Giáo trình Kỹ thuật xét nghiệm cơ bản

hemorrhagic... 2.2. Đánh giá nguy cơ vi sinh vật Vấn đề cốt lõi của thực hành an toàn sinh học là việc đánh giá nguy cơ của vi sinh vật. Người tiến hành đánh giá nguy cơ cần có hiểu biết đầy đủ về những đặc điểm riêng của loại vi sinh vật được xét nghiệm, thiết bị, thường quy được sử dụng, các thiết bị lưu giữ cũng như cơ sở vật chất sẵn có. Người phụ trách phòng xét nghiệm hoặc người phụ trách an toàn sinh học có trách nhiệm đảm bảo việc đánh giá mức độ nguy hiểm một cách đầy đủ và kịp thời để đảm bảo những thiết bị và phương tiện phù hợp phục vụ công tác xét nghiệm. Việc đánh giá nguy cơ cần được tiến hành định kỳ và bổ sung khi cần thiết để có thể xác định được cấp độ an toàn sinh học phù hợp, lựa chọn trang thiết bị cần thiết, sử dụng trang bị bảo hộ cá nhân đúng, xây dựng thường quy chuẩn kết hợp với những biện pháp an toàn khác nhằm bảo đảm độ an toàn cao nhất trong công việc. 2.3. Cấp độ an toàn sinh học của phòng xét nghiệm Việc xác định một cấp độ ATSH cho một PXN cần quan tâm đến loại vi sinh vật được xét nghiệm, thiết bị sẵn có cũng như các tiêu chuẩn thực hành và các quy trình cần thiết để tiến hành công việc trong PXN một cách an toàn. Mối liên quan giữa nhóm nguy cơ vi sinh vật và cấp độ ATSH của PXN được thể hiện trong bảng sau: Bảng 1. Mối liên quan giữa nhóm nguy cơ vi sinh vật và cấp độ ATSH của PXN Nhóm nguy cơ Cấp độ ATSH Áp dụng Tiêu chuẩn thực hành Cơ cở vật chất/ trang thiết bị ATSH 1 Cấp 1 (BSL1) Nghiên cứu và giảng dạy cơ bản Kỹ thuật vi sinh tốt (GMT) Không có gì yêu cầu gì đặc biệt, bàn làm xét nghiệm thông thường 2 Cấp 2 (BSL2) Dịch vụ chăm sóc sức khoẻ ban đầu; cơ sở chẩn đoán; nghiên cứu GMT và sử dụng quần áo bảo hộ, có các biển báo nguy hiểm sinh học Bàn xét nghiệm; tủ ATSH khi thực hiện xét nghiệm có nguy cơ tạo khí dung 3 Cấp 3 (BSL3) Dịch vụ chẩn đoán đặc biệt, nghiên cứu Như cấp độ 2 và sử dụng thêm áo quần bảo hộ đặc biệt, kiểm soát lối vào, luồng khí định hướng Tủ ATSH và/hoặc dụng cụ cơ bản cho tất cả các hoạt động 4 Cấp 4 (BSL4) Đơn vị có bệnh phẩm nguy hiểm Như cấp 3 và có thêm lối vào khóa khí, tắm trước khi ra, loại bỏ chất thải chuyên dụng Tủ ATSH cấp 3 hoặc quần áo bảo hộ áp lực dương cùng với tủ ATSH cấp 2, nồi hấp hai cửa, lọc khí cấp, khí thải BSC: tủ an toàn sinh học; BSL: cấp độ an toàn sinh học; GMT: kỹ thuật vi sinh vật an toàn 3. YÊU CẦU VỀ AN TOÀN SINH HỌC PHÒNG XÉT NGHIỆM 3.1. Tổ chức, quản lý Lãnh đạo Trung tâm, phụ trách PXN và tất cả những người làm việc trong PXN phải có chứng chỉ đã được đào tạo về an toàn sinh học, tùy theo yêu cầu công việc phải có đủ kiến thức hoặc kỹ năng cần thiết. Trên cơ sở các quy định của Nhà nước và Bộ Y tế, mỗi Trung tâm cần ban hành quy định an toàn sinh học của Trung tâm và thực hiện đúng các quy định này. Hiện nay, do chưa có hướng dẫn của Bộ Y tế về vấn đề này nên các Trung tâm có thể tham khảo quy định thực hiện an toàn sinh học của Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương để xây dựng quy định tạm thời áp dụng cho PXN tại Trung tâm. Cần phân công một người phụ trách về an toàn sinh học. Người phụ trách ATSH có nhiệm vụ lập kế hoạch bảo đảm an toàn sinh học, theo dõi, giám sát và định kỳ báo cáo lãnh đạo Trung tâm về các vấn đề liên quan đến ATSH. Cán bộ xét nghiệm cần được kiểm tra sức khỏe trước khi vào làm việc tại PXN và định kỳ hằng năm, được tiêm phòng hoặc khuyến cáo về việc tiêm phòng các bệnh truyền nhiễm mà họ có nguy cơ bị phơi nhiễm khi làm việc trong PXN. Trường hợp nghi ngờ bị phơi nhiễm hoặc nhiễm bệnh phải được theo dõi, báo cáo, điều trị, cách ly theo hướng dẫn của Bộ Y tế. 3.2. Cơ sở vật chất và trang thiết bị 3.2.1. Phòng xét nghiệm an toàn sinh học cấp 1 Phòng xét nghiệm ATSH cấp 1 dùng để nghiên cứu, làm việc với các tác nhân sinh học thuộc nhóm nguy cơ 1. Đây là yêu cầu tối thiểu cho các PXN ở tất cả các cấp độ ATSH. Mặc dù một số yêu cầu có thể không cần thiết cho PXN vi sinh vật thuộc nhóm nguy cơ 1 (như biển báo nguy cơ sinh học) nhưng những yêu cầu này lại cần thiết cho mục đích đào tạo để tăng cường các kỹ thuật vi sinh tốt. Cơ sở vật chất Không gian cần đủ rộng để thực hiện các công việc như: lau chùi, bảo dưỡng PXN và để các dụng cụ, vật tư cần thiết. Tường, trần nhà và sàn nhà cần phải bằng phẳng, dễ lau chùi, không thấm nước, chịu được hoá chất và chất diệt khuẩn thường dùng trong PXN. Sàn nhà không trơn, trượt. Mặt bàn xét nghiệm không thấm nước và chịu được chất khử khuẩn, axít, kiềm, dung môi hữu cơ và nhiệt. Ánh sáng đủ cho các hoạt động, tránh ánh sáng phản chiếu hoặc quá chói. Đồ đạc cần chắc chắn. Cần có không gian ở giữa các thiết bị để dễ lau chùi. Tủ đựng quần áo thường và đồ dùng cá nhân, chỗ ăn uống và nghỉ ngơi phải bố trí bên ngoài PXN. Bồn rửa tay có vòi nước gần cửa ra vào. Cửa ra vào nên có ô kính trong suốt, chịu nhiệt thích hợp và tự đóng. Có phương tiện cứu hoả, xử lý sự cố điện. Vòi rửa mắt khẩn cấp trong khu vực xét nghiệm. Hộp thuốc và dụng cụ sơ cứu ban đầu được trang bị thích hợp và sẵn sàng cho sử dụng. Nếu mở cửa sổ thì các cửa này phải có lưới chắn côn trùng. Có hệ thống cấp nước sạch. Đường cấp nước trực tiếp cho PXN cần có van một chiều hoặc biện pháp phù hợp để tránh trào ngược, bảo vệ hệ thống nước công cộng. Có hệ thống điện ổn định và đầy đủ, tiếp đất toàn bộ hệ thống. Nên có máy phát điện dự phòng để hỗ trợ cho các trang thiết bị thiết yếu như tủ ấm, tủ lạnh v.v. Nếu có sử dụng động vật để xét nghiệm thì PXN và chuồng nhốt động vật cần phải quan tâm đến an toàn cháy nổ và an ninh. Cửa ra vào chắc chắn, cửa sổ có song và quản lý chặt chẽ chìa khoá. Thiết bị trong phòng xét nghiệm Được thiết kế và lắp đặt để giảm thiểu tối đa sự tiếp xúc giữa người làm xét nghiệm với các bệnh phẩm, dụng cụ nhiễm trùng. Các thiết bị xét nghiệm phù hợp với kỹ thuật và loại vi sinh vật được xét nghiệm. Các thiết bị phải được kiểm tra, hiệu chuẩn hằng nằm hoặc định kỳ theo hướng dẫn của nhà sản xuất; Các trang bị bảo hộ cá nhân phù hợp với các kỹ thuật xét nghiệm thực hiện trong phòng xét nghiệm. 3.2.2. Phòng xét nghiệm an toàn sinh học cấp 2 Phải đáp ứng các tiêu chuẩn của phòng xét nghiệm ATSH cấp 1 và các yêu cầu sau: Cơ sở vật chất Có biển báo nguy hiểm sinh học với biểu tượng quốc tế trên tất cả các cửa ra vào của PXN. Nên lắp đặt hệ thống đèn chiếu sáng khẩn cấp trong trường hợp có sự cố như mất điện để nghiên cứu viên có thể ra khỏi PXN một cách an toàn. Nên có phòng tắm có vòi hoa sen trong khu vực PXN để sử dụng trong trường hợp khẩn cấp. Thiết bị đảm bảo an toàn sinh học Tủ ATSH cấp 2. Nồi hấp ướt (autoclave) hoặc các thiết bị tiệt trùng thích hợp khác trong khu vực xét nghiệm. Trang bị các loại túi, thùng đựng chất thải phù hợp theo quy định của Bộ Y tế. Nên sử dụng: Que cấy chuyển bằng nhựa dùng một lần. Nếu dùng que cấy bằng kim loại, vòng tròn ở đầu que cấy phải khép kín. Các loại chai, lọ và ống nghiệm có nắp xoáy. Sử dụng pipet và thiết bị hỗ trợ pipet. Theo quy định của Bộ Y tế, tiêu chuẩn phòng xét nghiệm chẩn đoán vi rút cúm A (H1N1) là phải đạt yêu cầu phòng xét nghiệm an toàn sinh học cấp 2 trở lên. Các tiêu chuẩn đánh giá PXN chẩn đoán cúm A (H1N1) được đưa ra trong. 3.2.3. Phòng xét nghiệm an toàn sinh học cấp 3 Cơ sở vật chất PXN ATSH cấp 3 cần đáp ứng các tiêu chuẩn thiết kế của phòng xét nghiệm an toàn sinh học cấp 2 và các yêu cầu sau: Cách biệt với các phòng xét nghiệm khác, cách ly với khu vực có nhiều người qua lại. Có phòng đệm (anteroom) trước khi vào phòng xét nghiệm. Phòng đệm phải thiết kế chỉ mở được một cửa trong một thời điểm. Có cửa thoát hiểm trong trường hợp khẩn cấp. Phòng xét nghiệm phải bịt kín được để tiệt trùng. Hệ thống ống dẫn khí phải lắp đặt sao cho có thể tiệt trùng được. Cửa sổ phải đóng, kín khí và sử dụng vật liệu chống vỡ. Trong khu vực phòng xét nghiệm phải có phòng tắm có vòi hoa sen cho trường hợp khẩn cấp. Phải có hệ thống thông gió có kiểm soát để duy trì hướng luồng khí vào phòng xét nghiệm. Nên lắp đặt thiết bị kiểm soát để người làm xét nghiệm lúc nào cũng có thể biết chắc là luồng khí có hướng thích hợp vào phòng xét nghiệm đang được duy trì. Hệ thống thông khí phải được lắp đặt sao cho không khí từ phòng xét nghiệm không được hoàn lưu đến khu vực khác trong cùng toà nhà. Không xả trực tiếp không khí từ phòng xét nghiệm ra ngoài. Có hệ thống kiểm soát nhiệt độ, thông khí và điều hoà nhiệt độ (HVAC) để duy trì áp lực âm phù hợp trong phòng xét nghiệm. Có hệ thống báo động để thông báo lỗi của hệ thống HVAC. Tất cả các bộ lọc không khí (bộ lọc HEPA) phải được lắp đặt thuận tiện cho việc tiệt trùng và kiểm tra các thông số cần thiết. Nước thải lây nhiễm phải được tiệt trùng trước khi thải ra ngoài. Các quy trình thiết kế cơ sở hạ tầng và vận hành phòng xét nghiệm an toàn sinh học cấp 3 phải được thể hiện bằng văn bản. Thiết bị đảm bảo an toàn sinh học Tủ an toàn sinh học cấp 2, lắp đặt tránh lối đi lại, cửa ra vào và các cửa cấp, thải khí. Nồi hấp tiệt trùng di động (autoclave) trong phòng xét nghiệm. Nồi hấp hai cửa. Cần quan tâm đến tính an toàn của thiết bị, ví dụ như máy ly tâm cần có cốc đựng mẫu bệnh phẩm, rôto an toàn. 3.3. Thực hành trong phòng xét nghiệm 3.3.1. Tiêu chuẩn thực hành đối với phòng xét nghiệm an toàn sinh học cấp 1, 2 Kỹ thuật vi sinh tốt là nền tảng của an toàn trong phòng xét nghiệm. Thiết bị chỉ là hỗ trợ cần thiết chứ không thể thay thế được các thực hành an toàn. 3.3.1.1. Quản lý ra vào phòng xét nghiệm Chỉ những người có trách nhiệm mới được phép ra vào khu vực làm việc. Cửa PXN nên luôn đóng. Không cho phép trẻ em vào khu vực làm việc. Không cho bệnh nhân vào phòng xét nghiệm để lấy mẫu bệnh phẩm. 3.3.1.2. Sử dụng trang bị bảo hộ và vệ sinh cá nhân Mặc áo choàng, hoặc đồng phục của phòng xét nghiệm trong suốt thời gian làm việc trong phòng xét nghiệm. Đeo găng tay trong tất cả các quá trình tiếp xúc trực tiếp với máu, dịch cơ thể, các chất có khả năng gây nhiễm trùng khác hoặc động vật nhiễm bệnh. Sau khi sử dụng, tháo bỏ găng tay và rửa tay đúng cách. Rửa tay sau khi thao tác với vật liệu và bề nặt bị nhiễm trùng và trước khi ra khỏi khu vực làm việc của phòng xét nghiệm. Đeo kính bảo hộ, mặt nạ hoặc các thiết bị bảo hộ khác để tránh bị phơi nhiễm với các dung dịch nhiễm trùng, hóa chất. Đeo khẩu trang thường hay khẩu trang có hiệu quả lọc cao (N95, N96, ...) trong trường hợp có khả năng văng, bắn hoặc tạo khí dung chứa tác nhân gây bệnh. Không mặc quần áo bảo hộ phòng xét nghiệm ra bên ngoài như nhà ăn, phòng giải khát, văn phòng, thư viện, nhà vệ sinh v.v. Không sử dụng giày, dép hở mũi chân trong phòng xét nghiệm. Không ăn uống, hút thuốc, dùng mỹ phẩm và đeo hay tháo kính áp tròng trong khu vực làm việc của phòng xét nghiệm. Không để thức ăn, nước uống ở trong khu vực làm việc của phòng xét nghiệm. Không để chung quần áo bảo hộ đã mặc trong PXN với quần áo thông thường. 3.3.1.3. An toàn trong quy trình xét nghiệm Tuyệt đối không hút pipet bằng miệng. Không ngậm bất kỳ vật gì trong miệng. Không dùng nước bọt để dán nhãn. Tất cả các thao tác cần được thực hiện theo phương pháp làm giảm tối thiểu việc tạo các giọt hay khí dung. Hạn chế tối đa việc dùng bơm, kim tiêm. Không được dùng bơm, kim tiêm để thay thế pipet hoặc vào bất kỳ mục đích khác ngoài mục đích tiêm, truyền hay hút dịch từ động vật thí nghiệm. Tuyệt đối không được đậy nắp các bơm kim tiêm lại sau khi sử dụng Khi bị tràn, đổ vỡ, rơi vãi hay có khả năng phơi nhiễm với vật liệu lây nhiễm phải báo cáo cho người phụ trách phòng xét nghiệm. Cần lập biên bản và lưu giữ hồ sơ về các sự cố này. Phải xây dựng và thực hiện đúng quy trình xử lý các sự cố xảy ra trong PXN. Phải tiệt trùng các dung dịch lây nhiễm trước khi thải ra hệ thống nước thải chung. Có thể yêu cầu phải xây dựng một hệ thống xử lý nước thải riêng tùy thuộc vào việc đánh giá nguy cơ của tác nhân sinh học được sử dụng. 3.3.1.4. Khu vực làm việc của phòng xét nghiệm Phòng xét nghiệm cần phải ngăn nắp, sạch sẽ và chỉ để những gì cần thiết cho công việc. Vào cuối mỗi ngày làm việc, các mặt bàn, ghế phải được khử nhiễm sau khi làm đổ các vật liệu nguy hiểm. Tất cả các vật liệu, vật phẩm và môi trường nuôi cấy nhiễm trùng phải được khử trùng trước khi thải bỏ hoặc rửa sạch để sử dụng lại. Đóng gói và vận chuyển bệnh phẩm phải tuân theo quy định quốc gia hoặc quốc tế. Nếu mở cửa sổ cần phải có lưới chống côn trùng. 3.3.2. Tiêu chuẩn thực hành phòng xét nghiệm an toàn sinh học cấp 3 Áp dụng tất cả những quy tắc của phòng xét nghiệm cơ bản cấp 1, 2 và các điểm sau: Quần áo bảo hộ phòng xét nghiệm phải kín phía trước. Sử dụng loại có mũ trùm đầu, bao giày khi cần thiết. Không sử dụng áo choàng cài khuy phía trước hoặc ngắn tay. Quần áo làm việc trong phòng xét nghiệm phải được tiệt trùng trước khi đưa ra ngoài. Các thao tác có nguy cơ tạo khí dung như: mở hộp chứa vật liệu nhiễm trùng sau khi ly tâm, lắc, trộn; nuôi cấy, phân lập... nên tiến hành trong tủ an toàn sinh học. 3.4. Xử lý chất thải Việc phân loại, trang bị dụng cụ đựng rác và xử lý các loại chất thải từ PXN phải đáp ứng các tiêu chuẩn về xử lý chất thải bệnh viện ban hành kèm theo Quyết định số 43/2007/QĐ-BYT, ngày 30/11/2007 của Bộ Y tế. 3.5. An toàn hóa học, lửa, điện, bức xạ và trang thiết bị Người làm việc trong PXN vi sinh vật không những bị phơi nhiễm vi sinh vật gây bệnh mà còn có khả năng nhiễm các loại hóa chất. Họ phải có những kiến thức cần thiết về tính độc của những loại hoá chất này, kiểu tiếp xúc và những mối nguy hiểm có thể xảy ra khi sử dụng và bảo quản. Dữ liệu an toàn nguyên vật liệu hay thông tin về các hoá chất nguy hiểm đều được các nhà sản xuất hoặc nhà cung cấp đưa ra. Các PXN có sử dụng những hóa chất nguy hiểm cần tìm hiểu những thông tin này. Tất cả thiết bị điện và hệ thống đường dây điện cần tuân thủ các tiêu chuẩn và quy định về an toàn điện quốc gia. Việc kiểm tra thường xuyên tất cả các thiết bị điện, kể cả hệ thống nối đất là rất cần thiết. Ngoài ra, cần lắp đặt đường dây điện, ổ cắm phải cao hơn nền PXN khoảng 40 cm, không gần chỗ có vòi nước. Mỗi PXN cần có cầu dao, cầu chì hay aptomat để có thể cắt điện khi cần thiết. 3.6. Xử lý sự cố trong phòng xét nghiệm Có nhiều sự cố có thể xảy ra trong PXN. Những sự cố này có thể do sai sót trong thao tác của người làm xét nghiệm như bị tràn đổ dung dịch chứa TNGB, bị vật sắc nhọn đâm vào tay chân khi làm việc với TNGB hay sự cố do mất điện, thiên tai, hỏa hoạn... Cán bộ xét nghiệm phải được cảnh báo về các sự cố có thể xảy ra và được hướng dẫn xử lý các sự cố. Các hướng dẫn cụ thể sẽ được đề cập trong khóa huấn luyện về an toàn sinh học. Nguyên tắc xử lý trong trường hợp xảy ra sự cố như sau: Xử lý tại chỗ theo đúng quy trình; Ghi chép lại sự cố, biện pháp xử lý đã thực hiện; Báo cáo người phụ trách PXN về sự cố này. 3.6.1. Sự cố bị vật sắc nhọn đâm vào tay trong khi làm việc với tác nhân gây bệnh Báo với đồng nghiệp làm việc gần đó (nếu có). Bộc lộ vết thương. Nhẹ nhàng nặn máu (chú ý không làm tổn thương tổ chức mô). Xả nước tối thiểu trong vòng 5 phút (trong khi vẫn nặn máu). Sử dụng băng gạc để che vết thương. Rời khỏi PXN. Ghi chép và báo cáo sự việc với người chịu trách nhiệm quản lý PXN. 3.6.2. Sự cố làm đổ dung dịch chứa tác nhân gây bệnh trong tủ an toàn sinh học Trong các PXN nên chuẩn bị trước hộp dụng cụ xử lý đánh đổ dung dịch có chứa TNGB. Trong hộp này cần có dung dịch khử nhiễm, giấy thấm, panh, kẹp, túi đựng chất thải lây nhiễm, trang bị bảo hộ cá nhân phù hợp. Các dụng cụ này phải làm bằng các vật liệu không bị ăn mòn bởi các hóa chất trong PXN. Khi đánh đổ dung dịch chứa TNGB trong tủ ATSH, người làm xét nghiệm không được tắt tủ và tiến hành các bước sau: Báo với đồng nghiệp đang làm việc gần đó (nếu có). Để cho tủ hoạt động 10 phút trước khi tiến hành các biện pháp xử lý đảm bảo cho tất cả các khí dung đã được lọc qua màng lọc HEPA của tủ. Thay găng tay sạch và đi lấy bộ xử lý sự cố đổ mẫu. Dùng giấy thấm phủ lên dung dịch bị đổ, đổ hóa chất khử trùng (dung dịch Bleach pha loãng 10 lần hoặc NaClO 0,5%), để khoảng 30 phút cho chất khử trùng phát huy tác dụng. Thu nhặt vật sắc nhọn (nếu có) bằng kẹp bỏ vào hộp đựng vật sắc nhọn. Dùng kẹp thu nhặt giấy thấm cho vào túi đựng chất thải lây nhiễm để tiệt trùng. Lau bề mặt làm việc của tủ ATSH. Kết thúc quá trình xử lý. Sau khi kết thúc xét nghiệm và ra khỏi PXN, phải ghi chép, báo cáo sự việc với người phụ trách ATSH và người quản lý PXN. 3.6.3. Sự cố đổ dung dịch chứa tác nhân gây bệnh lên sàn nhà hoặc bàn xét nghiệm Khi đánh đổ dung dịch chứa tác nhân gây bệnh lên sàn nhà hoặc mặt bàn xét nghiệm, cán bộ xét nghiệm cần tiến hành các bước xử lý như sau: Ngay lập tức cảnh báo cho đồng nghiệp đang làm việc trong cùng PXN. Thay găng tay sạch và quần áo bảo hộ nếu dung dịch chứa TNGB bắn lên quần áo. Nhặt các vật sắc nhọn nếu có bằng kẹp. Phủ giấy thấm lên toàn bộ bề mặt có dung dịch bị đổ theo trình tự từ ngoài vào trong. Đổ hóa chất khử trùng (dung dịch Bleach pha loãng 10 lần hoặc NaClO 0,5%) lên chỗ đã được phủ giấy thấm theo chiều từ ngoài vào trong. Đợi 30 phút. Thu giấy thấm và tất cả các vật dụng lây nhiễm cho vào tủi đựng rác thải để tiệt trùng. Lau sạch khu vực bị đổ, vỡ. Kết thúc quá trình xử lý. Sau khi kết thúc quá trình xét nghiệm, ra ngoài, ghi chép và báo cáo người phụ trách PXN về sự cố và các biện pháp xử lý đã được tiến hành. KỸ THUẬT NHUỘM XANH METHYLEN 1. Nguyên tắc: Xanh metylen khi được làm kiềm hoá sẽ nhuộm được các hạt nhiễm sắc của các trực khuẩn, đặc biệt là trực khuẩn bạch hầu. Do vậy nhuộm xanh metylen kiềm ngoài mục đích dùng để nhuộm đơn, nhuộm nền sau khi nhuộm kháng acid còn có mục đích là nhuộm tiêu bản chất ngoáy họng để phát hiện trực khuẩn bạch hầu. 2. Chuẩn bị phương tiện : Dụng cụ: Lam kính sạch, que cấy, giá nhuộm, giá cắm, bô can,- đồng hồ. Hoá chất: Thuốc nhuộm xanh methylen.- Bệnh phẩm: Mủ, dịch,- đờm. 3. Tiến hành nhuộm: - Đánh dấu tiêu bản. Dùng que cấy lấy bệnh phẩm dàn tiêu bản, để- khô. Cố định tiêu bản bằng cách hơ qua ngọn lửa đèn cồn 3-4- lần. Nhỏ thuốc nhuộm xanh methylen 30 giây - 1 phút. Rửa nước , để- khô, soi kính hiển vi . 4. Nhận định kết quả: Các loại vi khuẩn có trong bệnh phẩm đều bắt màu xanh. NHUỘM GRAM Nhuộm Gram là một phương pháp thực nghiệm nhằm phân biệt các loài vi khuẩn thành 2 nhóm Gram dương (Gram positive) và Gram âm (Gram negative) dựa trên các đặc tính hoá lý của thành tế bào. Phương pháp này được đặt tên theo người phát minh ra nó, nhà khoa học người Đan Mạch Hans Christian Gram (1853 -1938). Ông phát triển kỹ thuật này vào năm 1884, về sau được Hucker và nhiều người khác cải tiến. I . MỤC TIÊU 1. Nắm đươc nguyên lý của kỹ thật nhuộm Gram 2. Thực hiện được kỹ thuật nhuộm Gram 3. Nhận định được kết quả nhuộm Gram 4. Tránh được các yếu tố kỹ thuật làm sai lệch kết quả nhuộm Gram II. NỘI DUNG 1. Nguyên lý Dựa trên sự khác nhau về cấu trúc của vách tế bào nên trong quá trình nhuộm Gram, vi khuẩn Gram dương sẽ giữ được phức hợp tím gentians-iod không bị tẩy màu bởi alcohol, trong khi vi khuẩn Gram âm không giữ được phức hợp này. Do vậy, kết quả sau khi nhuộm là vi khuẩn Gram dương vẫn giữ được màu tím của gentians, còn vi khuẩn Gram âm bắt màu hồng của fucshin. 2. Dụng cụ, thiết bị Kính hiển vi, que cấy đầu tròn, đèn cồn, diêm, phiến kính (slide), chậu rửa, bình xịt nước cất và các dụng cụ cần thiết. 3. Vật liệu, hoá chất (1) Các loài vi khuẩn hoặc các hỗn dịch các vi khuẩn này. Vi khuẩn Gram âm: E.coli, Salmonella,..; Gram dương: S. aureus, Bacillus cereus; dịch cơ thể hoặc mẫu sinh thiết bị nghi ngờ nhiễm khuẩn. (2) Dung dịch tím gentians (3) Dung dịch Lugol (4) Dung dịch alcohol 90% (5) Dung dịch fucshin kiềm Pha thuốc nhuộm tím gentians: + Tím gentians nồng độ 1/10 trong cồn ethylic 95[sup]0[/sup] 10ml + Acid phenic 1ml + Nước cất 100ml Lắc đều, lọc qua giấy lọc. Pha dung dịch lugol: + Iod 1g + Kali iodid (KI) 2g + Nước cất 5ml Nghiền tan trong cối sứ rồi cho thêm nước cất cho đủ 200ml Pha thuốc nhuộm Fucshin kiềm: + Fucshin kiềm nồng độ 1/10 trong cồn ethylic 95[sup]0[/sup] 10ml + Acid phenic 5ml + Nước cất 100ml Lắc đều, lọc qua giấy lọc. 4. Các bước tiến hành Bước một, dàn tiêu bản và cố định tiêu bản: Dùng que cấy vô trùng lấy một ít vi khuẩn từ ống giống thạch nghiêng (hoặc dịch cơ thể, mẫu sinh thiết bị nghi ngờ nhiễm khuẩn) hoà vào 1 giọt nước muối sinh lý ở giữa phiến kính, để khô trong phòng thí nghiệm. Cố định tiêu bản bằng cách hơ nhanh trên ngọn lửa đèn cồn 2-3 lần để gắn chặt vi khuẩn vào phiến kính. Việc cố định nhằm 3 mục đích: giết chết vi khuẩn, gắn chặt vi khuẩn vào phiến kính và làm vết bôi bắt màu tốt hơn vì các tế bào chết bắt màu tốt hơn các tế bào sống. Bước hai, nhuộm màu: - Thứ nhất, nhuộm bằng dung dịch tím gentians trong 30 giây đến 1 phút, rửa nước; - Thứ hai, nhuộm thêm dung dịch lugol và giữ trong 1 phút, rửa nước; - Thứ ba, khử màu: nhỏ dung dịch alcohol 90%, giữ khoảng 30 giây (cho đến khi vừa thấy mất màu), rửa nước; - Thứ tư, nhuộm tiếp bằng dung dịch Fucshin trong 1 phút, rửa nước, để khô. * Kết quả: quan sát ở vật kính dầu 100x. Nếu nhuộm đúng vi khuẩn Gram dương bắt màu tím, Gram âm bắt màu hồng. 5. Giải thích tính bắt màu Gram của vi khuẩn Vi khuẩn Gram dương có vách tế bào dày từ 15 đến 50 nm, dạng lưới, cấu tạo bởi peptidoglycan. Chất này có khả năng giữ phức hợp tím gentians - iod. Trong khi đó, lớp vách tế bào peptidoglycan của các vi khuẩn Gram âm thì mỏng hơn và thường có thêm lớp màng lipopolysaccharde (LPS) bên ngoài. Hình 2. Sơ đồ minh họa vách tế bào vi khuẩn Gram dương(trái) và Gram âm(phải) Sau khi nhuộm với phức hợp gentians - iod, mẫu được xử lí tiếp với hỗn hợp khử màu, làm mất nước của các lớp peptidoglycan trong vách tế bào Gram dương, từ đó làm giảm khoảng trống giữa các phân tử và khiến vách tế bào bắt giữ phức hợp gentians – iod bên trong tế bào. Đối với vi khuẩn Gram âm, dung dịch alcohol 90% đóng vai trò là chất hoà tan lipit và làm tan màng ngoài của vách tế bào. Lớp peptidoglycan mỏng (chỉ khoảng 10 nm) không thể giữ lại phức hợp gentians – iod và tế bào Gram âm bị khử màu và bắt màu thuốc nhuộm bổ sung. 6. Những sai lầm có thể gặp trong phương pháp nhuộm Gram - Có những sai lầm trong phương pháp nhuộm Gram làm cho vi khuẩn Gram dương nhuộm thành màu hồng của vi khuẩn Gram âm, đó là: + Phết vi khuẩn ở lứa cấy qúa già (trên 24h), cấu trúc vách vi khuẩn gram dương không còn bền chặt như ở lứa cấy trẻ, do vậy mất khả năng ngăn cản sự tẩy màu của alcohol. + Dung dịch lugol không còn tốt, do đã pha quá lâu và mất đi iod. Trường hợp này có thể nhận biết khi dung dịch lugol không còn sậm màu. + Tẩy màu bằng alcohol quá lâu đã làm cho vi khuẩn Gram dương cũng bị tẩy màu. - Có những sai lầm trong phương pháp nhuộm Gram làm cho vi khuẩn Gram âm nhuộm thành màu tím của vi khuẩn Gram dương, đó là: + Phết vi khuẩn quá dầy làm cho alcohol không thể tẩy màu toàn bộ vi khuẩn trong phết nhuộm. + Tẩy màu bằng alcohol quá ngắn hay dung dịch alcohol bị pha quá loãng làm cho màu Gram không được tẩy khỏi tế bào vi khuẩn. NHUỘM KHÁNG ACID 1. Nguyên tắc Do tế bào vi khuẩn kháng acid có lớp vỏ sáp bao bọc nên khi đã nhuộm được phức hợp màu carbolfuchsin, phức hợp này sẽ không bị tẩy màu bởi dung dịch tẩy màu mạnh (acid, alcohol acid). Tuy nhiên để phức hợp màu này có thể thấm xuyên qua lớp vỏ sáp của vi khuẩn, có hai cách: (1) Đun nóng phết nhuộm với dung dịch màu carbolfuchsin, nhờ đó mà carbolfuchsin thấm qua lớp vỏ sáp của vi khuẩn để nhuộm màu vi khuẩn; đây là phương pháp nhuộm nóng Ziehl Neelsen. (2) Phương pháp thứ hai là phương pháp nhuộm lạnh còn gọi là phương pháp Kinyoun, trong phương pháp này người ta dùng dung dịch carbolfuchsin đậm đặc, nhờ vậy khi phủ dung dung dịch màu đậm đặc này lên phết nhuộm với thời gian lâu, carbolfuchsin vẫn có thể thấm qua lớp vỏ sáp để nhuộm màu vi khuẩn. 2. Chuẩn bị - Dụng cụ: Lam kính sạch, que cấy, giá nhuộm, giá cắm, bôcan, - Hoá chất: Các thuốc nhuộm Ziehl Neelsen: fuchsin kiềm với phenol; cồn acid, xanh methylen blue. Bộ thuốc nhuộm kháng acid được chứa trong các chai sẩm màu, nắp vặn chặt, giữ trong tối ở nhiệt độ phòng. - Bệnh phẩm: Đờm hoặc các dịch khác như dịch màng não, dịch màng phổi 3. Cách tiến hành - Trước hết đánh dấu tiêu bản. - Cố định tiêu bản bằng cách nhỏ 1 giọt cồn 90[sup]0[/sup] lên tiêu bản rồi đốt cháy cồn hoặc hơ qua ngọn lửa đèn cồn 3 lần. - Phủ thuốc nhuộm Fuchsin Ziehl kín hết diện tích dàn, bệnh phẩm, dùng que bông cồn đốt cháy nhẹ dưới lam kính đến khi trên mặt đồ phiến bốc hơi thì thôi, đốt như vậy 3 lần. Rửa dưới vòi nướ chảy nhẹ. - Tẩy màu với hỗn hợp cồn acid bằng cách nhúng tiêu bản vào bình chứa cồn acid, khi nào đưa lên chỉ còn vết đỏ nhạt là được. - Rửa nước - Nhuộm xanh methylen 30 giây, rửa nước, để khô soi kính hiển vi. 4. Đọc kết quả - Quan sát phết nhuộm kháng acid qua kính hiển vi, dưới vật kính dầu, trực khuẩn kháng acid bắt màu đỏ cánh sen, mảnh, còn vi khuẩn thường cũng như các nền khác như tế bào biểu mô hay bạch cầu bắt màu xanh. - Khi trả lời một kết quả nhuộm kháng acid, không được kết luận là dương tính M. tuberculosis mà chỉ trả lời là có hiện diện trực khuẩn kháng acid. 5. Các sai lầm kỹ thuật có thể gặp trong phương pháp nhuộm kháng acid - Phết nhuộm quá dày sẽ làm alcohol acid không thể tẩy hết màu carbolfuchsin, vì vậy những trực khuẩn không kháng acid vẫn bắt màu đỏ cánh sen. Tuy nhiên được có thể phân biệt đây không phải là vi khuẩn kháng acid khi quan sát màu vùng nhầy hay tế bào biểu mô hay bạch cầu xung quanh vẫn còn màu đỏ chứng tỏ màu không bị tẩy hết. Ngoài ra, trực khuẩn không có hình dạng tiêu biểu của trực khuẩn kháng acid: mập, không mảnh khảnh như trực khuẩn kháng acid thực sự. - Màu carbolfuchsin bị cặn, sẽ đóng lên phết nhuộm làm alcohol acid không thể tẩy hết màu và do vậy vi khuẩn thường vẫn nhuộm màu đỏ cánh sen như trên. Để tránh tình trạng này, phải thường xuyên lọc màu qua giấy lọc mỗi khi kiểm tra nhỏ màu carbolfuchsin lên một lam trống thấy có cặn sau khi đổ bỏ carbolfuchsin khỏi lam. - Để tránh các sai lầm trên, nên nhuộm kiểm tra chất lượng trước mỗi lô thuốc nhuộm mới pha và định kỳ mỗi tháng một lần đối với lô thuốc nhuộm đang sử dụng. CẤY VI KHUẨN VÀO CÁC LOẠI MÔI TRƯỜNG MỤC TIÊU 1.Trinh bày đúng qui trình cấy vi khuẩn vào môi trường đặcị môi trường lỏng và thạch mềm. 2. Thực hiện được kỹ thuật cấy vi khuẩn vào môi trường đặcị môi trường lỏng và thạch mềm. NỘI DUNG Cấy vi khuẩn là kỹ thuật đưa vi khuẩn vào môi trường nuôi cấy để cho chúng phát triển nhằm mục đích phân lập, xác định tính chất, làm tăng sô lượng, lưu giữ vi khuẩn... 1. CẤY VI KHUẨN VÀO MÔI TRƯỜNG ĐẶC 1.1. Cây phân vùng trên môi trường phân lập Phân lập một loại vi khuẩn là kỹ thuật nhằm tách vi khuẩn đó từ một mẫu xét nghiệm có thê có nhiều loại vi khuẩn khác nhau. Kết quả của quá trình này là có được vi khuẩn thuần nhất. Môi trường để phân lập vi khuan có thê chia thành 2 loại: có và không có chất ức chế chọn lọc. Kỹ thuật cấy phân vùng được thực hiện theo trình tự sau (Hình 8.1): - Lấy mẫu cần phân lập vi khuẩn đưa vào môi trường: Dùng que cấy vô trùng lấy mẫu đặt vào một vị trí gần rìa đĩa môi trường 1 nếu mẫu xét nghiệm ở thê lỏng và môi trường phân lập có chất ức chế chọn lọc thì nên lấy 2 hoặc 3 quai cấy (vòng ỏ đầu que cấy) hoặc dùng pipet Pasteur nhỏ 1 giọt - sau đó dàn thành một đám nhỏ khoảng 1 cm2. Nếu bệnh phẩm đã được lấy bằng tăm bông thì lăn đầu tăm bông trên một diện tích môi trường khoảng 1 cm2ề - Tạo vùng thứ nhất: Dùng que cấy đã tiệt trùng ria qua nơi đã đặt mẫu xét nghiệm tạo thành một vùng chiếm khoảng 1/4 diện tích đĩa môi trường. Tạo vùng thứ hai: Đôt que cây đê tiệt trùng sau đó ria để tạo vùng thứ hai. Những đường ria đầu tiên cắt vào một đầu các đường ria cuối của vùng thứ nhất. Diện tích vùng thứ hai chiếm khoảng gần 1/3 diện tích đĩa môi trường. Hình 8.1. Sơ đồ cấy phân vùng trên đĩa môi trường phân lập. - Tạo vùng thứ ba: Đảo mặt que cấy rồi ria tạo vùng thứ ba, cách làm tương tự như ria tạo vùng thứ hai. Diện tích vùng thứ ba cũng chiếm khoảng 1/3 diện tích đĩa môi trường. Thường ria cấy tạo thành 3 vùng là đủ. Cũng có thể tạo thêm vùng thứ tư. Tất nhiên để tạo 4 vùng thì diện tích mỗi vùng chỉ chiếm khoảng gần 1/4 diện tích đĩa môi trường. Lưu ý: Các đường ria cấy càng xít nhau càng tận dụng được diện tích bề mặt môi trường để dàn mỏng mẫu xét nghiệm. 1.2. Cây vi khuẩn lên môi trường thạch nghiêng Môi trường đặc được đun nóng hoá lỏng, đổ vào ống nghiệm, giữ ống ở tư thế nghiêng thích hợp, chò thạch đặc lại sẽ được ống thạch nghiêng. Thạch nghiêng có một mặt thoáng nghiêng hình bầu dục. Thạch nghiêng thường được sử dụng để kiểm tra độ thuần nhất của một mẫu vi khuẩn, nó thưòng có trong các bộ xác định tính chất sinh vật hoá học của vi khuẩn. Thạch nghiêng cùng thường được sử dụng để giữ chủng trong một thòi gian ngắn. Ngoài ra, một số môi trường để xác định tính chất hoá sinh của vi khuẩn cũng được làm dưới dạng thạch nghiêng. Kỹ thuật cấy trên thạch nghiêng được thực hiện theo trình tự sau: Dùng que cấy vô trùng lấy vi khuẩn, nếu là huyền dịch thì lấy một quai cấy, nêu là khuẩn lạc thì chạm đầu que cấy lên mặt khuẩn lạc là đủ. Mở nút ông môi trường, khử trùng miệng ông, rồi đặt đầu que cấy đã lấy vi khuân vào chỗ thấp nhất của mặt thạch, ria đi ria lại nhiều lần, sau đó vừa ria vừa đưa dần que cấy lên cao đến hết mặt thạch (Hình 8.2). Hình 8.2. Ria cấy vi khuẩn trên mặt thạch nghiêng (b) Hình 8.3. Cấy vi khuẩn vào ống thạch nghiêng, có cả phần đứng (a) Đôi với môi trường xác định tính chất sinh vật hoá học của vi khuẩn, ống môi trường có thê có cả phần đứng và phần nghiêng (Hình 8.3), đầu tiên vi khuẩn được cám sâu vào phần đứng, sau đó kéo que cấy lên ria trên bể mật phần nghiêng. 1.3. Cây vào môi trường thạch sâu Mục này mô tả kỹ thuật cấy mẫu xét nghiệm vào thạch ống, chỉ có phần đứng, không có phần nghiêng. Thường để nuôi cấy vi khuẩn sinh nha bào và hiếu kỵ khí tuỳ ngộ. Trình tự thực hiện kỹ thuật này như sau: Đun nóng làm lỏng hoàn toàn môi trường, sau đó để nhiệt độ hạ xuống 50°c (môi trường vẫn còn ở trạng thái lỏng). Dùng pipet Pasteur vô trùng lấy khoảng 1 giọt huyền dịch vi khuẩn. Mỏ nút ôĩig môi trường, khử khuẩn miệng ông rồi đưa đầu nhọn của pipet đã lấy vi khuẩn xuống tới đáy ông, sau đó vừa khuấy vừa từ từ rút pipet lên. Bỏ pipet vào bình đựng dung dịch sát khuẩn. Khử khuẩn miệng ống môi trường, nút ống rồi nhúng vào nước lạnh cho môi trường nhanh đặc lại, sau đó đặt vào tủ ấm. 2. CẤY VI KHUẨN VÀO MÔI TRƯỜNG LỎNG Môi trường lỏng được dùng để tăng số lượng vi khuẩn hoặc xác định tính chất sinh vật hoá học của vi khuẩn. Kỹ thuật cấy vi khuẩn vào môi trường lóng được thực hiện theo trình tự sau: Dùng pipet (hoặc que cầy) vô trùng lấy huyền dịch vi khuẩn - Mỏ nứt ông môi trường, khử khuẩn miệng ông, rồi nhỏ một giọt huyền dịch vi khuẩn (hoặc khua đầu que cấy) vào ông môi trựòng. - Bỏ pipet vào bình đựng dung dịch sát khuẩn (hoặc khử khuân que cây đặt lên giá). Khử khuẩn miệng ông môi trường, nút ông, lắc cho vi khuân phân bô đều rồi đặt vào tủ ấm. 3. CẤY VI KHUẨN VÀO MÔI TRƯỜNG THẠCH MỂM Thạch mềm là môi trường có tỷ lệ thạch thấp hơn môi trường đặc nhưng chưa I trạng thái lỏng. Môi trường này thường dùng đê xác định tính chất di động của vi khuẩn, đôi khi cũng được dùng đề giữ chủng trong một thời gian ngán. Kỳ thuật cấy vi khuẩn vào thạch mềm được thực hiện theo trình tự sau: Dùng que cấy thẳng (không có vòng ở đầu) vô trùng chấm vào vi khuẩn. Mở nút ông nghiệm, khử khuẩn miệng ông, rồi cắm đầu que cấy vào chính giữa, sâu xuống tới đáy ông, sau đó rút que cấy ra sao cho đường cấy càng gọn càng tôt. Khử khuẩn miệng ông, nút ông môi trường. Khử khuẩn que cấy đặt lên giá. Đặt ông môi trường vào tủ ấm. TỰ LƯỢNG GIÁ Hãy nêu mục đích và mô tả kỹ thuật cấy phân vùng trên môi trường phân lập? Theo sự suy luận của bạn (dựa trên mục đích và sự mô tả kỹ thuật) kết quả cấy phân vùng như thê nào là đẹp, đạt và không đạt? Hãy nêu mục đích và mô tả kỹ thuật cấy vi khuẩn vào môi trường thạch nghiêng, thạch sâu, thạch mềm và môi trường lỏng? KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG(KTCL)XÉT NGHIỆM GIỚI THIỆU: Công tác kiểm tra chất lượng xét nghiệm phải được thực hiện thường xuyên liên tục để mang lại những kết quả xét nghiệm tin cậy, vừa đảm độ chính xác vừa đảm bảo độ tin cậy để khẳng định được tầm quan trọng của xét nghiệm đối với việc chẩn đoán bệnh chính xác MỤC TIÊU THỰC HIỆN : Sau khi học xong bài này, học sinh có khả năng: 1. Trình bày được các loại sai số và các bước tiến hành KTCLxét nghiệm trong các giai đoạn làm xột nghiệm. 2. Giải thớch được ý nghĩa của việc KTCL xột nghiệm trong xột nghiệm lâm sàng. NỘI DUNG: Chất lượng của các xét nghiệm đóng vai trò quan trọng trong việc chẩn đoán, điều trị và tiên lượng bệnh. Nhiệm vụ cơ bản của cán bộ làm công tác xét nghiệm y sinh học đặc biệt là xét nghiệm Hoá sinh là đảm bảo kết quả xét nghiệm của mình phải chính xác gần với trị số thực của nó. Vì vậy việc KTCL xét nghiệm là một trong những phương pháp nhằm đảm bảo kết quả xét nghiệm đáng tin cậy. Khái niệm về KTCL xét nghiệm đã được đề cập đến từ những năm 1950. Nhiều nước trên thế giới, việc KTCL xét nghiệm đã trở thành thường quy ở các phòng xét nghiệm y học (Hoá sinh, Huyết học, Vi khuẩn, Ký sinh trùng...). Năm 1967 Hội thảo quốc tế về KTCL xét nghiệm (ISQC - International Symposium on qualitycontrol) được tổ chức lần đầu năm 1963 và từ đó cho đến nay định kỳ 3 năm họp một lần ở nhiều nước trên thế giới. ở Việt Nam công tác KTCL xét nghiệm bắt đầu được đề xuất từ 1976 và nay đã được đưa vào chương trình giảng dạy. Mục đích của việc KTCL xét nghiệm là để phát hiện ra các sai số trong quá trình làm xét nghiệm, qua đó hạn chế đến mức tối đa các sai số nhằm đảm bảo kết quả xét nghiệm chính xác. Kết quả xét nghiệm sẽ giúp cho việc tăng cường chất lượng phòng dịch, chẩn đoán, điều trị, theo dõi tiên lượng bệnh góp phần vào công tác chăm sóc và bảo vệ sức khoẻ toàn dân. Đảm bảo cho việc thực hiện tốt KTCL xét nghiệm cần phải thực hiện tốt 3 giai đoạn của quá trình làm xét nghiệm. Giai đoạn trước xét nghiệm: là giai đoạn chuẩn bị làm xét nghiệm, chuẩn bị cho việc lấy bệnh phẩm, chuẩn bị bệnh nhân, chuẩn bị thuốc thử và các dụng cụ cần thiết cho xét nghiệm. Giai đoạn xét nghiệm: gồm tất cả các bước tiến hành xét nghiệm, tiến hành làm tay hoặc làm máy, tinh kết quả xét nghiệm. Giai đoạn sau xét nghiệm: Sử dụng kết quả xét nghiệm vào các mục đích đặt ra. ở các giai đoạn trên đều có thể có những nguyên nhân dẫn đến sai số. Vì vậy, cần phối hợp mọi khâu, mọi giai đoạn để khắc phục và loại trừ sai số để cho kết quả xét nghiệm có đủ độ tin cậy. I- KTCLXN Ở GIAI ĐOẠN TRƯỚC KHI LÀM XÉT NGHIỆM. Trong giai đoạn này việc đảm bảo lấy mẫu xét nghiệm một cách chính xác góp phần không nhỏ vào kết quả tin cậy của xét nghiệm. Lấy mẫu làm xét nghiệm là khâu đầu tiên của công tác xét nghiệm. Nếu khâu này có một cán bộ chuyên trách đảm nhận thì quy trình lấy mẫu sẽ được đảm bảo. Tuy nhiên phần này các cán bộ làm công tác xét nghiệm đều phải nắm được các nguyên tắc cơ bản và thành thạo các kỹ thuật lấy bệnh phẩm, góp phần hạn chế sai số của kết quả xét nghiệm và đảm bảo chất lượng xét nghiệm ở giai đoạn đầu tiên này. 1. Cách lấy và bảo quản bệnh phẩm làm xét nghiệm (xem sách thực hành hoá sinh). 2. Những thay đổi sinh lý của kết quả xét nghiệm. Một số yếu tố có thể ảnh hưởng đến kết quả xét nghiệm: Giới: một số chất như hemoglobin, acid uric nam cao hơn nữ, các enzym GOT, GPT nam giao động rộng hơn nữ. các hormon... Tuổi: một số chất có nồng độ thay đổi theo lứa tuổi: + Trẻ sơ sinh có bilirubin, phosphatase kiềm cao hơn, ure, creatinin, protein, glucose máu thấp hơn người lớn. + Creatinin, cholesterol, phosphatase kiềm huyết thanh ở người cao tuổi cao hơn ở người trưởng thành. - Chế độ ăn và tình trạng dinh dưỡng của cơ thể cũng ảnh hưởng đến nồng độ một số chất trong huyết thanh. Sau bữa ăn triglycerid, đường, ure tăng nhẹ, gama GT, AST tăng nhẹ sau uống rượu, chất cetonic niệu tăng khi đói.... Thuốc lá làm tăng HbCO máu, cà phê làm tăng phân huỷ đường, lipid và làm acid béo huyết thanh tăng. - Chế độ luyện tập có thể làm tăng CK (creatinin kinase) tăng AST (aspartat aminotransferase), xuất hiện hemoglobin niệu, tăng một số hormon như adrenalin, hormon sinh dục. - Một số thuốc bệnh nhân dùng cũng có thể ảnh hưởng đến kết quả một số xét nghiệm. + Morphin và cocain làm tăng amylase. + Suffonamid, nimifon làm tăng bilirubin. + Corticoid làm tăng cholesterol... 3. Chuẩn bị dụng cụ để lấy bệnh phẩm. - Bơm tiêm - ống nghiệm chứa máu. - Bộ và ống nghiệm chứa nước tiểu. Tất cả phải vô trùng, khô để chống nhiễm khuẩn và vỡ hồng cầu. II. KTCL Ở GIAI ĐOẠN XÉT NGHIỆM. Trong giai đoạn này, các bước tiến hành xét nghiệm có thể dẫn đến sai số như: - Bước lấy bệnh phẩm hoặc pha loãng bệnh phẩm. - Lấy thuốc thử để lên màu phản ứng. - Trộn đều và để thời gian phản ứng. - Đo màu và tính kết quả. ở mỗi bước trong quá trình tiến hành xét nghiệm đều có thể có các sai số không thể tránh khỏi mặc dù người làm xét nghiệm thao tác rất thận trọng. Mục đích KTCL xét nghiệm giai đoạn này là để phát hiện được các sai số trong quá trình làm xét nghiệm và hạn chế đến mức thấp nhất những sai số. Sai số lý thuyết sảy ra trong quá trình làm xét nghiệm là sai số kỹ thuật. 1. Các loại sai số kỹ thuật. Sai số bất ngờ: (Random error): là sai số khó tránh và xảy ra một cách ngẫu nhiên và có thể do các nguyên nhân. + Do thuốc thử hỏng. + Dụng cụ để đo thể tích không chuẩn xác. + Máy đo và các thiết bị làm xét nghiệm không ổn định. + Thao tác của người làm xét nghiệm chưa thuần thục. Sai số hệ thống (Systematic error): nguyên nhân của sai số này gặp khi: + Chất lượng thuốc thử xấu. + Kỹ thuật xét nghiệm không đặc hiệu. + Hoá chất chuẩn sai hoặc không chính xác. Loại bỏ sai số này chỉ có thể thực hiện được khi ta phát hiện được nguyên nhân gây sai số. Sai số bất thường (Gross error): là sai số "thô bạo" thường xảy ra do: + Không thực hiện đúng trình tự làm xét nghiệm. + Nhầm lẫn thuốc thử, nhầm lẫn bệnh phẩm , dụng cụ đo lường, nhầm bước sóng khi đo màu. + Tính kết quả sai. Loại sai số này có thể tránh được nếu các xét nghiệm viên thận trọng trong quá trình làm xét nghiệm và tổ chức tốt phòng xét nghiệm. Các loại sai số phải được khắc phục trong quá trình làm xét nghiệm. Khắc phục và loại trừ các sai số trong quá trình xét nghiệm là KTCL xét nghiệm. 2. KTCL xét nghiệm trong phòng xét nghiệm. Trong một phòng xét nghiệm thực hiện KTCL xét nghiệm còn được gọi là nội KTCL. Mục đích: - Đánh giá những kết quả xét nghiệm thực hiện ở mỗi phòng xét nghiệm. - Đảm bảo tính tin cậy của các kết quả xét nghiệm. - Giúp cho mỗi phòng xét nghiệm tự đánh giá được giá trị của kỹ thuật xét nghiệm cùng sự hoạt động có hiệu quả phòng xét nghiệm của mình. - Đánh giá tay nghề của mỗi một cán bộ làm xét nghiệm. - So sánh kết quả xét nghiệm của phòng mình với những kết quả xét nghiệm của những phòng xét nghiệm khác áp dụng cùng loại kỹ thuật. + Chương trình KTCL xét nghiệm bao gồm: - Kiểm tra độ chính xác (Precision). - Kiểm tra độ xác thực (Aceuracy). Một kết quả xét nghiệm được coi là tin cậy khi nó có đủ hai thông số là độ chính xác và độ xác thực. Chính xác + xác thực = tin cậy Qua các thông số thống kê ta có thể xác định được độ tin cậy của kết quả xét nghiệm. 2.1- Kiểm tra độ chính xác: Điều kiện bình thường: Tiến hành xét nghiệm trong điều kiện hàng ngày của phòng xét nghiệm. Điều kiện tối ưu: Tiến hành xét nghiệm trong thời gian ngắn,sử dụng cùng một loại máy cho các xét nghiệm,dùng các thuốc thử mới pha, chọn một kỹ thuật viên .thành thạo để làm tất cả các xét nghiệm. - Khái niệm độ chính xác-Độ xác thực: +Độ xác thực của một phương pháp có được khi các trị số thu được xấp xỉ như trị số thực +Độ chính xác là kết quả xét nghiệm thu được phân tán ít so với trị số trung bình (.) Độ chính xác tương ứng với khoảng cách giữa kết quả xét nghiệm riêng lẻ với trị số trung bình. Sự phân tán của các kết quả xét nghiệm thu được càng nhỏ thì độ chính xác càng cao và đồ thị hình chuông hẹp. Ngược lại, sự phân tán của các kết quả xét nghiệm thu được càng lớn độ chính xác càng thấp và đồ thị hình chuông dẹt. Độ chính xác thấp là do nguyên nhân sai số bất ngờ, sai số bất thường, những sai số này có thể tránh được. Nguyên tắc kiểm tra độ chính xác là kiểm tra tính "lặp lại" các kết quả xét nghiệm (làm nhiều lần xét nghiệm với cùng một kỹ thuật trên cùng một mẫu xét nghiệm). - Huyết thanh kiểm tra (mẫu để kiểm tra). + Tự chế tạo lấy huyết thanh kiểm tra. Nếu phòng xét nghiệm tự tạo lấy huyết thanh kiểm tra cần chú ý: * Nồng độ các thành phần trong huyết thanh kiểm tra độ chính xác không được biết nhưng không được rơi vào vùng bệnh lý. * Thu thập huyết thanh dùng làm mẫu kiểm tra bằng cách: hàng ngày thu thập các mẫu huyết thanh thừa trong phòng xét nghiệm (loại các huyết thanh vỡ hồng cầu, huyết thanh đục, tăng bilirubin), huyết thanh được tập chung vào chai 2-3 lit, đặt trong tủ lạnh - 20oC, khi đủ số lượng cho nhu cầu kiểm tra, làm tan huyết thanh ở nhiệt độ thường rồi trộn đều, khuấy từ trong một giờ tránh sủi bọt sau đó lọc hoặc ly tâm 3000v/phút/30phút để loại cục sợi huyết. Hỗn hợp được gọi là huyết thanh kiểm tra sẽ được chia thành nhiều lọ nhỏ, vô khuẩn chứa 10 - 20 ml đậy kín bảo quản ở - 20oC. Khi tiến hành kiểm tra, mỗi lần lấy ra 1 lọ kiểm tra độ chính xác (khi dùng huyết thanh kiểm tra cần làm tan và trộn đều trước khi làm kiểm tra). Huyết thanh kiểm tra này có thể ổn định từ 6 tháng đến 1 năm (có thể cho thêm 10 - 20 mg methiotal cho 100ml huyết thanh để chống nhiễm khuẩn). + Dùng mẫu chuẩn để làm huyết thanh kiểm tra. - Những thông số thống kê sử dụng trong việc kiểm tra độ chính xác. + Sự phân phối chuẩn - Đường cong Gauss. Phân phối chuẩn là sự phân phối đối xứng qua trị số trung bình, đường cong hình chuông hoặc đường cong phân bố chuẩn - phân bố đều. + Trị số trung bình (đọc là x ngang): là thông số được tính theo công thức: S xi x1 + x2 + ...+xn = ------------ = --------------------- n n trùng với trung vị khi phân phối chuẩn là phân phối đều, khi số lượng kết quả là số lớn. Trị số trung bình và trung vị chưa cho ta thấy sự phân tán của các trị số kết quả. Khắc phục điều này có thông số phương sai, độ lệch chuẩn và hệ số phân tán. + Phương sai(V): Công thức tính V: S (xi - )2 V = ---------------- n - 1 S (xi - )2 là tổng số bình phương các hiệu số của mỗi trị số kết quả với trị số trung bình. n là số lượng các trị số riêng biệt. + Độ lệch chuẩn (SD - S - standard deviation) SD được đọc là sicma - d. Công thức tính d: với điều kiện n < 30. Độ lệch chuẩn đánh giá sự phân tán của các trị số riêng biệt bằng trị số tuyệt đối. Một phân bố được gọi là chuẫn thì 68% trị số nằm trong giới hạn + 3d. 95% trị số nằm trong giới hạn + 2d. 99,7% trị số nằm trong giới hạn + d. Thông thường người ta lấy giới hạn + 2d là vùng của các giá trị bình thường trong phân phối chuẩn. + Hệ số phân tán (CV - Coefficient of variation) CV là tỷ số biểu thị dưới dạng phần trăm của độ lệch chuẩn trên trị số trung bình. d CV = ------------ . 100 Thông thường CV của các kỹ thuật xét nghiệm các thông số bình thường như: định lượng glucose huyết thanh, cholesterol huyết thanh, acid uric huyết thanh, bilirubin huyết thanh, creatinin huyết thanh.... cho phép < 5%. Các xét nghiệm về enzym, hormon... có độ giao động sinh học lớn, cv cho phép từ 5 - 10%. Để thuận lợi cho việc KTCL xét nghiệm cần lập bảng tính toán sau: N Kết quả xi xi - (xi - )2 x1 x2 ... xn S xi S (xi - )2 Từ bảng trên tính ra được , d, CV... - Quy trình thực hiện kiểm tra độ chính xác. + Thiết lập bảng tính toán các thông số đánh giá độ chính xác. Loại xét nghiệm kiểm tra Kỹ thuật xét nghiệm được dùng Tháng/năm Mẫu kiêmt tra số:... Ngày KQ xi xi - (xi - )2 Người làm XN Các thông số sẽ được tính toán: ,d,CV% Chữ ký của người phụ trách. + Các bước tiến hành kiểm tra độ chính xác. Bước một tiến hành kiểm tra độ chính xác thời kỳ sơ bộ. Thời kỳ này huyết thanh kiểm tra được sử dụng để định lượng các chất riêng biệt trong 20 ngày. Kết quả định lượng này được sử dụng để tính toán các thông số , d cho từng loại xét nghiệm theo bảng tính toán các thông số đánh giá độ chính xác, các thông số này dùng để vẽ các bảng kiểm tra độ chính xác cho từng loại xét nghiệm. Bước hai tiến hành kiểm tra độ chính xác thời kỳ chính thức. Huyết thanh kiểm tra được làm song song cùng với lô xét nghiệm thường quy. Kết quả tính toán được sẽ sử dụng vào 2 bảng. * Bảng tính toán số liệu hàng ngày kiểm tra độ chính xác (ghi ngày làm xét nghiệm và kết quả vào bảng). * Bảng kiểm đã được xác lập từ kiểm tra độ chính xác thời kỳ sơ bộ (đánh dấu vào bảng kiểm đúng vị trí và ngày làm xét nghiệm). Chú ý giai đoạn này không dùng giá trị của các mẫu kiểm tra độ chính xác được làm cùng với lô xét nghiệm để điều chỉnh kết quả xét nghiệm thường quy. + Đánh giá độ chính xác Qua kết quả tiến hành kiểm tra độ chính xác thời kỳ chính thức ta có thể đánh giá việc kiểm tra độ chính xác qua: - Qua bảng kiểm tra: xác định các trường hợp. 1- Số trị số nằm ngoài giới hạn báo động. 2- Số trị số nằm trong giới hạn tin cậy. Kết luận về kiểm tra độ chính xác qua 2 thông số trên. Độ chính xác tốt là không hoặc dưới 5% số điểm kiểm tra rời khỏi vùng giới hạn tin cậy. - Qua hệ số phân tán: qua bảng tính toán số liệu hàng ngày trong 1 tháng ta tính được CV. Hệ số phân tán (CV) trong điều kiện làm xét nghiệm bình thường đối với các thông số nồng độ protein huyết thanh, glucose huyết thanh, ure máu, acid uric máu... chỉ cho phép CV < 5%. Nếu với các xét nghiệm đặc biệt như nồng độ creatinin, cholesterol, bilirubin, hoạt độ các enzym thì CV có thể cho phép từ 5- 10%. Kiểm tra chất lượng xét nghiệm- kiểm tra độ xác thực Mỗi chất trong mẫu thử đều có trị số thực của nó, việc xác định trị số thực của mỗi thành phần trong một mẫu huyết thanh hay mẫu chuẩn hết sức khó khăn. Những kết quả có trị số gần đến thực là trị số có độ xác thực cao. Mục đích kiểm tra độ xác thực của kỹ thuật là phát hiện và loại bỏ những sai số hệ thống có thể xảy ra trong quá trình làm xét nghiệm. Một phương pháp xét nghiệm thu được kết quả đúng khi kết quả xấp xỉ bằng trị số thực của nó. Các tình huống trong kiểm tra chất lượng xét nghiệm có thể gặp giống như bắn bia. Trị số thực là khái niệm lý tưởng rất khó thực hiện được trên thực tế mà chỉ có giá trị số thực theo quy ước. Người ta phải làm lặp lại nhiều lần trên cùng mẫu và kết quả cũng lặp lại nhiều lần được coi là số thực. Mẫu kiểm tra độ xác thực - các loại chuẩn. Chuẩn cấp một - hoá chất tinh khiết, trọng khối được xác định bằng phương pháp cân, từ đó pha thành dung dịch chuẩn cấp 1. Chuẩn cấp hai - hoá chất tinh khiết mà trọng khối xác định bằng phương pháp hoá học, từ đó pha thành dung dịch chuẩn cấp 2 và đối chiếu với dung dịch chuẩn cấp 1. Mẫu chuẩn: dung dịch mẫu chứa nhiều thành phần tương tự huyết thanh, thành phần trong mẫu được xác định bằng các xét nghiệm hoá học. Ngày nay người ta pha kít để sử dụng và mỗi kít có thể có dung dịch chuẩn tiện lợi cho người sử dụng. Trên thực tế người ta có các dung dịch chuẩn và huyết thanh kiểm tra. Huyết thanh kiểm tra có hai loại: - Loại có chứa các chất nồng độ tương đương với trị số bình thường (N). - Loại có chứa các chất mà nồng độ tương đương bệnh lý (P). Ngoại KTCLXN :Mỗi phòng xét nghiệm sẽ tiến hành KTCL trên cùng một mẫu huyết thanh kiểm tra .Kết quả được gửi về trung tâm để phân tích và thông báo phản hồi về chất lượng xét nghiệm của từng phòng xét nghiệm III. KTCLXNGIAI ĐOẠN SAU KHI LÀM XÉT NGHIỆM Giai đoạn này chủ yếu là sử dụng kết quả xét nghiệm và vận dụng kết quả xét nghiệm vào thực tế lâm sàng.Giai đoạn này người cán bộ xét nghiệm phải đảm bảo tính chính xác của qui trình tính toán và ghi phiếu xét nghiệm .Thầy thuốc phải lưu ý đến ảnh hưởng của chế độ ăn ,thuốc uống ,điều kiện sống ,tuổi ,giới tính......đều ảnh hưởng đến kết quả xét nghiệm IV.GIỚI HẠN CÁC SAI SỐ: Dựa vào ba yếu tố sau. 1.Chất lượng thuốc thử và mẫu Không làm bẩn thuốc thử và mẫu .Chú ý điều kiện bảo quản (nhiệt độ ,ánh sáng,thời gian bảo quản) 2.chất lượng dụng cụ Dụng cụ thuỷ tinh phải sạch ,khô ,cân phải chính xác,máy móc phải chuẩn 3.chất lượng thao tác Kỹ thuật viên phải thao tác chính xác ,hút pi pet phải chuẩn , đọc chính xác vạch lõm của dung dịch ,lắc trộn đều ,thời gian tiếp xúc phản ứng phải vừa đủ ,điều kiện phản ứng phải thực hiện đúng . Tránh các sai số thô bạo TỰ LƯỢNG GÍA Trả lời các câu sau 1.Trình bày các loại sai số trong xét nghiệm 2.Nêu các công thức tính toán trong KTCL 3.Trình bày những thay đổi sinh lý của kết quả xét nghiệm 4.Trình bày các loại mẫu chuẩn và huyết thanh kiểm tra 5.Trình bày giới hạn các sai số Phân biệt đúng sai các câu sau 6.Để có mẫu chuẩn cấp một chất mẫu phải tinh khiết 7.Phải chú ý đến chất lượng thuớc thử.nước cất 8.Phải kiểm tra đồng hồ, nhiệt kế khi làm xét nghiệm 9.Nhầm lẫn mẫu bệnh phẩm là sai số thô bạo TÀI LIỆU ĐỌC THÊM: 1. Kỹ thuật cơ bản của phòng xét nghiệm. Eliênn Levy Lambert, 1978 2. Kỹ thuật cơ bảnở phòng khám đa khoa khu vực - Vụ khoa học và Đào tạo Bộ Y tế, 1991. 3. Kỹ thuật xét nghiệm hoá sinh lâm sàng - Tài liệu đào tạo kỹ thuật viên Bệnh viện Bạch mai, 2001 4. Xét nghiệm cơ bản - Bộ Y tế, 1995 5. Thực tập hoá sinh- đại học y hà nội-2001 6. Hoá sinh lâm sàng- Đại học y dược TPHCM (1996) TÀI LIỆU ĐỌC THÊM: 1. Eliênn Levy Lambert, Kỹ thuật cơ bản của phòng xét nghiệm, 1978 2. Vụ khoa học và Đào tạo Bộ Y tế, Kỹ thuật cơ bảnở phòng khám đa khoa khu vực, 1991. 3. Tài liệu đào tạo kỹ thuật viên Bệnh viện Bạch mai, Kỹ thuật xét nghiệm hoá sinh lâm sàng, 2011 4. Bộ Y tế, Xét nghiệm cơ bản, NXB Y học,1995 5. Đại học y hà nội, Thực tập hoá sinh- 2012 6. Đại học y hà nội, Thực tập vi sinh - 2012 7. Bộ Y tế. Quyết định số 2912/QĐ-BYT ngày 4 tháng 8 năm 2006 về việc thành lập Ban Tư vấn an toàn sinh học. 8. Bộ Y tế. Quy chế Quản lý chất thải y tế (Ban hành kèm theo Quyết định số 43/2007/QĐ- BYT ngày 03 tháng 12 năm 2007 của Bộ trưởng Bộ Y tế).