa 9 ml nước cất vô trùng và một số ống hút (1ml) vô trùng. a. Nếu mẫu nghiên cứu ở trạng thái lỏng - Hút 1 ml mẫu nghiên cứu cho vào ống nghiệm có 9 ml nước cất vô trùng - Trộn đều dung dịch bằng cách hút lên rồi thổi xuống 3 – 5 lần ta được độ pha loãng 1/10 hay 10-1. - Tiếp tục hút 1 ml ở ống nghiệm 1 cho vào ống nghiệm chứa 9 ml nước cất vô trùng thứ 2. - Trộn đều dung dịch như trên ta có độ pha loãng 1/100 hay 10-2 - Tiếp tục như vậy hút từ ống 2 sang ống 3, từ ống 3 sang ống 4 ta sẽ có các độ pha loãng tương ứng 10-3, 10-4 Hình 7: Sơ đồ pha loãng mẫu nghiên cứu ở trạng thái lỏng và cấy vào môi trường đặc 27 b. Nếu mẫu nghiên cứu ở trạng thái đặc (như đất, thực phẩm ) - Chuẩn bị 2 bình tam giác có dung tích 250 ml. + Bình 1 chứa 99 ml nước cất vô trùng + Bình 2 đã vô trùng và không chứa gì. - Khử trùng cối chầy sứ bằng cho một ít cồn vào và đốt lên. Sau đó để nguội - Cân 1g mẫu cho vào cối sứ và nghiền nát mẫu - Dùng toàn bộ nước ở bình 1 để chuyển toàn bộ mẫu sang bình 2 - Lắc đều khoảng 5 phút, để lắng 30 giây rồi tiếp tục pha loãng mẫu như mẫu ở trạng thái lỏng. - Tùy theo sự ước đoán số lượng vi sinh vật trong mẫu mà pha loãng nhiều hay ít. Sau khi có độ pha loãng thích hợp thì tiến hành xác định số lượng tế bào vi sinh vật. Hình 8: Sơ đồ pha loãng mẫu nghiên cứu ở trạng thái đặc và cấy vào môi trường đặc IV. XÁC ĐỊNH SỐ LƯỢNG TẾ BÀO VI SINH VẬT 1. Xác định trực tiếp số lượng tế bào vi sinh vật bằng phòng đếm hồng cầu Phòng đếm hồng cầu dùng để đếm vi sinh vật có kích thước lớn (nấm men, bào tử nấm mốc). Người ta thường dùng 2 loại phòng đếm hồng cầu Thomas và phòng đếm Geriep. 28 Nguyên tắc cấu tạo của 2 loại phòng đếm này đều giống nhau. Đó là một phiến kính dày hình chữ nhật, chia thành 3 khoảng ngang. Khoảng giữa chia thành hai khoảng nhỏ. Trên mỗi khoảng nhỏ này có kẻ một lưới đếm, gồm 400 ô vuông. Có diện tích tổng cộng là 1mm2. Vì vậy diện tích một ô vuông là 1/400 mm2 và chiều cao là 1/10 mm. Như vậy thể tích 1 ô nhỏ là 1/4000 mm3. Phòng đếm có là kính dày để đậy. Hình 9: Khung đếm Geriep; 1. Nhìn nghiêng; 2. Nhìn trên xuống; 3. Khung được phóng đại Tiến hành đếm: - Lắc đều ống nghiệm pha loãng mẫu - Đậy lá kính lên lưới đếm - Dùng ống hút vô trùng lấy mẫu, cho 1 giọt vào mép lá kính, do sức mao dẫn dịch sẽ tự tràn vào mặt trên lưới đếm. Chú ý không để tạo bọt khí trong lưới đếm hoặc tràn mẫu xuống rãnh. - Đặt phòng đếm lên bàn kính hiển vi và để yên 3 – 5 phút, tiến hành đếm tế bào trong 5 ô lớn chéo nhau, chỉ đếm các tế bào nằm trong lồng ô con và những tế bào nằm trên 2 cạnh liên tiếp cùng chiều. Đếm lần lượt từ ô con 1 đến ô con 16. - Số lượng tế bào trong 1 ml mẫu nghiên cứu được xác định bằng công thức: Số tế bào/mL = a x 4000 x 103 b x 1/10-n a : số tế bào trong 5 ô lớn (80 ô con) b : số ô con trong 5 ô lớn (16 ô x 5 = 80 ô con) 103 : số chuyển mm3 thành ml (1000mm3 = 1ml) 29 10-n : độ pha loãng mẫu Lưu ý: số tế bào trong 5 ô lớn phải trên 200 mới đảm bảo được mức độ chính xác của phương pháp. 2. Xác định gián tiếp số lượng tế bào bằng cách đếm số lượng các khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch. - Nguyên tắc + Cấy 1 thể tích xác định dịch huyền phù cần nghiên cứu lên môi trường đặc trưng trong đĩa petri + Xác định số số lượng tế bào bằng cách đếm số khuẩn lạc mọc lên sau thời gian nuôi cấy vì mỗi khuẩn lạc là kết quả sự phát triển của một tế bào. - Cách tiến hành + Trước tiên phải ghi độ pha loãng và ngày cấy trên nắp petri + Pha loãng dịch huyền phù ở các nồng độ khác nhau: 10-3, 10-4, 10-5, + Chuẩn bị môi trường trong các ống nghiệm (khoảng 20 ml) đã khử trùng rồi giữ lại ở trạng thái lỏng bằng cách đặt trong tủ ấm hoặc trong nồi cách thủy có nhiệt độ 450C + Dùng pipet vô trùng hút 0,5 hoặc 1ml dịch pha loãng mẫu cho vào đĩa petri vô trùng + Sau đó đổ môi trường thạch từ ống nghiệm sang. Dùng tay xoay tròn đĩa cho mẫu hòa đều vào môi trường. + Chờ môi trường đặc rồi lật úp đĩa lại và đặt vào tủ ấm có nhiệt độ và thời gian thích hợp. Sau đó lấy ra kiểm tra kết quả. + Mỗi mẫu cấy 3 nồng độ liên tiếp. Mỗi nồng độ cấy 3 đĩa petri và lấy kết quả trung bình. Việc tính số lượng khuẩn lạc mọc lên được tiến hành sau một thời gian xác định, phụ thuộc vào tốc độ sinh trưởng của loại vi sinh vật cần phát hiện trên môi trường. Kết quả các lần cấy lặp lại được tổng hợp và trích ra số khuẩn lạc trung bình mọc lên khi cấy từ độ pha loãng này. - Cách đếm Lấy bút mực kẻ 2 đường kính giao nhau ở đáy hộp petri. Đếm số khuẩn lạc trong từng vùng và nhớ đánh dấu những khuẩn lạc đã đếm. Số lượng tế bào vi sinh vật trong 1g mẫu được tính như sau: Số tế bào / gam mẫu = M V x H x N 30 M : Số khuẩn lạc trung bình trong 1 đĩa petri H : hệ số pha loãng = 1/10-n V : thể tích mẫu cấy N : Hệ số tính theo khối lượng khô tuyệt đối của mẫu Chú ý: Độ pha loãng thích hợp nhất nếu ở nồng độ này cấy trên thạch đĩa cho số khuẩn lạc trung bình từ 50 –150 với vi khuẩn, xạ khuẩn; 30 – 50 với nấm mốc. V. THỰC HÀNH VÀ BÁO CÁO KẾT QUẢ - Thực hành đếm số lượng tế bào nấm men, vi khuẩn trong dịch nuôi cấy ở các nồng độ pha loãng khác nhau. - Thực hành kiểm tra số lượng tế bào nấm men trong mẫu bánh men cơm rượu ở 2 nồng độ 10-5, 10-6. Câu hỏi: 1. Tại sao khi kiểm tra số lượng tế bào vi sinh vật trong một loại mẫu nào đó người ta phải pha loãng mẫu? 2. Kiểm tra số lượng tế bào nấm men trong dịch nuôi cấy bằng cách đếm trên buồng đếm hồng cầu, kiểm tra số tế bào nấm men trong bánh men cơm rượu theo phương pháp đếm số khuẩn lạc. Từ đó tính số tế bào nấm men trong 1 ml dịch nuôi cấy và 1g mẫu bánh men? 3. Xác định số lượng tế bào vi khuẩn ở 2 nồng độ pha loãng bằng cách đếm số khuẩn lạc trên môi trường thạch. Tính số lượng tế bào vi khuẩn từ 1 ml mẫu ban đầu? 31 BÀI 5: QUAN SÁT HÌNH THÁI VI SINH VẬT DƯỚI KÍNH HIỂN VI I. MỤC ĐÍCH YÊU CẦU - Nắm vững cách sử dụng kính hiển vi quang học, đặc biệt là kỹ năng sử dụng vật kính dầu. - Biết cách làm tiêu bản (tạm thời) và quan sát một số đặc điểm của vi sinh vật dưới kính hiển vi. - Nắm vững phương pháp làm tiêu bản phòng ẩm để quan sát cuống sinh bào tử của nấm mốc. - Nắm vững nguyên tắc, các bước thực hiện khi làm tiêu bản cố định nhuộm màu và quan sát được các đặc điểm sinh học của vi sinh vật trên kính hiển vi. II. VẬT LIỆU - Kính hiển vi, dầu soi - Đèn cồn, cồn 700, 900 - Gòn thấm - Que cấy vòng, que cấy móc - Phiến kính và lá kính sạch - Hộp petri có chứa phiến kính và lá kính đã vô trùng - Ống nghiệm chứa nước cất vô trùng - Pipet 5 ml, 10 ml vô trùng - 200 ml môi trường PGA vô trùng - Thuốc nhuộm xanh metylen 0,001%. - Mẫu cấy của vi khuẩn, nấm men, nấm mốc trên môi trường thạch đĩa. - Tiêu bản nhuộm đơn của vi khuẩn E. coli, Bac.subtilis, Streptococcus và nấm men. - Tiêu bản phòng ẩm nấm sợi: Aspergillus, Penicillium, Mucor, Rhizopus - Thuốc nhuộm đơn, nhuộm bào tử, nhuộm gram - Giá và mâm nhuộm - Bình tia, giấy lọc, giấy thấm - Đèn cồn, que cấy vòng - Cồn 950, HCl 0,5%, H2SO4 1% - Dịch nuôi cấy tế bào vi khuẩn E. coli, Bac.subtilis (1 – 2 tuần), nấm men. 32 III. QUAN SÁT HÌNH THÁI VI SINH VẬT 1. Quan sát vi sinh vật ở trạng thái sống – làm tiêu bản tạm thời Là quan sát vi sinh vật ở trạng thái tự nhiên về hình dạng, cấu tạo, sự chuyển động, sự tăng trưởng và phát triển. 1.1 Cách làm làm tiêu bản giọt ép a. Đối với vi khuẩn và nấm men - Cho một giọt nước vô trùng lên phiến kính sạch - Dùng que cấy vòng lấy một vòng dịch vi khuẩn hoặc nấm men hòa vào giọt nước - Đậy lá kính lên giọt canh trường thật nhẹ để tránh không tạo bọt khí - Đặt tiêu bản lên bàn kính hiển vi. - Quan sát ở vật kính 10x và 40x Chú ý: Nếu giọt dịch nhiều quá, tràn ra ngoài phần tiếp xúc của phiến kính và lá kính ta dùng giấy thấm bớt đi Trong trường hợp mẫu ở dạng khuẩn lạc trên môi trường thạch, dùng que cấy vòng chấm nhẹ vào bìa mép khuẩn lạc rồi hòa vào giọt nước vô trùng được chuẩn bị sẵn trên phiến kính. Hình 10: Cách làm tiêu bản giọt ép b. Đối với nấm sợi và xạ khuẩn Do nấm mốc và xạ khuẩn phát triển thành hệ sợi. Do đó khi làm tiêu bản phải dùng kim dìm khuẩn ty vào dịch thấm ướt. Đồng thời tách các sợi rời ra. Sau đó đậy lá kính lên. Quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính 10x và 40x. Dịch thấm ướt của xạ khuẩn là nước còn nấm mốc phải dùng dung dịch lactophenol. Ngoài ra, để giữ nguyên cấu trúc hệ sợi của nấm mốc và xạ khuẩn, nhất là cơ quan sinh sản (cuống sinh bào tử, cách đính bào tử ). có thể chuẩn bị tiêu bản bằng phương pháp nuôi cấy phòng ẩm. Các bước tiến hành như sau: 33 - Cho vào đĩa petri một tờ giấy thấm, rồi đặt vào một phiến kính. Đậy lại, gói giấy và đem hấp khử trùng. - Đun chảy môi trường dinh dưỡng đã khử trùng trong ống nghiệm (môi trường PGA cho nấm mốc và Gause cho xạ khuẩn) - Mở hé nắp petri ở gần ngọn lửa đèn cồn, đổ thạch trong ống nghiệm lên phiến kính và chờ đông lại. - Lấy nước cất đã vô trùng đổ vào phần giấy thấm, để nước thấm đều tờ giấy (không tràn lên phiến kính). - Dùng que cấy móc, khều nhẹ vào khuẩn lạc nấm mốc (hoặc xạ khuẩn) rồi chấm lên phần thạch của phiến kính trong phòng ẩm. - Gói cả hộp lại và nuôi ủ ở nhiệt độ thường 2 – 3 ngày (nấm mốc), 5 - 7 ngày (xạ khuẩn) - Mở hộp petri và lấy phiến kính bên trong ra. - Dùng giấy thấm lau mặt đáy phiến kính. Đậy lá kính lên chỗ có khuẩn lạc mọc và đặt dưới kính hiển vi để quan sát mẫu (ở trạng thái sống với vật kính có độ phóng đại 10x và 40x). 1.2 Phương pháp làm tiêu bản giọt treo Loại tiêu bản này có thể theo dõi sự sinh sản, sự hình thành bào tử, khả năng di động của vi sinh vật. Cách tiến hành như sau: + Dùng phiến kính đặc biệt có phần lõm hình tròn ở giữa + Bôi vazơlin quanh phần lõm của phiến kính + Cho một giọt canh trường lên giữa lá kính + Cẩn thận úp ngược lá kính lên trên chỗ lõm của phiến kính. + Được quan sát dưới kính hiển vi. Chú ý: không để giọt canh trường lan rộng hay chạm vào đáy của phần lõm. 1.3 Cách làm tiêu bản tạm thời có nhuộm màu Nguyên tắc: phương pháp này sử dụng thuốc nhuộm không hoặc ít độc với vi sinh vật và được pha loãng ở nồng độ đảm bảo cho tế bào vẫn sống và hoạt động sau khi nhuộm. Cách nhuộm: + Nhỏ một giọt thuốc nhuộm xanh metylen 0,001% lên phiến kính + Nhỏ một giọt canh trường lên giọt thuốc nhuộm + Đậy lá kính lên giọt dịch + Quan sát tiêu bản ở vật kính 10x rồi 40x 34 2. Quan sát vi sinh vật ở trạng thái chết – làm tiêu bản cố định (tiêu bản vi sinh vật chết nhuộm màu) 2.1 Cách làm tiêu bản Quan sát tiêu bản cố định là một phương pháp phổ biến trong nghiên cứu vi sinh vật học vì nó có ưu điểm sau: - Thao tác tuy phức tạp nhưng tiêu bản có màu sắc đẹp, giữ được lâu. - Cho phép ta quan sát rõ ràng hình dạng và một số cấu tạo của tế bào cũng như dễ dàng đếm số lượng tế bào vi sinh vật. - Không sợ bị lây nhiễm khi làm việc với vi sinh vật gây bệnh Quá trình làm tiêu bản cố định thường qua các bước sau: a. Làm vết bôi - Chọn phiến kính sạch và khô. Nếu chưa sạch phải rửa lại. - Lấy bút chì màu khoanh 1 vòng tròn (1 – 2 cm2) lên một phía của phiến kính, quay ngược phiến kính lại và để lên giá (nếu đã làm quen thì không cần làm bước này) - Dùng que cấy vòng lấy một giọt canh trường để vào vòng đã khoanh. Nếu canh trường đặc thì dùng que cấy lấy một giọt nước vô trùng để lên vòng đã khoanh, sau đó lấy 1 ít khuẩn lạc vi sinh vật hòa đều với nước. - Nghiêng que cấy 10 –15 độ, nhẹ nhàng dàn giọt canh trường ra khắp diện tích đã khoanh, không sát mạnh. - Khử trùng que cấy và để vào giá. - Để vết bôi khô tự nhiên. Chú ý: + Lượng vi sinh vật lấy vừa phải + Vết bôi tròn, gọn và thật mỏng, vi sinh vật không tập trung vào một chỗ hoặc chồng chất thành nhiều lớp, mà phải phân phối đều trên vết bôi. + Kích thước vết bôi vừa phải khoảng 1- 2 cm2, bé quá khó quan sát, lớn quá mất thời gian, tốn thuốc nhuộm. b. Cố định vết bôi Việc cố định vết bôi nhằm các mục đích sau: + Giết chết vi sinh vật để an toàn khi tiếp xúc + Gắn chặt vi sinh vật vào phiến kính để lúc nhuộm thì rửa không bị trôi + Làm cho vi sinh vật dễ bắt màu Có nhiều phương pháp cố định, phương pháp đơn giản nhất là hơ nóng trên đèn cồn, cách làm như sau: kẹp phiến kính giữa 2 ngón tay cái và ngón trỏ, đưa 35 qua lại 4 – 5 lần trên phần không nóng lắm của đèn cồn, tránh không để tiêu bản nóng quá. Khi nghiên cứu cấu tạo tế bào thì việc cố định bằng cách hơ nóng không có lợi, mà phải cố định bằng hóa chất, thường dùng các chất là rượu và axêton. Các cách cố định như sau: + Nhúng vết bôi vào rượu. Với rượu 950 ngâm vết bôi từ 5 – 15 phút. Với rượu metylic ngâm khoảng 2 – 5 phút. + Ngâm vết bôi vào dung dịch axêton trong 5 phút. + Nhỏ vài giọt rượu 90 – 950 lên vết bôi. Đốt cháy và dập tắt ngay. Làm như vậy vài lần rồi để khô. c. Nhuộm màu tiêu bản Nguyên tắc: Sử dụng thuốc nhuộm có khả năng thẩm thấu qua màng tế bào và kết hợp với thành phần khác nhau của tế bào thành những hợp chất màu đặc trưng bền vững. - Tùy theo mục đích nghiên cứu và khả năng bắt màu khác nhau của các thành phần tế bào mà chọn loại thuốc nhuộm cho phù hợp. - Có hai cách nhuộm chính: + Nhuộm đơn giản: chỉ dùng một lọai thuốc nhuộm trên 1 tiêu bản + Nhuộm phức tạp (nhuộm kép): dùng đồng thời 2 hay nhiều loại thuốc nhuộm trên 1 tiêu bản. Ví dụ: nhuộm gram, nhộm bào tử, nhuộm tiêm mao Như vậy, tùy mục đích nghiên cứu mà ta áp dụng phương pháp nhuộm thích hợp. Cách nhuộm: Vết bôi đã cố định phải để khô mới đem nhuộm - Đặt tiêu bản có vết bôi lên cầu thủy tinh (được đặt nằm ngang miệng một bôcan) - Đặt miếng giấy lọc phủ lên toàn bộ vết bôi - Dùng ống nhỏ giọt nhỏ thuốc nhuộm phủ đều vết bôi. Chú ý không cho thuốc nhuộm nhiều quá và trong thời gian nhuộm trên vết bôi luôn luôn có phủ đều một lớp thuốc nhuộm. - Thời gian nhuộm tùy tính chất tiêu bản và thuốc nhuộm - Thường nhuộm ở nhiệt độ phòng. Để tăng cường tác dụng của thuốc nhuộm hoặc rút ngắn thời gian ta hơ nóng trên đèn cồn - Khi nhuộm xong, rửa vết bôi bằng cách nghiêng phiến kính, dùng bình xịt cho dòng nước chảy nhẹ qua vết bôi đến khi nước chảy ra không còn màu nữa 36 - Dùng giấy thấm khô tiêu bản hoặc hơ nhẹ tiêu bản trên đèn cồn. - Quan sát tiêu bản ở vật kính 40x rồi chuyển sang vật kính 100x có dầu. Hình 11: Trình tự các bước làm tiêu bản cố định 2.2 Các phương pháp nhuộm tế bào vi sinh vật a. Nhuộm đơn giản Là phương pháp hay dùng trong phòng thí nghiệm, nó cho phép ta nhận định nhanh chóng về hình dạng của vi sinh vật. Tiến hành nhuộm tế bào vi khuẩn E. coli, Bac.subtilis, tế bào nấm men theo trình tự như sau: - Làm vết bôi, để khô tự nhiên - Cố định bằng cách hơ nhẹ trên ngọn đèn cồn - Đặt giấy lọc lên vết bôi đã cố định - Nhỏ vài giọt thuốc nhuộm Fuchsin loãng trong 2 – 3 phút hoặc xanh metylen trong 3 – 5 phút - Dùng nước rửa sạch - Thấm khô bằng giấy thấm - Quan sát dưới vật kính 100x (có dầu). b. Nhuộm phức tạp (nhuộm kép) Phương pháp này dựa trên đặc tính cấu tạo hóa học của tế bào, nó được dùng để nghiên cứu cấu tạo và đặc tính của tế bào cũng như sự khác nhau giữa các loài vi sinh vật. 37  NHUỘM GRAM Nguyên tắc: Dựa trên khả năng bắt màu của với thuốc nhuộm tím kết tinh và iod mà chia thành 2 nhóm lớn. + Nhóm giữ được phức chất tạo thành giữa tím kết tinh và iod khi xử lý bằng cồn. Nhóm vi khuẩn có tính chất này gọi là vi khuẩn gram dương. + Nhóm không giữ được phức chất tạo thành giữa tím kết tinh và iod khi xử lý bằng cồn. Nhóm vi khuẩn có tính chất này gọi là vi khuẩn gram âm. Tiến hành nhuộm tế bào E. coli và Bac.subtilis  Chuẩn bị tiêu bản - Làm vết bôi, để khô - Cố định nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn (tránh làm nóng quá)  Nhuộm tiêu bản - Đặt giấy lọc lên vết bôi - Nhuộm tiêu bản bằng tím kết tinh trong 1 – 2 phút - Đổ hết thuốc đi, nhỏ dung dịch lugol lên để trong 1 phút - Rửa nước, thấm khô - Nhúng vào cồn 950 trong 30 giây. Cần làm cẩn thận vì kết quả phụ thuộc nhiều vào động tác này. - Rửa nước, thấm khô - Nhuộm bổ sung bằng Funshin loãng 1 phút - Rửa nước, thấm khô - Xem tiêu bản dưới vật kính dầu Kết quả: Bac.subtilis bắt màu tím, E. coli bắt màu hồng.  NHUỘM BÀO TỬ (NHA BÀO) Nguyên tắc: Dựa trên cấu trúc đặc biệt của màng bào tử dày, chắc, khó bắt màu nên khi nhuộm cần phải dùng thuốc nhuộm đặc, xử lý tế bào chất bào tử dễ bắt màu bằng nhiệt và axit. Có nhiều phương pháp nhuộm bào tử, nhưng tất cả các phương pháp đều dựa trên nguyên tắc: - Đầu tiên nhuộm toàn bộ (cả tế bào chất của bào tử và tế bào) bằng một loại thuốc nhuộm có hoạt tính mạnh - Làm mất màu tế bào (nhưng bào tử vẫn còn màu) - Nhuộm lại tế bào bằng một loại thuốc nhuộm khác 38 Nhờ vậy mà tế bào chất của bào tử và tế bào chất của tế bào bắt màu khác nhau. Làm tiêu bản và nhuộm (Theo phương pháp Ogietska) - Làm vết bôi với Bac.subtilis đã nuôi cấy 2 tuần tuổi trên ống thạch nghiêng, và để khô tự nhiên - Nhỏ vài giọt HCl 0,5% lên vết bôi, hơ nóng trên ngọn đèn cồn cho bốc hơi, giữ 2 phút rồi rửa nước - Đặt giấy lọc lên vết bôi - Nhỏ Fuchsin Ziehl 3 – 5 phút. Trong khi nhuộm hơ nóng cho đến bốc hơi nhẹ. Nếu thuốc nhuộm cạn phải thêm vào, không để bị khô. - Rửa vết bôi, để khô - Tẩy màu bằng cách nhúng phiến kính vào dung dịch H2SO4 1% trong 1 – 2 phút - Rửa nước - Nhuộm vết bôi bằng xanh metylen Loeffler trong 1 – 2 phút - Rửa sạch, để khô - Quan sát tiêu bản dưới vật kính dầu Kết quả: bào tử màu đỏ, tế bào chất màu xanh. IV. THỰC HÀNH VÀ BÁO CÁO KẾT QUẢ 1. Thực hành quan sát đại thể khuẩn lạc vi khuẩn, nấm men, nấm mốc 2. Thực hành sử dụng kính hiển vi. 3. Làm tiêu bản tạm thời quan sát hình dạng tế bào vi khuẩn, nấm men. 4. Quan sát hình dạng tế bào vi khuẩn, nấm men ở vật kính dầu khi nhuộm đơn. 5. Thực hành làm tiêu bản phòng ẩm. Quan sát sợi khuẩn ty và cuống sinh bào tử của nấm mốc trên tiêu bản đã được chuẩn bị sẵn. 6. Thực hành làm tiêu bản nhuộm đơn để quan sát hình dạng tế bào vi khuẩn, nấm men. 7. Thực hành làm tiêu bản nhuộm gram và nhuộm bào tử của vi khuẩn. Câu hỏi: 1. Cho biết ý nghĩa của việc nghiên cứu các đặc điểm sinh học của vi sinh vật? 2. Vẽ và mô tả hình dạng của các tế bào vi khuẩn, nấm men đã quan sát dưới kính hiển vi? 39 3. Trình bày phương pháp làm tiêu bản phòng ẩm. Mô tả và vẽ hình cấu trúc sợi nấm, cuống sinh bào tử của nấm mốc quan sát được? 4. Trình bày nguyên tắc và ý nghĩa của việc nhuộm đơn, nhuộm kép (nhuộm gram, nhuộm bào tử) trong nghiên cứu vi sinh vật? 5. Tóm tắt phương pháp nhuộm đơn. Vẽ hình các tế bào quan sát được? 6. Tóm tắt phương pháp nhuộm gram. Vẽ hình và giải thích kết quả nhuộm? 7. Tóm tắt phương pháp nhuộm bào tử. Vẽ hình và chú thích kết quả quan sát được? 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Trần Linh Thước, 2011. Thực tập vi sinh vật học, NXB ĐHQGTP. 2. Nguyễn Đức Lượng, 2011. Thí nghiệm vi sinh vật học, NXB ĐHQGTP. 3. Lê Văn Việt Mẫn (chủ biên), 2014. Thí nghiệm vi sinh vật học thực phẩm, ĐHQG TP. HCM 4. Trần Thanh Thủy, 1998. Hướng dẫn thực hành vi sinh vật học, NXBGD.