Giáo án kỹ thuật gen

MỞ ĐẦU Đối với cơ thể đơn bào thì chu kỳ sống của tế bào cũng là chu kỳ sống của cơ thể và chúng được kiểm soát trực tiếp bởi các yếu tố môi trường. Đối với cơ thể đa bào tồn tại nhiều quần chủng tế bào soma, mỗi quần chủng được đặc trưng bởi nhịp điệu sinh trưởng và phân bào ổn định, được kiểm soát bởi mối tương quan giữa các tế bào, các mô cơ thể và môi trường. Tuy nhiên, dù là cơ thể đơn bào hay đa bào thì chu kỳ sống của chúng đều được điều chỉnh bởi nhiều cơ chế. Vấn đề đặt ra là chu kỳ tế bào là gì? Bản chất của hệ thống điều chỉnh chu kỳ tế bào ra sao? NỘI DUNG I- CÁC THỜI KỲ CỦA CHU KỲ TẾ BÀO: 1- Khái niệm về chu kỳ tế bào: Một trong những đặc tính cơ bản của tế bào sống là đặc tính sinh sản, tức là khả năng tự sinh ra cơ thể giống mình. Đặc tính sinh sản của cơ thể có cơ sở ở sự phân bào. Năm 1882, W. Flemming phát hiện ra hiện tượng phân bào có tơ (mitosis) sau khi tế bào đã trải qua một thời gian sinh trưởng. Về sau các nhà tế bào học phát hiện ra phân bào được xen kẽ với thời gian sinh trưởng theo từng chu kỳ. Chu kỳ tế bào (cell cycle) là thời gian diễn ra kể từ thời điểm tế bào được hình thành nhờ phân bào của tế bào mẹ vè kết thúc bởi sự phân bào để hình thành tế bào mới. Như vậy thời kỳ phân bào được xen kẽ bởi thời kỳ giữa các lần phân bào được gọi là gian kỳ. 2- Các thời kỳ của chu kỳ tế bào: Chu kỳ tế bào chia ra làm 2 thời kỳ chính: Kỳ trung gian (interphase) và kỳ phân bào (mitosis). 2.1- Gian kỳ: Trong cơ thể đa bào, các tế bào sinh dưỡng (tế bào soma) được biệt hoá khác nhau để thực hiện chức năng khác nhau, cho nên thời gian kéo dài chu kỳ sống của chúng có nhiều thay đổi không giống nhau, đặc biệt là gian kỳ. Trung bình chu kỳ sống của đa số tế bào kéo dài từ 8 giờ đến 100 ngày, trong đó, thời gian của gian kỳ là thay đổi còn thời gian của phân bào là ổn định, chỉ chiếm khoảng 1 giờ. Loại tế bào Thời gian chu kỳ tế bào 1. Tế bào phôi sớm 30 phút 2. TB nấm men 1,5 đến 3 giờ 3. Tế bào biểu mô ruột Khoảng 12 giờ 4. Nguyên bào phôi động vật có vú Khoảng 20 giờ 5. Tế bào gan Khoảng 1 năm 2.1.1- Pha G1: Thời gian của G1 kéo dài từ ngay sau khi tế bào được tạo thành do phân bào cho đến khi bắt đầu pha S. Thời gian của pha G tuỳ thuộc vào chức năng sinh lý của tế bào: Loại tế bào Thời gian G1 1. Tế bào phôi sớm 30 phút đến 1 giờ 2. Tế bào gan động vật có vú 1 năm 3. Nơron thần kinh Kéo dài suốt đời sống cơ thể 4. Tế bào ung thư Bị rút ngắn rất nhiều Pha G1 là pha sinh trưởng của tế bào, xảy ra sự tổng hợp các ARN và protein. Vào cuối pha G1 có một thời điểm gọi là điểm hạn định R (Restriction point). Nếu tế bào vượt qua điểm R, chúng sẽ tiếp tục đi vào pha S. Nhân tố điều chỉnh thời điểm R là phức hệ protein- cyclin gồm có cyclin D, cyclin E và enzim kinaza). Đối với các tế bào biệt hoá thì chúng không vượt qua R mà đi vào quá trình biệt hoá tế bào. Các tế bào phôi thường có chu kỳ ngắn, chỉ khoảng 30 phút đến 1 giờ, bởi vì ở chúng không có pha G1. Các yếu tố của G1 cần thiết cho sự tái bản ADN ở pha S đã được chuẩn bị trước và có sẵn trong tế bào chất của tế bào trứng. 2.1.2- Pha S: Pha S được gọi là pha tổng hợp ADN, vì trong pha này xảy ra sự tái bản ADN và nhân đôi số lượng NST của tế bào, tổng hợp protein histon. Trong pha G1, tế bào đã chuẩn bị điều kiện cho pha S: Vào cuối pha G1, tế bào tổng hợp một loại protein đặc trưng là Cyclin A và được tích luỹ trong nhân tế bào. Cyclin A cùng với kinaza sẽ xúc tiến tái bản ADN. Cyclin A tác động cho tới cuối pha S thì biến mất. Thời gian kéo dài của pha S ở đa số tế bào nhân chuẩn tương đối cố định (từ 6 đến 8 giờ). Sau pha S, hàm lượng ADN sẽ tăng gấp đôi. 2.1.3- Pha G2: Thời gian của G2 ngắn, khoảng từ 4 đến 5 giờ. Trong pha G2 sẽ tổng hợp các ARN và protein chuẩn bị cho phân bào. Cuối pha G2, cyclin B được tổng hợp và được tích luỹ trong nhân tế bào cho đến tiền kỳ phân bào. Cyclin B hoạt hoá enzim kinaza và đóng vai trò quan trọng trong sự tạo thành các ống tubulin để hình thành thoi phân bào. Chất colchisin có tác dụng ức chế sự tạo thành các vi ống gây ức chế phân bào. Người ta thường sử dụng các chất vinblastin và vincristin chiết xuất từ cây dừa cạn làm thuốc chống ung thư, vì chúng ức chế sự tạo thành vi ống ở G2, do đó không tạo thành thoi phân bào ở M, dẫn đến ức chế sự phân bào của các tế bào ung thư. 2.2- Pha M: Tiếp theo pha G2 là pha M (Mitosis): thời kỳ tế bào mẹ phân chia thành 2 tế bào con. Sự phân bào là hình thức sinh sản của tế bào, đồng thời là phương thức qua đó tế bào mẹ truyền thông tin di truyền trong ADN cho 2 tế bào con. Sự phân bào cùng với sự tổng hợp các chất nội bào và gian bào là cơ sở của sự tăng trưởng các mô, các cơ quan và cơ thể đa bào. Người ta phân biệt 4 dạng phân bào sau: - Trực phân. - Nội phân. - Nguyên phân. - Giảm phân. 2.2.1- Phân bào trực phân: Dạng phân bào này đặc trưng cho các tế bào đã biệt hoá cao, các tế bào bệnh lý. Trong trực phân, nhân tế bào được nhân đôi một cách đơn giản, không xuất hiện các NST cũng như thoi phân bào. Nhiều khi, nhân tế bào được phân thành 2 nửa không đều nhau hoặc phân thành nhiều mảnh, mọc chồi. Tế bào chất có thể được phân đôi cùng với nhân hoặc không phân chia, tạo thành các tế bào hai nhân hoặc đa nhân. Ví dụ tế bào gan. 2.2.2- Phân bào nội phân: NST được nhân đôi nhưng không phân li, do đó tạo thành tế bào đa bội (Polyploid). Trong trường hợp các sợi nhiễm sắc được nhân đôi nhiều lần do nhân đôi của ADN nhưng số NST không đổi sẽ dẫn đến hiện tượng đa sợi (Polytenia) và thể nhiễm sắc đa sợi (Polytene Chromsome). 2.2.3- Phân bào nguyên nhiễm: a- Đặc điểm: Đây là dạng phân bào phổ biến cho tất cả các tế bào nhân chuẩn, gồm những đặc điểm sau: - Phân bào nguyên nhiễm là dạng phân bào phổ biến ở Eucaryote. - Kết quả của phân bào hình thành 2 tế bào con có chứa số lượng NST giữ nguyên như tế bào mẹ. - Xuất hiện sự nhân đôi NST và sự phân chia NST về 2 tế bào con. - Xuất hiện trong tế bào chất bộ máy phân bào, tức là thoi phân bào, có vai trò hướng dẫn các tế bào con dịch chuyển về 2 cực tế bào. - Trong quá trình phân bào, hạt nhân và hạch nhân biến mất và được tái tạo lại ở 2 tế bào con. b- Các kỳ của phân bào: Quá trình phân bào diễn ra theo 5 kỳ liên tiếp nhau. Sự phân nhân (caryokenesic) gồm 4 kỳ là kỳ đầu, kỳ giữa, kỳ sau và kỳ cuối. Còn sự phân chia tế bào chất (cytokinesis) để chia thành 2 tế bào con. 1, Kỳ đầu (prophase): Đặc điểm: - NST đã nhân đôi ở pha S, trở nên xoắn và cô đặc lại, hình thành nên các NST kép có hình thái và số lượng đặc trưng cho loài. - Hạnh nhân và màng giảm thể tích, phân rã và biến mất, tạo điều kiện cho NST di chuyển ra ngoại vi tế bào. - Hình thành bộ máy phân bào. Các vi ống tubulin tạo thành 2 sao phân bào. Hai sao di chuyển về 2 cực tế bào và hình thành thoi phân bào. 2, Kỳ giữa (metaphase): Màng nhân bị phân tán. Thoi phân bào chiếm ngay vị trí trung tâm tế bào. Các NST mang trung tiết, trung tiết phân hoá thành tâm động. Qua tâm động, NST kép dính với các sợi tâm động của thoi. Các NST kép xếp trên mặt phẳng xích đạo nằm thẳng góc với trục của thoi. 3, Kỳ sau (anaphase): Cohesin bị phân giải và 2 trung tiết tách khỏi nhau. Do vậy, các NST chị em tách khỏi nhau, trở thành NST con và di chuyển về 2 cực nhờ sự co ngắn của sợi tâm động phối hợp với sự kéo dài của các sợi cực và sự hẹp lại của thoi. 4, Kỳ cuối (telophase): Các NST con đã di chuyển tới 2 cực, giãn xoắn, dài ra và trở thành chất nhiễm sắc. Thoi phân bào biến mất, màng nhân hình thành. Hạnh nhân và 2 nhân con được tạo thành trong một khối tế bào chất chung. 5, Phân tế bào chất (cytokinesis): Sự phân chia tế bào chất bắt đầu từ cuối kỳ sau hoặc đầu kỳ cuối và diễn ra trong suốt kỳ cuối. Ở tế bào động vật: Sự hình thành eo thắt và lõm sâu của eo thắt tiến tới cắt đôi tế bào chất do sự hình thành một vòng co rút ở vùng xích đạo, được cấu tạo bởi vi sợi actin. Ở tế bào thực vật: Xuất hiện một vách ngang ở vùng trung tâm xích đạo. Vách ngang phát triển dần ra ngoại vi cho đến khi liên kết với vách tế bào, tách tế bào chất thành 2 nửa chứa nhân con. c, Thời gian của các kỳ và sự điều chỉnh phân bào: Đối với động vật có vú, chu kỳ tế bào có thể kéo dài từ 10 giờ đến 20 giờ, trong đó, thời gian phân bào kéo dài khoảng 1 giờ. Tuy nhiên, thời gian của M không phụ thuộc vào thời gian của chu kỳ. Thời gian của M tương đối ổn định. Kỳ đầu kéo dài khoảng 10 đến 15 phút, kỳ giữa dài từ 25 đến 30 phút. Kỳ sau ngắn nhất, khoảng từ 5 đến 8 phút. Còn kỳ cuối diễn ra khoảng 20 đến 25 phút. Các nhân tố kiểm tra sự phân bào: Nhân tố quyết định là tế bào phải trải qua pha S (phải vượt qua điểm R ở cuối G1). Sự điều chỉnh phân bào phụ thuộc vào sự điều chỉnh chu kỳ tế bào nói chung, đặc biệt là hệ protein cyclin- kinaza. Vượt qua pha G2 là điều kiện cần cho sự phân bào, vì trong pha G2, tế bào tổng hợp các protein cần thiết cho sự phân bào, đặc biệt là sự trùng hợp các ống tubulin để tạo thành vi ống. Sự chuyển tiếp từ pha G2 vào M còn phụ thuộc vào protein cyclin B, có tác dụng hoạt hoá kinaza, tạo điều kiện cho sự hình thành thoi và sự tiêu biến của màng nhân. Các nhân tố ức chế sự phân bào: Hoá chất hoá học, các bức xạ…có thể tác động lên sự tái bản ADN, lên sự hình thành thoi, lên NST hoặc lên sự phân chia tế bào chất. Các chất kháng sinh (ví dụ: actinomycen D ức chế tổng hợp ADN, streptomycin ức chế tế bào ở pha G2)…Các chất có nguồn gốc thực vật như colchicin, colcemid, podophylin, vinblastin…đều có tác dụng ức chế sự tạo thành thoi phân bào, tế bào dừng lại ở kỳ giữa, do đó hình thành các nhân đa bội. Nhiều chất làm đứt gẫy NST, hoặc không phân ly không chính xác về 2 cực (ví dụ: chất ypent, các bức xạ ion hoá; chất lithium, cysteamin, cytochalasin ức chế sự phân tế bào chất đến tạo thành tế bào đa nhân). 2.2.4- Phân bào giảm nhiễm: Phân bào giảm nhiễm gồm 2 lần phân bào, theo sơ đồ: a, Phân bào giảm nhiễm I: Phân bào giảm nhiễm I được gọi là lần phân bào giảm nhiễm thực thụ, vì qua lần phân bào I, 2 tế bào con được tạo thành có số lượng NST đơn bội kép, còn lần phân bào II diễn ra giống mitosis, trong đó một tế bào đơn bội kép phân chia thành 2 tế bào con đơn bội (các giao tử). Phân bào giảm nhiễm I có thời gian kéo dài và rất phức tạp, đặc biệt là kỳ đầu I. Kỳ đầu I được chia thành 5 giai đoạn: 1, Giai đoạn bó hoa (Leptolema): Xuất hiện các sợi nhiễm sắc co xoắn, co ngắn mang trung tiết, sắp xếp định hướng thành bó hoa và dính vào màng nhân. 2, Giai đoạn tiếp hợp (Zyonema): Sự sắp xếp có định hướng của sợi nhiễm sắc tạo điều kiện cho sự tiếp hợp cặp đôi của cặp NST tương đồng. Mỗi trung tiết tiếp hợp tương ứng với nhau, các gen tiếp hợp tương ứng với nhau. 3, Giai đoạn trao đổi chéo (Pachinema): Được đặc trưng bởi hiện tượng trao đổi chéo giữa hai NST trong cặp tương đồng. Sự trao đổi chéo xảy ra giữa các nhiễm sắc tử không phải là chị em của cặp tương đồng. Qua sự trao đổi chéo, các nhiễm sắc tử không phải chị em trao đổi các đoạn cho nhau, tức là trao đổi gen cho nhau giữa NST bố và mẹ, là quá trình được gọi là tái tổ hợp di truyền. 4, Giai đoạn sợi đôi (Diplonema): Được đặc trưng bởi sự phân ly của các cặp tương đồng, phức hệ tiếp hợp biến mất. Hai thành viên của cặp tương đồng lưỡng trị tách khỏi nhau, tuy nhiên chúng vẫn dính nhau ở vài điểm gọi là điểm chéo (chiasma). Điểm chéo chính là vùng mà ở đó, 2 NST tương đồng trao đổi gen cho nhau. Giai đoạn Diplonema tạo nên NST chổi bóng đèn (Lampbuish chromsome) có vai trò tổng hợp ARN và từ đó tổng hợp chất dinh dưỡng cần thiết cho trứng trong giai đoạn sinh trưởng. 5, Giai đoạn Diakinesis: đặc trưng của giai đoạn này là các NST ngừng tổng hợp ARN, xoắn lại, cô đặc và dày lên. Màng nhân và hạnh nhân biến mất, xuất hiện sao phân bào. Khi kết thúc kỳ đầu I, tế bào vào kỳ giữa II, kỳ sau I, kỳ cuối I và phân tế bào chất để hoàn thành phân chia I tạo ra 2 tế bào đơn bội kép. Sự giảm nhiễm từ 2n kép thành n kép là do cơ chế sắp xếp ở trung kỳ (kỳ giữa). b, Phân bào giảm nhiễm II: Lần phân bào giảm nhiễm II trải qua các kỳ: kỳ đầu II, kỳ giữa II, kỳ sau II, kỳ cuối II và phân tế bào chất để tạo thành 2 tế bào cháu mang NST đơn bội. Phân bào II tương tự với phân bào nguyên phân. Kết quả là qua 2 lần phân bào, từ một tế bào 2n kép đã tạo nên 4 tế bào chứa số lượng NST đơn bội (n), tức là các giao tử. Ta có bảng so sánh giữa phân bào nguyên nhiễm và phân bào giảm nhiễm: Mitosis Meiosis - Đặc trưng cho tất cả các dạng tế bào - Chỉ đặc trưng cho tế bào sinh dục đi vào quá trình chín để tạo giao tử - Tế bào con có bộ NST như tế bào mẹ (2n 2n) - Tế bào con có bộ NST giảm đi ½ (2n n) - Gồm 1 lần nhân đôi ADN và NST và 1 lần phân chia - Phức tạp hơn, gồm 1lần nhân đôi ADN và NST nhưng có 2 lần phân chia: I và II - Gian kỳ giữa 2 lần phân bào nguyên nhiễm có nhân đôi ADN và nhân đôi NST - Kỳ chuyển tiếp giữa phân chia I và phân chia II, không có sự nhân đôi ADN và NST - Kỳ đầu ngắn, không có tiếp hợp và trao đổi chéo - Kỳ đầu I kéo dài (hàng tháng, hàng năm), có tiếp hợp và trao đổi chéo giữa 2 NST tương đồng - Kỳ sau: yếu tố phân ly về 2 cực là 2 nhiễm sắc tử chị em của 1 NST kép, phân ly khỏi nhau, mỗi nhiễm sắc tử đi về 1 cực - Kỳ sau I: yếu tố phân ly là thành viên trong cặp tương đồng. Mỗi thành viên là NST bố hoặc mẹ (với 2 nhiễm sắc tử chị em) phân ly khỏi lưỡng trị và di chuyển về 2 cực - Phương thức sinh sản vô tính, vẫn giữ nguyên genom không đổi qua các thế hệ - Phương thức sinh sản hữu tính: bảo đảm khâu tạo thành giao tử. Nhờ tái tổ hợp di truyền tạo nên đa dạng trong genom qua các thế hệ Như vậy, vai trò của phân bào giảm nhiễm chủ yếu là: - Tạo giao tử: từ tế bào sinh dục (2n) (n): giao tử. - Khi thụ tinh, tế bào hợp tử được khôi phục lại bộ NST lưỡng bội (2n) như tế bào của bố mẹ trước lúc phân bào giảm nhiễm. - Sự trao đổi chéo trong giảm phân và sự tái tổ hợp lại toàn bộ genom của hợp tử khi thụ tinh đã tạo nên vô số các biến dị tổ hợp, là nguồn nguyên liệu quan trọng của chọn lọc tự nhiên. II- ĐIỀU CHỈNH CHU KỲ TẾ BÀO: Đối với cơ thể đơn bào thì chu kỳ sống của tế bào cũng là chu kỳ sống của cơ thể và chúng được kiểm soát trực tiếp bởi nhân tố môi trường. Đối với cơ thế đa bào, tồn tại nhiều chủng quần tế bào soma, mỗi chủng quần được đặc trưng bởi nhịp điệu sinh trưởng và phân bào ổn định. Chúng được kiểm soát do các mối tương quan giữa tế bào, các mô và cơ thể. Như vậy có thể nói, dù cơ thể đơn bào hay đa bào thì chu kỳ sống của chúng đều được điều chỉnh bởi nhiều cơ chế. Ngày nay, người ta đã phát hiện được cơ sở phân tử của cơ chế điều chỉnh chu kỳ tế bào. 1- Hệ trung tâm phát động các quá trình cần thiết của chu kỳ: Chu kỳ tế bào gồm nhiều giai đoạn nối tiếp nhau. Mỗi giai đoạn diễn ra trong một thời gian nhất định. Giai đoạn trước phải được hoàn thành thì giai đoạn sau mới có thể bắt đầu, và điều kiện của giai đoạn sau cũng phải được chuẩn bị từ giai đoạn trước. Mỗi chu kỳ tế bào đều có nhân tố điều chỉnh trung tâm, giúp cho quá trình xảy ra theo đúng trình tự, thời gian. Trong đó nhân tố điều chỉnh hoạt động như một chiếc đồng hồ qui định thời gian hoạt động của mỗi quá trình thông qua điểm chốt (check point). Điểm chốt thể hiện cơ chế điều chỉnh theo mối liên hệ ngược, nghĩa là sự hoàn thành của quá trình trước là điều kiện phát động cho quá trình sau. Hệ thống điều chỉnh chu kỳ tế bào gồm các phức hệ sinh hoá tác động theo chu kỳ. Đó là các phức hệ protein hoạt động tương tác và kích thích, phối hợp với các quá trình tiền thân cần thiết cho sự nhân đôi và phân ly của ADN. Hệ thống điều chỉnh lại được kiểm tra nhờ các “phanh” có tác động phanh hãm chu kỳ ở các điểm chốt đặc biệt. Hệ thống phanh cho phép kiểm tra hệ thống điều chỉnh của chu kỳ tế bào, do các tín hiệu từ môi trường. Các tín hiệu của môi trường tác động lên hệ thống điều chỉnh bởi 3 điểm chốt chủ yếu: - Điểm chốt thứ nhất ở giai đoạn G1 ngay trước khi vào giai đoạn S. - Điểm chốt thứ hai ở giai đoạn G2. - Điểm chốt thứ ba ở giai đoạn M. Đối với các tế bào nấm men, điểm chốt được gọi là điểm S (start point). Đối với các tế bào động vật, điểm chốt được gọi là điểm R (restriction point). 2- Hệ thống điều chỉnh chu kỳ - phức hệ các Protein-Kinaza: Hệ thống điều chỉnh chu kỳ tế bào gồm 2 họ chủ yếu: - Họ thứ nhất là các kinaza phụ thuộc cyclin- cdk (cyclin dependant kinase) có tác dụng phát động các quá trình tiền thân bằng cách gây photphoryl hoá nhiều protein đặc trưng tại gốc Serin và Threonin. - Họ thứ hai là các protein đặc biệt gọi là cyclin, đóng vai trò kiểm tra hoạt tính photphoryl hoá của cdk đối với tế bào đích. Khi cyclin liên kết với cdk thành một phức hệ thì cdk ở trạng thái hoạt tính. Còn khi cyclin tách khỏi cdk thì cdk không có hoạt tính. Như vậy, bằng cơ chế tổng hợp và phân giải protein cyclin cùng với các cơ chế tạo phức hệ và giải phức hệ cyclin- cdk, tế bào đã điều chỉnh được chu kỳ sống của mình. Có 2 nhóm cyclin chủ yếu: + Cyclin Mitos: các cyclin liên kết với cdk pha G2 và cần thiết để tế bào đi vào Mitos. + Cyclin G1: các cyclin liên kết với cdk trong giai đoạn G1 và cần thiết để tế bào đi vào giai đoạn S. Đối với nấm men chỉ có 1 loại cdk hoạt động ở cả hai điểm chốt G1 và G2. Còn đối với động vật có vú thì có nhiều loại cdk khác nhau, mỗi loại tác động cho một điểm chốt khác nhau. Sự hình thành phức hệ Cyclin- cdk ở G1 cho phép tế bào chuyển từ G1 sang S và sự hình thành cyclin ở G2 cho phép tế bào chuyển từ G2 sang pha M. Để hiểu rõ hơn cơ chế điều chỉnh này, người ta đã phân tích và lý giải bằng các nghiên cứu trên nhiều đối tượng khác nhau. 3- Chu kỳ của tế bào phôi sớm: Đối với các tế bào có chu kỳ chuẩn thì tế bào phải trải qua G1, là giai đoạn sinh trưởng đủ dài mới chuyển sang giai đoạn S để nhân đôi hàm lượng ADN, và chỉ sau khi quá trình nhân đôi của ADN hoàn thành thì tế bào mới chuyển sang pha G2 và M để phân bào. Như vậy, chu kỳ chuẩn phải kéo dài trong một thời gian đủ dài để hoàn thành các giai đoạn cần thiết trước khi phân bào và hệ thống điều chỉnh của chu kỳ hoạt động thích ứng với thời gian đó. Các tế bào của phôi ở giai đoạn phát triển sớm của nhiều động vật có chu kỳ bất thường. Chúng phân bào rất nhanh và bỏ qua pha G1. Do đó, hệ điều chỉnh phải cho phép tế bào trong thời gian ngắn nhất phải hoàn thành được các quá trình tối ưu cần thiết, là nhân đôi hệ gen và phân ly hệ gen về hai tế bào con. Nghiên cứu hệ thống điều chỉnh tế bào phôi sớm của ếch Châu Phi (xenopus) cho thấy: - Tế bào trứng của ếch là một tế bào rất lớn, đường kính khoảng 1mm, chứa một nhân nhỏ bé nhưng tế bào chất lại có khối lượng gấp 100.000 lần so với tế bào chất của tế bào bình thường. Nguyên nhân là do trong tế bào chất của trứng phải chứa nhiều chất dinh dưỡng cần thiết, đủ cho sự phát triển của trứng đến giai đoạn nòng nọc. - Sự sinh trưởng của noãn bào (Ovocyte) để tích luỹ các chất dinh dưỡng trải qua thời gian rất dài. Vì vậy, tiến trình Meiosis bị ách lại ở pha G2 của chu kỳ chuẩn. Để noãn bào vướt qua điểm chốt G2, hoàn thành chu kỳ và trở thành trứng chín, đòi hỏi phải có hoocmon tác động lên noãn bào. - Khi trứng được thụ tinh, trứng nhanh chóng phân bào nguyên nhiễm liên tục cho ra một phôi có hàng nghìn tế bào bé mà không cần tăng trưởng. Điều kiện cần duy nhất là tổng hợp và nhân đôi ADN qua mỗi chu kỳ. Mỗi chu kỳ gồm: Giai đoạn M khoảng 15 phút; gian kỳ kéo dài khoảng 15 phút đến khi nhân đôi ADN. Như vậy coi như không có G1 và G2. Sở dĩ các tế bào phôi sớm lại vượt qua được các điểm chốt G1 và G2 để đi vào M nhanh chóng vì có nhân tố tồn tại trong tế bào chất của các tế bào đang ở trạng thái phân chia phát động cho tế bào đi vào M. * Thí nghiệm 1: Các tế bào ếch đang bị ách lại ở G1 của giảm phân I: Nhân tố đó gọi là nhân tố phát động trứng chín - MPF (Maturation Promoting Factor)- cũng là nhân tố phát động mitosis hoặc meiosis (Mitosis Promoting Factor-MPF). Chính MPF cũng là nhân tố để tế bào vượt qua điểm chốt G2 đến M. Thí nghiệm 2: Được tiến hành với các tế bào động vật có vú trong Invitro: Nhân tố MPF không chỉ có tác dụng phát động để vượt qua điểm chốt G2 mà còn có thể coi là nhân tố phát động vượt qua điểm chốt G1, cho phép tế bào đi vào pha S. Nhiều thí nghiệm đã chứng minh rằng: Đối với tế bào phôi ếch sớm thì hoạt tính của MPF được tăng cao ở giai đoạn phân bào và giảm bớt ở giai đoạn gian kỳ theo chu kỳ đỉnh cao khoảng 30 phút. Như vậy, hoạt tính phân bào là tuỳ thuộc vào hoạt tính MPF. Hoạt tính của MPF đến từ tế bào chất và không phụ thuộc vào sự có hay không có của quá trình nhân đôi ADN trong nhân. Nhưng khi quá trình tổng hợp protein ở G1 bị ức chế thì hoạt tính của MPF và cả tiến trình phân bào cũng bị ức chế. Do đó, hoạt tính của MPF có liên quan đến sự tổng hợp protein cyclin trong gian kỳ. Tuy nhiên, hoạt tính của MPF không chỉ phụ thuộc vào cyclin mà còn phụ thuộc vào sự tác động của một số protein khác. Cyclin chỉ được xem là một phần của phức hệ, đóng góp vai trò điều chỉnh hoạt tính của protein kinaza (CdK) trong phức hệ MPF. Như vậy, sự tích luỹ cyclin là cần thiết cho tế bào đi vào mitos và sự phân huỷ đột ngột cyclin là cần thiết cho sự thoát khỏi mitos. Cyclin thường bị phân huỷ ở mitos khi chuyển từ trung kỳ sang hậu kỳ. Có nhiều loại cyclin tác động qua chu kỳ tế bào khi liên kết với cdk. Phức hệ MPF gồm 2 cấu thành: - Cyclin đóng vai trò điều chỉnh. - Cdk đóng vai trò là enzim kinaza mang hoạt tính. Cdk sẽ photphoryl hoá các protein cần thiết cho chu kỳ tế bào, bao gồm các protein làm cho NST đặc lại, phân huỷ màng nhân, tạo thời gian phân bào. Ở phôi ếch sớm, trong các chu kỳ tế bào đầu tiên hầu như bỏ qua G1 và G2, do đó không có tín hiệu kiểm tra ngược. Người ta cho rằng, ở đây các điều kiện tái bản cho ADN đã có đầy đủ từ môi trường dinh dưỡng trong tế bào trứng, đủ để thực hiện 12 chu kỳ phân bào mà không cần chuẩn bị trước. Tuy nhiên sau đó, cơ chế kiểm tra ngược sẽ hoạt động. Ngoài ra còn tồn tại một cơ chế kiểm tra tác động ức chế tái bản ADN xảy ra nhiều lần, nếu như ADN đó đã được tái bản qua 1 chu kỳ trước khi vào M. 4- Điều chỉnh chu kỳ tế bào ở nấm men: 4.1- Chu kỳ tế bào nấm men: Nấm men thuộc giới nấm (Fungi), cơ thể đơn bào, là đối tượng rất thích hợp trong nghiên cứu di truyền và sinh học phân tử. Chu kỳ tế bào của nấm men kéo dài khoảng 2 giờ, và nấm men cần có thời gian sinh trưởng trước khi đi vào phân bào, nghĩa là chúng cần có giai đoạn G1 và G2 trong chu kỳ. Ở giai đoạn G1 có điểm chốt là điểm S (start), giữ cho tế bào đủ thời gian sinh trưởng và tăng khối lượng gấp đôi cũng như trước khi vào giai đoạn S (nhân đôi ADN). Trong trường hợp có điểm chốt G2 thì tế bào cần phải vượt qua chốt này khi vào M. Đối với nấm men mọc chồi thì điểm S (ở G1) là quan trọng nhất, vì nó kiểm tra độ sinh trưởng về kích thước tế bào và chịu ảnh hưởng của môi trường. Còn đối với nấm men nhân đôi thì điểm chốt G2 là quan trọng hơn, vì nó kiểm soát cửa vào M. 4.2- Các gen điều chỉnh chu kỳ tế bào: Ở nấm men S.Pombe có hai thể đột biến về kiểu hình được quan tâm là thể đột biến cảm nhiệt. - Đột biến cdc2: làm cho tế bào to hơn, dài hơn bình thường, vì chúng không phân đôi (không vượt qua điểm chốt ở G2 để vào M). - Đột biến wee: làm cho tế bào bé hơn bình thường, vì tế bào mẹ lớn chưa đủ độ đã phân đôi trở thành tế bào con bé hơn (vượt qua điểm chốt G2 sớm hơn để vào M). Gen đột biến cdc2 và wee là hai dạng đặc biệt của gen dạng cdc2+. Những tế bào nấm men phân đôi dạng dại (tức là dạng bình thường) sẽ sinh trưởng và phân đôi, cho ra các tế bào con có kích thước bình thường. Gen cdc2 mã hoá cho protein cdc2. Trong trường hợp đột biến wee là dạng trội của cdc2, sẽ sinh ra nhiều protein Cdc2 hơn bình thường. Do vậy, hoạt tính của cdc2 rất cao dẫn đến phân bào sớm hơn. Còn đột biến cdc2 là đột biến lặn (ký hiệu là cdc2-) sẽ không sản sinh ra protein Cdc2 (hoặc sản suinh ra Cdc2 không hoạt tính). Như vậy, cdc2 đóng vai trò chủ chốt trong điều chỉnh chu kỳ tế bào từ G2 sang M. Người ta chứng minh Cdc2 là protein kinaza, tức là phần hoạt tính của phức hệ MPF. Gen cdc13+ mã hoá cho cyclin cdc13 (tương tự cyclin B). Chính cyclin cdc13 liên kết với cdc2 để tạo thành phức hệ MPF ở nấm men, có tác dụng để nấm men chuyển chu kỳ tế bào từ G2 sang M. Ở nấm men còn phát hiện ra hai gen cdc25 (mã hoá cho cdc25) và gen wee1 (mã hoá cho wee1): - Cdc25 là protein photphataza có tác dụng giải phóng photpho hợp phần cdc25 của MPF, do đó kích hoạt chúng. - Wee1 làpProtein kinaza có tác động photphoryl hoá đối với một kinaza khác là CAK. Kinaza CAK đóng vai trò photphoryl hoá cdc2 của MPF. Như vậy, hoạt tính của MPF (Cdc2- cdc13) được kiểm tra bởi cdc25 và wee1. 4.3- Cơ chế điều chỉnh chu kỳ: Ở nấm S.Pombe tham gia điều chỉnh hoạt tính MPF có 3 loại protein là Cdc25, Wee1 và CAK. Mô hình điều chỉnh hoạt tính của MPF: Khi nồng độ cyclin B (Cdc13) đủ liên kết Cdk (Cdc2) thì tạo thành MPF. Hợp phần Cdc2 trong MPF có thể được photphoryl hoá (liên kết với photpho) ở hai vị trí điều chỉnh là vị trí tyrosin 15 (X15) và vị trí threonin 161 (T161). Ở trạng thái này, MPF chưa có hoạt tính, chỉ khi vị trí T161 của Cdc2 bị lấy đi photpho do tác động của Cdc25 là photphataza thì MPF mới trở thành có hoạt tính, nghĩa là có khả năng liên kết với cơ chất mà nó cần photphoryl hoá. Hợp phần cyclin (Cdc13) không chỉ có vai trò cố định cdc2 mà chúng còn tham gia vào tạo thù hình liên kết của MPF với cơ chất. Đối với nấm men mọc chồi S.Cerevisiae thì điểm chốt quan trọng của chu kỳ là điểm ở G1, là điểm tế bào cần vượt qua để vào S. để vượt qua điểm S, chúng cần tối thiểu 3 điều kiện: - Kích thước tế bào phải đủ lớn. - Các chất dinh dưỡng phải được cung cấp đủ. - Nhu cầu giao phối hữu tính. Có 3 dạng đột biến cảm nhiệt ở S.Cerevisiae (nấm men): Không chồi; có chồi kích thước trung gian; chồi lớn. Cdc28 là protein kinaza hoạt tính tương tự như Cdc2 ở S.Pombe. Như vậy, các gen Cdc2 và Cdc28 đều mã hoá cho protein kinaza phụ thuộc vào cyclin (tức là cdk) nhưng hai kiểu hình đột biến cảm nhiệt khác nhau. - Đột biến Cdc2- ở S. Pomble bị ách lại ở G2. - Đột biến Cdc28 ở S.Cerevisiae bị ách lại ở G1. Vì protein Cdk là phần hoạt tính của phức hệ MPF cho nên sai khác trên đây là do protein cyclin của MPF qui định. Phức hợp MPF ở S. Pombe tác động ở G2 là do Cdc2- cyclin B. Phức hợp MPF ở S.Cerevisiae có phức hệ SPF (S-phase Promoting Factor) bao gồm hai hợp phần là cdc28 và cyclin của G1 tác động trong giai đoạn G1. Ba gen mã hoá cho các cyclin của G1 là cln 1, 2, 3. Chúng mã hoá cho các cyclin thân thuộc cln(1, 2, 3) (cyclin G). Tế bào của S.Cerevisiae có thể sinh trưởng trong môi trường giàu dinh dưỡng nếu chúng mang 1 trong những gen cln. Nếu cả 3 gen đó bị loại bỏ thì chúng sẽ chết đi và khi loại bỏ gen cln3, pha G1 sẽ kéo dài thêm vài giờ. Như vậy, phức hệ SPF bao gồm protein Cdc28 và 3 dạng cyclin (cln1, 2, 3) là phức hệ có hoạt tính kinaza cần thiết cho giai đoạn G1 chuyển sang giai đoạn S đối với S.Cerevisiae, trong đó cyclin cln nào đó sẽ làm giảm tỉ lệ số tế bào ở lại pha G1 và khi hàm lượng Cdc28- cyclin G1 được tăng cao sẽ làm cho tế bào vượt qua điểm chốt S sớm hơn để vào giai đoạn S. Trong lúc đó, nếu thiếu bất kỳ dạng cln nào thì tế bào đều bị ách lại ở G1, chứng tỏ rằng cdc28- cyclin G1 (tức phức hệ SPF) là cần thiết cho tế bào nấm men đi vào giai đoạn S. Đối với nấm men, dạng cyclin cln3 được biểu hiện suốt cả chu kỳ, với mức độ gần như ổn định, trong đó cyclin cln1 và cln2 được biểu hiện ở nửa đầu của pha G1, vì khi hàm lượng của chúng tăng cao nhanh chóng cho đến tối đa, khi tế bào vượt qua điểm chốt của G1 để đi vào S, sau đó hàm lượng của chúng giảm dần và bị giảm tối thiểu ở giai đoạn mitos. Người ta chứng minh rằng cdc28- cln1 và cln2 có vai trò photphoryl hoá APC (phức hệ phát động hậu kỳ- Anaphase Promoting Complex) làm bất động chúng (APC), cho phép tích luỹ các cyclin clb5-6 ở cuối G1. Cdc28-cln3 tác động lên kích thước của tế bào. Khi được hoạt hoá cdc28 sẽ photphoryl hoá và làm hoạt hoá 2 nhân tố phiêm mã là SBF và MBE và dẫn đến phiên mã các gen cln1 và 2 và một số gen mã hoá cho các đơn vị bé của ADN Pol, ADN lygaza và các enzim cần thiết cho sự tổng hợp ADN. Ở nấm men S.Cerevisiae có hai gen clb5 và 6 mã hoá cho cyclin clb5 và 6 và được biểu hiện ở cuối G1. Các phức hệ cdc28- clb5 và cdc28- clb6 được tích luỹ ở cuối pha G1 và bị bất hoạt do chúng liên kết với 1 nhân tố ức chế là sic1. Sic1 có mặt ở cuối mitosic và đầu G1. Sic1 đóng vai trò là nhân tố ức chế pha S, đặc biệt là ức chế cdc28- cyclin B nhưng không có tác động với phức hệ cdc28- cln. Khi tế bào vào giai đoạn S và khi nhân tố sic1 bị phân giải thì phức hệ cdc28- clb6 và cdc28- clb6 trở nên hoạt tính và phát động sự tái bản ADN. Nhân tố ức chế sic1 bị phân giải bởi proteaxom bằng con đường wbiquintin hoá do các enzim cdc34 và SCF. Vào cuối pha S có sự phân mã của 2 gen mã hoá cho dạng cyclin B là clb3 và clb4. Chúng liên kết với cdc28 tạo thành phức hệ kinaza1 cdc28- cdc3 và cdc28- cdc4 có vai trò phối hợp, nhưng đồng thời chúng có vai trò phát động sự tạo thành thoi bào khi bắt đầu Mitos. Khi sự tái bản ADN kết thúc và tế bào đi vào G2 có 2 dạng cyclin B (clb1 và clb2) đóng vai trò là cyclin của M- M- cyclin. Chúng liên kết với cdc28 tạo thành phức hệ cần thiết cho sự phân ly của NST và nhân đôi nhân ở M. Như vậy, các nhóm (nhiều nhóm) Cyclin định hướng cho Kinaza CdC28 hoạt động phù hợp với các giai đoạn khác nhau của chu kỳ tế bào. Ba dạng cyclin hoạt động trong G1 là: cln1, cln2, cln3. Hàm lượng cln3 giữ ổn định suốt chu kỳ nhưng hoạt tính của chúng bị kiểm tra bởi kích thước tế bào. Khi cdc2- cln3 hoạt động, chúng photphoryl hoá (SBF và MBE) dẫn đến sự hình thành ở cuối G1 các cyclin cln1 và cln2, các enzim và các protein khác cần thiết cho sự tái bản ADN, cũng như sự hình thành clb5 và clb6 ở cuối G1. Các enzim cln1 và cln2 tạo thành phức hệ với cdc28 có vai trò ức chế phức hệ APC, do đó cho phép tích luỹ clb5 và clb6 ở cuối G1. Phức hệ cdc28- clb5 và cdc28- clb6 xuất hiện ở cuối G1, lúc đầu bị ức chế bởi sic1. Sic1 được tạo thành ở đầu G1. Khi sic1 bị phân huỷ, cdc28- clb5 và cdc28- clb6 trở thành hoạt tính và phát động tái bản ADN ở S và tạo thành thoi phân bào ở đầu M. Các cyclin clb1 và clb2 được biểu hiện ở G2 sẽ liên kết với cdc28 tạo thành phức hệ phát động các quá trình ở M. Tất cả các cyclin dạng B bị phân huỷ ở cuối hậu kỳ phân bào bởi phức hệ APC đã được hoạt hoá (Anaphase Promoting Complex). Hoạt tính của cdc28- clb giảm dần tới sự chuẩn bị điều kiện sẽ diễn ra ở G1 cần thiết cho sự tái bản ADN. Sự ức chế tái phát động tái bản ADN diễn ra ở chu kỳ tiếp, trước khi hậu kỳ được hình thành và NST đã phân ly về 2 cực để duy trì sự phân ly chính xác số NST con về 2 tế bào con . 5- Điều chỉnh chu kỳ tế bào ở động vật có vú: 5.1- Đặc tính chu kỳ tế bào ở động vật có vú: Chu kỳ tế bào và cơ chế điều chỉnh các chu kỳ là khác nhau đối với các tế bào biệt hoá khác nhau của cơ thể. Các tế bào phôi sớm sinh sản rất nhanh, chu kỳ tế bào ngắn. Trong khi đó, các tế bào đã biệt hoá rất khác nhau về thời gian kéo dài chu kỳ tế bào, của từng giai đoạn của chu kỳ. Đa số các tế bào của mô thường dừng lại ở giai đoạn G1 để biệt hoá thành các tế bào đặc trưng cho mô như mô gan, mô thận, mô cơ…Người ta gọi chúng ở giai đoạn G0. Trong điều kiện nào đó, các tế bào đã biệt hoá của mô có thể chuyển từ trạng thái G0 về G1, tiếp tục hoàn thành chu kỳ tế bào. Ví dụ: Tế bào gan, tế bào Lympo. Có loại tế bào sau khi được biệt hoá chuyển vào G0 thì chúng ở trạng thái đó suốt đời. Ví dụ: tế bào nơron thần kinh, hồng cầu. Đa số các tế bào chỉ phân bào 1 số lần nhất định (ví dụ tế bào người là khoảng 50 chu kỳ), sau đó ngừng phân bào đi vào thoái hoá và chết. Một số tế bào phân bào vô hạn định, trở thành các tế bào bất tử. Ví dụ: các tế bào đột biến, tế bào Hela. 5.2- Các nhân tố sinh trưởng: Các tế bào sống trong môi trường không có các nhân tố sinh trưởng cần thiết thì chúng sẽ không phân bào mà chuyển sang trạng thái G0. Hiện nay, người ta đã biết được trên 50 chất có tác động như là nhân tố sinh trưởng và chúng được gọi là mitogen, vì chúng kích thích phân bào các tế bào đáp ứng lại với các nhân tố sinh trưởng bằng các thụ quan màng đặc trưng. Ngoài các nhân tố sinh trưởng là protein, một số loại phân tử khác cũng có vai trò như thế: các hoocmon steroid. Các nhân tố sinh trưởng là sản phẩm của tế bào nhưng chúng có tác động điều chỉnh hoạt động của tế bào một cách đa dạng. - Có nhân tố vừa kích thích sự sinh trưởng, vừa kích thích sự sinh sản của tế bào. - Một số nhân tố có tác động kích thích sinh trưởng nhưng không cho phép vượt qua điểm hạn định R của G1. - Một số nhân tố cho phép vượt qua điểm R nhưng không tác động kích thích sinh trưởng. Như vậy, ở các tế bào của động vật có vú không tồn tại mối tương quan chặt chẽ giữa kích cỡ tế bào với sự phân bào như ở nấm men. 5.3- Các điểm chốt của chu kỳ: Đối với chu kỳ tế bào ở động vật có vú, điểm chốt ở G1 (điểm R) là điểm chốt quan trọng mà tế ào phải vượt qua để vào pha S và hoàn thành chu kỳ kéo dài từ 14 đến 16 giờ, S kéo dài từ 6 đến 8 giờ, G2 kéo dài từ 1 đến 2 giờ và M kéo dài khoảng 1 giờ. Các tế bào biệt hoá khác nhau có thời gian chu kỳ khác nhau. Đa số bị dừng lại ở G1 và chuyển sang trạng thái G0 tạm thời. G0 là giai đoạn nghỉ, thực chất là giảm cường độ hoạt động và thực hiện chức năng riêng (chuyên biệt) của mô, cơ quan. Đối với các tế bào đang phân bào, ngoài điểm chốt R còn có các điểm chốt khác: Điểm chốt giữa G2 và M, giữa trung kỳ và hậu kỳ. 5.4- Cơ chế điều chỉnh chu kỳ: 5.4.1- Vai trò của cdk và cyclin: Nhiều loại cdk và cyclin tham gia vào điều chỉnh chu kỳ. Theo nguyên tắc hoạt động có thể phân ra các loại cdk1 đến cdk6. Nhiều loại cyclin tham gia điều chỉnh hoạt tính của cdk, trong đó cyclin A và B tác động ở giai đoạn S, G2 và mitos sớm. Có 3 loại cyclin D (D1, 2, 3) và cyclin E có tác động ở giai đoạn G1. Các loại cyclin liên kết với các cdk tạo thành các phức hệ điều chỉnh chu kỳ tế bào ở các giai đoạn khác nhau. Ví dụ: Phức hệ cdk4- cyclin D, phức hệ cdk6- cyclin D, phức hệ cdk2- cyclin E tác động ở G1. - Cdk2- cyclin A tác động ở S. - Cdk1- cyclin B tác động ở G2 và M. Khi có nhân tố sinh trưởng, các phức hệ cdk- cyclin kích thích tế bào đang ở giai đoạn G0 trở lại G1 để hoàn thành chu kỳ. 5.4.2- Vai trò của các nhân tố sinh trưởng: Tác động của nhân tố sinh trưởng là gây cho tế bào có 2 đáp ứng: Đáp ứng sớm và đáp ứng chậm. - Đáp ứng sớm: Các nhân tố sinh trưởng kích thích các gen mã hoá cho nhân tố phiên mã như C- Fos và C- Jun hoạt động. Như vậy, các nhân tố phiên mã đóng vai trò quan trọng trong việc điều chỉnh chu kỳ tế bào. Các protein được tổng hợp trong giai đoạn đáp ứng sớm hoạt hoá các gen ở giai đoạn đáp ứng chậm như: Các gen mã hoá cho các nhân tố phiên mã E2F; các gen mã hoá cho các loại cyclin A, D, E; các gen mã hoá cho các loại cdk2, cdk4, cdk6. Cho đến khi nồng độ các protein này tích luỹ đủ thì tế bào mới vượt qua điểm R để vào S tái bản ADN. E2F bị ức chế bởi protein Rb, P107 và P130. Protein Rb là sản phẩm của gen ức chế ung thư RB (Tumor Suppressorgene). Sự photphoryl hoá protein Rb làm chúng mất đi vai trò ức chế, do đó dẫn đến sự hoạt hoá các gen cần thiết bởi E2F để đi vào giai đoạn S. Cơ chế như sau: Các phức hệ cdk4- cyclin D và cdk6- cyclin D photphoryl hoá protein ở giữa G1. Cyclin E và cdk2 được sản xuất thì phức hệ cdk2- cyclin E lại photphoryl hoá Rb ở cuối G2. Đến lượt mình, khi E2F có hoạt tính sẽ kích thích sự phiên mã gen của mình (theo mối liên hệ ngược dương) và đồng thời dẫn đến sản sinh cdk2- cyclin E. Sau đó cdk2- cyclin E sẽ tăng cường photphoryl hoá Rb (hình 6.7). Đến thời điểm này, chu kỳ diễn ra không còn phụ thuộc vào hoạt tính của cdk416- cyclin D bởi vì cùng với tiến trình, khi các nhân tố sinh trưởng không được tăng thêm thì mức cyclin D cũng giảm đi và khi đó, tế bào vượt qua điểm R của G1 để vào S. Như vậy, sự photphoryl hoá của Rb có tác động điều chỉnh để tế bào vượt qua điểm R để vào S là rõ ràng. Còn các tế bào mang gen Rb sẽ bị giữ lại ở G1 không phụ thuộc vào nhân tố sinh trưởng. Protein Rb được duy trì ở trạng thái photphoryl hoá suốt giai đoạn S, G2 và M, bởi phức hệ cdkCdK4/2- cyclin. Sau khi tế bào hoàn tất phân bào và đi vào G1 sớm hoặc G0 thì mức cdk- cyclin giảm sẽ dẫn tới làm giảm protein Rb, bởi các protein photphokenaza. Protein Rb lại tác động ức chế hoạt tính của E2F ở giai đoạn sớm của G1 của chu kỳ tiếp theo. Cyclin A được tổng hợp ở cuối pha G1. Thiếu cyclin A thì tổng hợp ADN bị ức chế. Phức hệ cdk2- cyclin A có vai trò phát động tái bản ADN. Hoạt tính của cdk- cyclin A bị ức chế bởi loại protein tương tự như protein Sic1 ở S.Cerevisiae. Ở động vật có vú, cdk1 tác động trong G2 tương tự cdc2 của S.Pomble và kích thích sự chín của noãn bào. Hoạt tính MPF của phức hệ cdk1- cyclin B có vai trò chuyển chu kỳ từ G2 vào M được điều chỉnh bởi các protein tương tự như Wee1, CAK, Cdc25 ở S.Pomble và theo cùng một cơ chế tương tự. Nghĩa là các CAK có tác động ức chế hoạt tính của cdk bằng cách photphoryl hoá và chúng được hoạt hoá bởi các photphataza (tương tự cdc25) bằng cách giải phóng nhóm photphat ức chế. Đối với các tế bào có chu kỳ đổi mới thường xuyên như tế bào phôi sớm thì cyclin B bắt đầu được tổng hợp ở S và tăng cao hàm lượng qua G2, đạt đỉnh cao ở M sớm và giảm mạnh sau hậu kỳ phân bào (hình). Cyclin B đầu tiên được tích luỹ trong tế bào chất và sau đó được chuyển vào nhân ở tiền kỳ sớm, ngay khi màng nhân bắt đầu phân rã. Như vậy, hoạt tính của MPF không chỉ được điều chỉnh bởi sự photphoryl hoá và photphat mà còn do sự vận chuyển cyclin B vào nhân. Cyclin A và B sẽ được phân huỷ trong protrasome bằng con đường ubiquetion hoá nhờ phức hệ APC (Anaphase Promoting Complex) dẫn tới sự giảm hoạt tính MPF, cho phép tế bào hoàn thành mitos để đi vào chu kỳ mới. 5.4.4- Vai trò của các nhân tố ức chế: Các nhân tố ức chế hoạt tính phức hệ cyclin- kinaza được gọi là CKI (Cyclin- Kinaza Inhibitor) và chúng cũng tham gia vào điều chỉnh chu kỳ tế bào sống. CKI có 2 lớp: - CIP (Cdk inhibitor protein): liên kết và ức chế tất cả các phức hệ Cdk1/2/4/6- cyclin. CIP có p21, p27 và p57. - INK4 (Kenase 4 inhibitor): liên kết và ức chế phức hệ Cdk4- cyclin D và cdk6- cyclin D. INK4 có protein p16 có tác động như một chất ức chế ung thư. Các protein ức chế như INK4 và các CIP như p21, p27, p57 đóng vai trò ức chế hệ MPF, từ đó ức chế chu kỳ tế bào. Vai trò của CIP p21 là đáp ứng lại sự hư hỏng của ADN và ức chế sự tăng sinh tế bào trong phát triển phôi sinh. P21 ức chế Cdk2- cyclin E làm tế bào phôi bị ách lại ở G1 của chu kỳ tiếp theo. CIP p27 ức chế chu kỳ tế bào và điều chỉnh sự tăng sinh tế bào trong cơ thể ở giai đoạn phôi và thai. Protein CIP p57 điều chỉnh sự tăng sinh tế bào biệt hoá của cơ thể trưởng thành. 5.5- Các điểm chốt của chu kỳ và cơ chế tác động của MPF: Sự điều chỉnh chu kỳ tế bào theo thời gian xảy ra ở các điểm chốt (check point) theo cơ chế kiểm tra theo mối liên hệ ngược (hình 6.8). Tác động lên điểm chốt có các tín hiệu nô bào và tín hiệu đến từ các tế bào và mô khác trong cơ thể, cũng như tín hiệu đến từ môi trường. Ba điểm chốt quan trọng: - Điểm chốt từ G1 đến S. - Điểm chốt G2 để kiểm tra cửa vào M. - Điểm chốt M. 5.5.1- Điểm chốt G1: Điểm chốt ở G1 rất quan trọng. Đối với các tế bào có chu kỳ chuẩn và liên tục thì điểm chốt G1 là điểm kiểm tra các quá trình diễn ra ở G1, mà khi hoàn tất sẽ phát động sự tái bản ADN và tiếp tục chu kỳ. Đối với các tế bào biệt hoá là do các tế bào bị ách lại ở G1. Các nhân tố sinh trưởng GF (Growth Factor) cũng như các chất kích thích phân bào (mitogen) thường tác động lên điểm chốt G1. Chúng kích thích sự biểu hiện của các gen mã hoá protein, nhiều enzim đáp ứng sớm của tế bào, trong đó có các gen mã hoá, các nhân tố phiên mã như c- Fos, c- Jun. Các protein và enzim của đáp ứng sớm sẽ kích thích hoạt hoá các gen của giai đoạn đáp ứng chậm, trong đó quan trọng nhất là các gen mã hoá cho các nhân tố phiên mã E2F. Một số gen khác trong đáp ứng là các gen mã hoá cho các dạng cyclin của G1 và một phần của S- cyclin D, E và A; các gen mã hoá cho các dạng cdk tác động trong G1 và S như cdk2, 4, 6. Nhân tố phiên mã E2F có tác động kích thích sự phiên mã của các gen mã hoá cho các protein và enzim cần thiết cho sự tái bản ADN. Khi tế bào chưa vượt qua điểm chốt G1 thì E2F bị ức chế do liên kết với protein ức chế Rb. Khi Rb bị photphoryl hoá nhờ phức hệ kinaza (tức MPF) thì E2F được giải phóng. Chúng sẽ tác động cùng với cdk2- cyclin A lên hệ tái bản ADN và như vậy, G1 được chuyển vào trong S. Nhiều nguyên nhân gây tác động làm tế bào bị ách lại ở G1 (ví dụ khi phân tử ADN bị hư hỏng). Sự ách lại ở G1 là để phòng ngừa sự tái bản của các bản ADN bị đột biến. protein p53 ức chế cho tế bào người dừng lại ở G1 khi có sự hư hỏng ADN. Khi protein p53 không hoạt động, các tế bào với hư hỏng ADN sẽ tái bản ADN, hoàn thành chu kỳ, sẽ cho ra các tế bào con có thể chuyển thành tế bào dạng ung thư. Vì vậy, người ta gọi gen mã hoá cho protein p53 là gen ức chế ung thư. ADN bị hư hỏng kích thích sự phiên mã p53 làm cho nồng độ p53 tăng, sẽ kích thích tổng hợp protein ức chế CIP p21. CIP p21 liên kết và ức chế tất cả các cdk- cyclin và kết quả là tế bào bị ách lại ở G1 (hoặc G0) cho tới khi ADN bị hư hỏng đã được sửa chữa, và nồng độ p53, CIP p21 giảm xuống. Nếu ADN bị hư hại quá nặng thì protein p53 sẽ hoạt hoá các gen dẫn đến quá trình “tự chết của tế bào” (apoptosic). 5.5.2- Điểm chốt G2: Điểm chốt G2 báo hiệu các quá trình cần thiết cho sự phân bào phải được hoàn tất như sự tái bản ADN, sự đông đặc và tăng xoắn của NST, sự tạo thành các vi ống chuẩn bị cho sự tạo thành các thoi phân bào, thì tế bào mới vượt qua chốt để đi vào tiền kỳ của phân bào. Nếu các quá trình đó chưa được hoàn tất hoặc có xảy ra hư hỏng ADN thì tế bào cũng bị ách lại ở G2 và không vào được M. Phức hệ cdk1- cyclin G2 (A và chủ yếu là B) khi được hoạt hoá sẽ photphoryl hoá các protein đóng vai trò chủ yếu trong sự cô đặc và tăng xoắn NST (như conhensin); các protein có vai trò tạo nên các vi ống của thoi phân bào (như các tubulin); các protein có vai trò trong sự phân giải và tái tạo màng nhân. 5.5.3- Điểm chốt M: Điểm chốt của giai đoạn M ở vào trung kỳ chuyển sang hậu kỳ. Nếu các quá trình như tan rã màng nhân, tạo thoi phân bào và các trung tiết bám gắn NST vào sợi của thoi…chưa hoàn tất thì tế bào bị ách lại ở trung kỳ. Phức hệ Cdk- cyclin có tác động hoạt hoá phức hệ APC bằng con đường photphoryl hoá. Khi APC có hoạt tính sẽ tác động theo con đường ubiquitin hoá để các protein ức chế hậu kỳ ( ví dụ protein cohesin có vai trò gắn 2 nhiễm sắc tử với nhau ở tâm động) bị phân giải bởi proteasome, do đó, NST tách khỏi nhau và vận động về cực nhờ sự trùng hợp các vi ống của sợi thoi. Khi các cyclin chưa bị phân huỷ thì phức hệ cdk- cyclin sẽ tác động để tái tạo màng nhân và gây co thắt eo bào (do tác động photphoryl hoá protein miozin- actin) làm cho tế bào bị phân thành hai. Vào hậu kỳ, APC bằng con đường ubiquitin hoá sẽ tác động lên cyclin nhờ proteasome. Nồng độ cyclin giảm, cdk mất hoạt tính và tế bào ra khỏi mitos. Như vậy, chúng ta sẽ có bảng tóm tắt các protein chính điều chỉnh chu kỳ tế bào: Tên protein Chức năng - CAK - Cdc2 - Cdc25 - Wee1 kinase - Sic1 (nấm men) - Photphoryl hoá 1 yếu tố hoạt động trong cdk; photphoryl hoá Cdc2, tiến tới ức chế hoạt tính của MPF. - Cdc2 là protein kinaza, điều chỉnh chủ chốt trong chu kỳ tế bào từ G2 sang M. - Cdc25 là protein photphotaza có tác động giải phóng photpho cho hợp phần cdc2, do đó kích hoạt MPF. - Wee1 kinase có tác động photphoryl hoá CAK để ức chế hoạt tính của MPF. - Sic1 ức chế giai đoạn S, đặc biệt là phức hệ Cdc28- cyclin B. Sic1 bị phân giải bởi proteasome bằng con đường ubiquitin hoá bởi các enzim cdc34 và SCF. - CIP - P21 - P27 - P53 - P57 - INK4 - E2F - CIP ức chế tất cả các phức hệ MPF (Cdk- cyclin). - P21 đáp ứng lại sự hư hỏng của ADN ở động vật có vú; ức chế cdc2- cyclin E làm tế bào dừng lại ở G1. - P27 ức chế chu kỳ tế bào, điều chỉnh sự tăng sinh tế bào trong cơ thể ở giai đoạn phôi và thai. - P53 ức chế tế bào dừng lại ở G1 khi có sự hư hỏng ADN, các yếu tố stress, thúc đẩy mã hoá các gen nghỉ. P53 bị phân huỷ bởi Mdm2. - P57 ức chế sự tăng sinh tế bào trong quá trình biệt hoá. - INK4: p16 ức chế phức hệ Cdk4- cyclin D và Cdk6- cyclin D. - E2F là nhân tố phiên mã các gen mã hoá cho quá trình G1/S bao gồm các protein tham gia tổng hợp ADN, các S- cyclin, G1- cyclin. E2F bị ức chế bởi Rb và p107, p130. - Rb - APC - Rb ức chế E2F, tế bào bị giữ lại ở G1. Rb bị ức chế bởi Cdk4- cyclin D và Cdk6- cyclin D ở giữa G1 và Cdc2- cyclin E ở G2, S và M. - APC xúc tiến quá trình ubiquitin hoá các protein. Protein ức chế kỳ sau bị phân giải bởi proteasome bao gồm: Securin và M- cyclin III- ỨNG DỤNG: - Nghiên cứu cơ chế phân bào và các nhân tố điều chỉnh phân bào có vai trò quan trọng đặc biệt trong công nghệ sinh học tế bào: tạo giống mới, lai soma vi nhân giống, công nghệ tế bào gốc. - Nắm vững cơ chế điều chỉnh tế bào giúp chúng ta có biện pháp và tìm ra cách phòng chống cũng như chữa các bệnh có liên quan đến chu kỳ tế bào như: đột biến, bệnh ung thư… KẾT LUẬN Sự hoạt động của cyclin- cdk có vai trò điều chỉnh hầu hết các yếu tố cần thiết của chu kỳ tế bào. Trong suốt pha G1, hoạt tính của cyclin- cdk bị giảm ở mức tối thiểu bởi các tác nhân ức chế (CKIs); sự phân huỷ cyclin và sự ức chế các gen mã hoá cho cyclin. Khi điều kiện môi trường nội bào thuận lợi, hàm lượng các protein G1- và G1/S- cdk tăng nhanh, vượt qua rào chắn ức chế ở cuối pha G1 và thúc đẩy sự hoạt hoá của S- cdk. S- cdk kích hoạt các protein cần thiết cho sự tổng hợp ADN, và khởi đầu cho sự tái bản ADN trong tế bào. Khi các yếu tố của pha S được hoàn tất. Sự hoạt động của M- cdk sẽ điều chỉnh tổng hợp các yếu tố cần thiết chuẩn bị cho các nhiễm sắc tử chị em cùng tách khỏi nhau ở tâm động, trở thành NST con và phân ly về các cực tế bào ở cuối kỳ sau. M- cdk bị phân huỷ dẫn tới sự phân chia tế bào chất và kết thúc pha M. Chu kỳ tế bào được điều chỉnh một cách chính xác bởi các cơ chế ức chế hoá học khác nhau. Các cơ chế đó sẽ giúp tế bào dừng lại ở các điểm kiểm soát đặc biệt (check point), khi các điều kiện cần thiết cho quá trình tiếp theo chưa được hoàn tất, hoặc khi ADN bị hư hại, hay điều kiện nội bào không thích hợp. Nghiên cứu cơ chế điều chỉnh chu kỳ tế bào không chỉ có tầm quan trọng trong nghiên cứu sinh học sinh sản mà còn có vị trí quan trọng trong nghiên cứu bệnh học, đặc biệt là bệnh ung thư.