Định týp (genotyping) virus viêm gan vịt type 3 phân lập tại Việt Nam từ 2009-2013 - Đỗ Thị Roan

TAP CHI SINH HOC 2015, 37(1se): 274-278 DOI: 10.15625/0866-7160/v37n1se. ĐỊNH TÝP (GENOTYPING) VIRUS VIÊM GAN VỊT TYPE 3 PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM TỪ 2009-2013 Đỗ Thị Roan, Đoàn Thị Thanh Hương*, Lê Thị Kim Xuyến, Nguyễn Thị Khuê, Vũ Thị Tiến, Lê Thanh Hòa Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm KH & CN Việt Nam, *doantthuong74@gmail.com TÓM TẮT: Gen VP1 của 10 mẫu bệnh phẩm virus viêm gan vịt phân lập từ 6 tỉnh của Việt Nam trong thời gian 2009-2013 đã được thu nhận và giải mã. Phân tích tỷ lệ đồng nhất (91-100%) về nucleotide và amino acid cho thấy tất cả các chủng phân lập đều thuộc genotype 3 (DHAV-3). virus DHAV-3 của Việt Nam có một vùng “siêu biến đổi” ở đầu tận cùng C của gen VP1, trong đó 6/10 số chủng có 4 vị trí sai khác đồng nhất và hoàn toàn khác biệt với tất cả các chủng DHAV-3 của thế giới (bao gồm các vị trí T184M, Q200H, K207N, K214R). Phân tích phả hệ cho thấy các chủng DHAV-3 trên thế giới gồm 3 clade chính, trong đó 4/10 chủng DHAV-3 của Việt Nam thuộc về một clade cùng với các chủng của Trung Quốc, 6 chủng còn lại thuộc về một clade riêng biệt và có mối quan hệ gần gũi nhất với chủng B63 của Trung Quốc. Bốn chủng của Hàn Quốc thuộc về một clade riêng. Từ khóa: DHAV-3, genotyping, viêm gan vịt, vùng siêu biến đổi, VP1, Việt Nam. MỞ ĐẦU Viêm gan vịt (DHAV) là một bệnh truyền nhiễm cấp tính xảy ra ở vịt con 1-6 tuần tuổi, và đặc biệt mẫn cảm với vịt con dưới 1 tuần tuổi. Bệnh lây lan nhanh với tỷ lệ chết rất cao, có khi lên đến 95-100% toàn đàn [7]. Cho đến nay, bệnh vẫn tồn tại và gây thiệt hại nặng nề về kinh tế cho nhiều nước trên thế giới, trong đó có Việt Nam [1, 4]. Virus viêm gan vịt (DHAV) gồm 3 genotype là DHAV-1, DHAV-2 và DHAV-3 [6, 3, 1, 4], trong đó, DHAV-1 là phổ biến nhất. DHAV-2 chỉ mới phát hiện được hai chủng phân lập tại Đài Loan [5]. DHAV-3 gồm khoảng 20 chủng mới được phân lập ở Hàn Quốc, Trung Quốc và một số chủng vừa được chúng tôi phân lập tại Việt Nam [3, 6, 2]. Từ trước tới nay, virus viêm gan vịt thuộc genotype 1 (DHAV-1) được ghi nhận là phổ biến tại Việt Nam, gồm cả các chủng cường độc và một số chủng virus vaccine hiện đang sử dụng [4]). Trong bài báo này, chúng tôi công bố định týp genotype 3 (DHAV-3) tại Việt Nam và phân tích một số đặc tính phân tử của chúng qua so sánh với các chủng của thế giới. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Mẫu bệnh phẩm và tách chiết RNA tổng số Bệnh phẩm viêm gan vịt được thu nhận tại 6 tỉnh thành: Thành phố Hồ Chí Minh, Hưng Yên, Đồng Nai, Ninh Thuận, Long An và Khánh Hòa. Các mẫu bệnh phẩm được tiếp truyền qua phôi trứng vịt 11 ngày tuổi, thu nước trứng hoặc phôi chết sau 48 giờ, 72 giờ. RNA tổng số được tách chiết bằng bộ sinh phẩm RNeasy Mini Kit (Qiagen) theo hướng dẫn của nhà sản xuất và bảo quản ở -20oC cho đến khi sử dụng. DNA bổ sung (cDNA) được tổng hợp theo phương pháp chuyển đổi từ RNA hệ gen của virus bằng mồi xác suất (hexamer primers), sử dụng bộ kit của hãng Fermentas. Thu nhận gen VP1 và phân tích xử lý số liệu Cặp mồi gen VP1 của DHAV-3 [2] được sử dụng cho phản ứng PCR, thực hiện với chu trình nhiệt: 94oC/5 phút, 35 chu kỳ [94oC/60 giây, 50oC/60 giây, 72oC/90 giây] và chu kỳ cuối cùng ở 72oC/10 phút. Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng bộ kit Accuprep Gel Purification Kit (Bioneer, Hàn Quốc) và giải trình tự trực tiếp. Các chuỗi gen VP1 được thu nhận, so sánh trình tự nucleotide và amino acid với các chủng của thế giới, sử dụng chương trình GENEDOC2.7; phân tích phả hệ bằng chương trình MEGA6.06 với hệ số tin cậy 1000 bootstrap. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Kết quả thu nhận gen VP1 của các chủng DHAV-3 Việt Nam Bằng cặp mồi đặc hiệu đã trình bày ở trên, chúng tôi đã thu nhận được 10 phản ứng PCR dương tính (bao gồm các mẫu BM, HY, DN1, DN2, NC, LA1, KHO1, KHO2, NT, NT2). Các sản phẩm PCR dương tính trên được tinh sạch và giải trình trình tự trực tiếp. Kết quả giải trình tự và xử lý chuỗi gen, chúng tôi đã thu được toàn bộ gen VP1 có độ dài 720 nucleotide, mã hóa cho 240 amino acid. Các trình tự gen VP1 được đăng ký trên Ngân hàng gen với mã số JF925119-JF925121, KM361877-KM361883 (bảng 1). Bảng 1. Danh sách gen VP1 của virus viêm gan vịt DHAV-3 phân lập tại Việt Nam sử dụng trong nghiên cứu STT Chủng virus Nơi phân lập Năm phân lập Vật chủ/ bệnh phẩm Độ dài (bp) Số đăng ký NHG 1 DN1 Đồng Nai 2009 Vịt/ Gan 720 JF925120 2 DN2 Đồng Nai 2009 Vịt/ Gan 720 KM361877 3 LA1 Long An 2011 Vịt/ Gan 720 KM361881 4 NC TP. Hồ Chí Minh 2009 Vịt/ Gan 720 JF925121 5 BM Hưng Yên 2009 Vịt/ Gan 720 JF925119 6 KHO1 Khánh Hòa 2012 Vịt/ Gan 720 KM361879 7 KHO2 Khánh Hòa 2012 Vịt/ Gan 720 KM361880 8 HY Hưng Yên 2010 Vịt/ Gan 720 KM361878 9 NT2 Ninh Thuận 2013 Vịt/ Gan 720 KM361882 10 NT Ninh Thuận 2013 Vịt/ Gan 720 KM361883 Hình 1. Kết quả so sánh tương đồng về amino acid ở đầu tận cùng C của protein VP1 giữa các chủng thuộc DHAV-3. Mười chủng của Việt Nam được xếp ở hàng cuối cùng và bôi đậm. Các vị trí sai khác đặc biệt được đánh dấu trong khung. Phân tích mức độ tương đồng về amino acid giữa các chủng thuộc DHAV-3 Các chủng virus viêm gan vịt của Việt Nam có mức độ tương đồng 91-100% về amino acid với 26 chủng DHAV-3 đã công bố trên Ngân hàng gen quốc tế, trong đó, 4 chủng BM, HY, NT và NT2 có mức độ tương đồng cao với các chủng của Trung Quốc; 6 chủng còn lại (DN1, DN2, NC, LA1, KHO1, KHO2) có tỷ tương đồng rất cao (98-100%) và gần gũi nhất vớichủng B63 của Trung Quốc (95-96%). Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy, có một vùng siêu biến đổi ở đầu tận cùng C giữa các chủng DHAV-3, trong số đó, 6 chủng DHAV-3 của Việt Nam DN1, DN2, NC, LA1, KHO1, KHO2 có 4 vị trí sai khác so với tất cả các chủng DHAV-3 đã công bố trên thế giới (bao gồm các vị trí: T184M, Q200H, K207N, K214R) (hình 1). Đồng thời, 4 chủng của Hàn Quốc cũng sở hữu 4 trình tự hoàn toàn khác biệt với các chủng còn lại của Việt Nam và Trung Quốc (hình 1). Điều này cho thấy, đặc điểm di truyền gen VP1 của quần thể virus viêm gan vịt genotype 3 có khác nhau theo phân bố vị trí địa lý. Clade 1 Clade 2 Clade 3 DHAV-3 DHAV-2 DHAV-1 Hình 2. Mối quan hệ phả hệ của các chủng cường độc DHAV-3 của Việt Nam và thế giới trên cơ sở phân tích toàn bộ gen VP1. Biểu tượng (▲) để chỉ các chủng của Việt Nam sử dụng trong nghiên cứu Phân tích mối quan hệ nguồn gốc phả hệ Chuỗi gen VP1 của 10 chủng nghiên cứu được so sánh với 25 chủng của thế giới, bao gồm 15 chủng DHAV-3 của Hàn Quốc và Trung Quốc; 2 chủng DHAV-2 của Đài Loan và 8 chủng DHAV-1 của Trung Quốc (hình 2). Trong số các chủng trên, DHAV-3 được lựa chọn là đại diện cho các chủng virus viêm gan vịt thuộc genotype 3 đã được công bố cho đến nay (theo phân bố vị trí địa lý và thời gian phân lập). Các chủng DHAV-2 chỉ gồm 2 chủng duy nhất được sử dụng trong nghiên cứu. Kết quả phân tích cho thấy, 3 genotype 1, 2, 3 tập hợp riêng biệt thành 3 nhóm chính. Trong đó, nhóm DHAV-3 bao gồm 3 clade: 4 chủng DHAV-3 của Việt Nam (NT, NT2, BM và HY) thuộc về một clade cùng với các chủng của Trung Quốc (Clade 1); 6 chủng DHAV-3 Việt Nam còn lại (DN1, DN2, KHO1, KHO2, LA1 và NC) thuộc về một clade riêng biệt và có mối quan hệ gần gũi nhất với chủng B63 của Trung Quốc (Clade 3). Bốn chủng của Hàn Quốc thuộc về một clade riêng (Clade 2). KẾT LUẬN Bằng phương pháp sinh học phân tử, chúng tôi đã phát hiện và xác nhận sự có mặt của virus viêm gan vịt genotype 3 tại 6 tỉnh thành của Việt Nam, bao gồm thành phố Hồ Chí Minh, Hưng Yên, Đồng Nai, Ninh Thuận, Long An và Khánh Hòa. Các chủng virus DHAV-3 gây bệnh tại Việt Nam đã có những biến đổi đặc trưng riêng trong hệ gen, khác với các chủng của thế giới đã công bố. Kết quả nghiên cứu cho thấy việc sản xuất và sử dụng vaccine viêm gan vịt DHAV-3 tại Việt Nam, bên cạnh loại vaccine DHAV-1 truyền thống là điều cần thiết hiện nay. Lời cảm ơn: Nghiên cứu này được tài trợ bởi Quỹ phát triển khoa học và công nghệ quốc gia (NAFOSTED), mã số 106.04-2012.60. TÀI LIỆU THAM KHẢO Chen L. L., Xu Q., Zhang R. H., Yang L., Li J. X., Xie Z. J, Zhu Y. L., Jiang S. J., Si X. K., 2013. Improved duplex RT-PCR assay for differential diagnosis of mixed infection of duck hepatitis A virus type 1 and type 3 in ducklings. J. Virol. Methods, 192(1-2): 12-17. Đoàn Thị Thanh Hương, Nguyễn Bá Hiên, Trần Xuân Hạnh, Lê Thanh Hòa, 2010. Phát hiện lần đầu tiên genotype III (DHAV-3) virus gây bệnh viêm gan vịt tại Việt Nam bằng phương pháp giám định phân tử. Tạp chí Công nghệ sinh học, T.8(2): 145-152. (Vietmamese, summary in English). Kim M. C., Kim M. J., Kwon Y. K., Lindberg A. M., Joh S. J., Kwon H. M., Lee Y. J., Kwon J. H., 2009. Development of duck hepatitis A virus type 3 vaccine and its use to protect ducklings against infections. Vaccine, 27(48): 6688-6694. Phạm Hùng, Đỗ Văn Khiên, Đặng Thanh Hiền, Phạm Thị Bích Liên, Đỗ Văn Tấn, 2014. Xác định tỷ lệ lưu hành của virus viêm gan vịt trên đàn vịt nuôi ở Nam Trung Bộ. Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú Y, T.31(3): 5-10. (Vietmamese, summary in English). Tseng C. H., Tsai H. J., 2007. Molecular characterization of a new serotype of duck hepatitis virus. Virus Res., 126(1-2): 19-31. Wang L., Pan M., Fu Y., Zhang D., 2008. Classification of duck hepatitis virus into three genotypes based on molecular evolutionary analysis. Virus Genes, 37(1): 52-59. Woolcock P. R., 2003. Duck hepatitis. In: Saif Y. M., Barnes H. J., Glisson J. R., Fadly A. M., McDougald L. R., Swayne D. E. (Eds.). Diseases of Poultry, eleventh ed. Iowa State Press, Ames, IA, 343-354. GENOTYPING OF DUCK HEPATITIS VIRUS TYPE 3 ISOLATED IN VIETNAM DURING 2009-2013 Do Thi Roan, Doan Thi Thanh Huong, Le Thi Kim Xuyen, Nguyen Thi Khue, Vu Thi Tien, Le Thanh Hoa Institute of Biotechnology, VAST SUMMARY The entire sequences for VP1 gene of ten DHAV samples isolated during 2009-2013 from six provinces in Vietnam were obtained. Based on high identity (91-100%) for nulcleotide and amino acid, DHAV strains of Vietnam belonged to genotype 3 (DHAV-3) and have a “hyper variable region” at C-terminal of VP1. Notably, 6/10 strains of Vietnam showed four consistent differences within this group but distinct from all other DHAV-3 global strains (The positions are T184M, Q200H, K207N, K214R). Phylogenetic analysis indicated that DHAV-3 strains divided into three main clades, of which four of ten Vietnamese isolates were clustered in the same clade with the Chinese strains (Clade 1). Six of others belonged to clade 3 close to the Chinese B63 strain. Four Korean strains formed a separate clade (Clade 2). Keywords: DHAV-3, duck hepatitis, genotyping, inter/intragenotypic variation, VP1, Vietnam. Ngày nhận bài: 22-10-2014