Dinh dưỡng – tăng trưởng vi khuẩn

DINH DƯỠNG – TĂNG TRƯỞNG VI KHUẨN Ths. Nguyễn Thanh Tố Nhi DINH DƯỠNG – TĂNG TRƯỞNG VI KHUẨN
DINH DƯỠNG VI KHUẨN
SỰ TĂNG TRƯỞNG CỦA VI KHUẨN
KIỂM SOÁT VSV Môi trường nhân Chất dinh dưỡng Môi trường thông khí, CO , O pH, độ ẩm tạo 2 2 (yếm khí) Điều kiện # Tạo cấu trúc TB, năng lượng cho hoạt động sống DINH DƯỠNG VI KHUẨN Nhu cầu dinh dưỡng Chất dinh dưỡng oĐa lượng oVi lượng oYếu tố tăng trưởng Môi trường nuôi cấy vi khuẩn Phân loại theo thành phần oTổng hợp oTự nhiên Phân loại theo mục đích sử dụng oCơ bản (dinh dưỡng) oChuyên chở oPhong phú (tăng sinh) oChọn lọc oPhân biệt oSinh hóa CHẤT DINH DƯỠNG Thiết yếu: TB không tăng trưởng được nếu không có Có ích: Nếu có, VK sử dụng, không bắt buộc Đa lượng: C, N, P, S, K, Mg, Na, Ca, Fe Vi lượng (Nguyên tố vết - cần với lượng nhỏ, không thể thiếu đ/v VSV): Co (tạo vit B12), Zn, Mo, Cu, Mn, Ni, W, Se Yếu tố tăng trưởng: Vitamin, aa, purin & pyrimidin 1. Carbon • ½ chất khô tb  Ý nghĩa hàng đầu trong sự sống VSV • Giá trị dd và khả năng hấp thụ nguồn C tuỳ thuộc: • TP & cấu tạo hóa học nguồn C: mức độ oxy hóa của nguyên tử C - C vô cơ thuần: VSV không sử dụng CHẤT DINH DƯỠNG ĐA LƯỢNG - C hữu cơ: sử dụng được - CO2: nguồn C duy nhất của VSV quang tổng hợp • Đặc điểm sinh lý VSV: VSV đồng hóa trực tiếp chất phân tử thấp (các loại đường), thủy phân chất cao phân tử (tinh bột, protein) Phân loại VSV theo nguồn năng lượng và carbon: Vi sinh vật Nguồn NL Nguồn C Quang (Ánh sáng) Hóa (Chất VC/HC) Tự dưỡng (CO2) Dị dưỡng (Chất hữu cơ) Phân loại VSV theo nguồn năng lượng và carbon: Quang tự dưỡng? Hóa tự dưỡng? Quang dị dưỡng? Hóa dị dưỡng? Nguồn C từ CO2, nguồn NL từ chất vô cơ? Nguồn NL từ ánh sáng, nguồn C từ CO2? Nguồn C từ chất hữu cơ, nguồn NL từ ánh sáng? Nguồn NL từ chất vô cơ, nguồn C từ chất hữu cơ? Nguồn C từ CO2, nguồn NL từ ánh sáng? Nguồn C từ CO2, nguồn NL từ chất chất hữu cơ? 2. Nitơ • Thành phần chiếm tỷ lệ lớn thứ 2 trong TB • Cấu tạo protein, acid nucleic, peptidoglycan • VSV sử dụng N ko chỉ phụ thuộc nguồn N, tùy tỉ lệ C:N / mtr • Nguồn N ở 2 dạng: vô cơ (muối nitrat, nitrit), hữu cơ (pepton, CHẤT DINH DƯỠNG ĐA LƯỢNG nước thịt,); N không khí: VSV cố định đạm 3. Phospho • Tổng hợp ADN, ARN, ATP, phospholipid • Nguồn P vô cơ dễ sử dụng (KH2PO4). Hữu cơ: phức tạp, cần enzym thủy phân thành P tự do; đắt tiền 4. Lưu huỳnh Cấu tạo aa và vitamin. Thường dùng MgSO4.7H2O 5. Kali Hoạt hoá enzym tổng hợp protein, thường dùng KH2PO4 6. Magie Ổn định ribosom, cần cho hoạt động các enzym, thường dùng CHẤT DINH DƯỠNG ĐA LƯỢNG MgSO4.7H2O 7. Canxi Không thiết yếu, ổn định nhiệt nội bào tử, dùng CaCl2 8. Natri: dùng NaCl 9. Sắt: cần cho enzym hô hấp, dùng FeCl3, FeSO4 • Là chất cần với lượng rất nhỏ, thiết yếu cho sự tăng trưởng của VK nhưng tb không tự tổng hợp được • Thường cung cấp dưới dạng • Vitamin: chức năng coenzym YẾU TỐ TĂNG TRƯỞNG • Acid amin: cấu tạo protein • Purin và pyrimidin: tổng hợp acid nucleic  Nếu dùng nguyên liệu hữu cơ (pepton, cao men) thì đa số YTTT đã có sẵn, không cần bổ sung thêm DINH DƯỠNG VI KHUẨN Nhu cầu dinh dưỡng Nguồn năng lượng Chất dinh dưỡng oĐa lượng Môi trường nuôi cấy vi khuẩn Phân loại theo thành phần Phân loại theo trạng thái / thể chất môi trường oVi lượng oYếu tố tăng trưởng Phân loại theo mục đích sử dụng Phân loại theo thành phần • MT tổng hợp: TPHH xác định, khó làm, đắt tiền • MT tự nhiên: TPHH không xác định (protein đậu nành, cao thịt, mô sống) MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY Phân loại theo trạng thái / thể chất môi trường • Lỏng (canh thang) • Rắn (thạch): 1 – 2 % agar • Bán rắn: MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY Phân loại theo mục đích sử dụng • MT cơ bản (dinh dưỡng) • MT chuyên chở • MT phong phú (tăng sinh • MT phân biệt MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY • MT chọn lọc • MT xác định tính chất sinh hóa • MT cơ bản (dd): đầy đủ cdd cho đa số VK tăng trưởng MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY • MT chuyên chở: rất ít cdd  VK sống mà ko phát triển  giữ mẫu bệnh phẩm MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY • MT phong phú (tăng sinh): MT cơ bản bổ sung thêm máu, dịch nấm men, để VK “kén ăn” phát triển MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY • MT phân biệt: giúp khuẩn lạc VK cần khảo sát có hình thức riêng biệt, dễ quan sát MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY • MT chọn lọc: ngăn chặn hầu hết VK trừ VK khảo sát MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY • MT xác định tính chất sinh hóa: phát hiện hoạt tính enzym của VK thuần chủng MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY KHÁI NIỆM ĐƯỜNG CONG TĂNG TRƯỞNG ĐO SỰ TĂNG TRƯỞNG YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG TĂNG TRƯỞNG SỰ TĂNG TRƯỞNG CỦA VK  KHÁI NIỆM Sinh sản phân đôi Một số định nghĩa • Sự tăng trưởng tb: gia tăng số lượng tb/ sinh khối tb • Tốc độ tăng trưởng: sự thay đổi số tb/ sinh khối tb trong 1 đơn vị thời gian KHÁI NIỆM • Thời gian thế hệ: thời gian để số tế bào nhân đôi • Tăng trưởng lũy thừa: sự tăng trưởng có số tế bào tăng gấp đôi ở mỗi giai đoạn  đường biểu diễn logarit 10 là đường thẳng KHÁI NIỆM Tính thời gian thế hệ trong tăng trưởng lũy thừa N = No.2n logN = logNo + nlog2 n = logN - logNo log2 -N: Số tb cuối cùng -No: Số tb ban đầu -t: Thgian tăng trưởng lũy KHÁI NIỆM n = logN - logNo 0.301 n = 3,3.logN/No G = t/n = t 3,3.logN/No thừa -n: Số thế hệ trong gđ lũy thừa -G: Thời gian thế hệ VD: Tính thời gian thế hệ của 1 loài VK? Biết từ 103 tế bào khi nuôi cấy trong 2 giờ thu được 107 tế bào? A. 9 phút B. 12 phút KHÁI NIỆM C. 18 phút D. 27 phút Một loài VK cứ sau 20 phút nhân đôi 1 lần. Sau 3 giờ nuôi cấy thu được 105 VK. Hỏi số lượng tế bào ban đầu cho vào bình nuôi cấy là bao nhiêu? A. 300 KHÁI NIỆM B. 10 C. 100 D. 200 Từ 8 tế bào, sau 5 thế hệ ta thu được lượng tế bào trong bình nuôi cấy là A. 125 B. 2048 KHÁI NIỆM C. 1012 D. 256 Từ 3 tế bào, sau bao nhiêu thế hệ ta thu được 9.104 tế bào A. 15 B. 20 KHÁI NIỆM C. 19 D. 12 ĐƯỜNG CONG TĂNG TRƯỞNG 1. Pha tiềm ẩn • VK thích ứng dần với MT mới, tích lũy cdd cho gđ phân chia; dân số không tăng • Cấy VK đang tăng trưởng lũy thừa vào cùng loại MT, trong cùng đk nuôi cấy  bỏ qua pha tiềm ẩn 2. Pha lũy thừa ĐƯỜNG CONG TĂNG TRƯỞNG • Số lượng tb tăng theo cấp số nhân đến khi cạn kiệt cdd thiết yếu/MT hoặc sản phẩm thải (độc tố tích trữ do biến dưỡng) đạt đủ mức kiềm chế • Tb có trạng thái khỏe mạnh nhất  lý tưởng để nghiên cứu về enzym hoặc các thành phần khác 3. Pha ổn định • Số tb sinh ra = số tb chết đi • TB vẫn hoạt động (TĐC chuyển hóa năng lượng) ĐƯỜNG CONG TĂNG TRƯỞNG 4. Pha suy thoái • Số tb chết đi > số tb sinh mới • Sau khi đa số tb chết, tỷ suất chết giảm mạnh: một ít tb tiếp tục sống sót 1 thời gian dài nhờ cdd từ tb chết thải ra MT Xác định toàn phần vi khuẩn • Đếm tổng số tế bào bằng buồng đếm • Đo tỉ trọng tế bào • Đo độ đục • Định lượng nitơ toàn phần  Nhược điểm: ĐO SỰ TĂNG TRƯỞNG TB VK (1) Không phân biệt sống – chết (2) Không chính xác, nhất là mật độ tb thấp Xác định vk sống • Đếm sống bằng pp trải đĩa/đếm SL khuẩn lạc • Xác định sản phẩm của vk sống (O2 hấp thu, ATP) • Đếm tổng số tế bào bằng buồng đếm Đếm tổng số tế bào bằng buồng đếm Đo tỉ trọng tế bào  Rửa sạch khối VK, làm khô  Cân trọng lượng khô TB/thể tích môi trường lỏng • Đo độ đục số tế bào • Đếm sống - PP đổ đĩa vs trải đĩa YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN TĂNG TRƯỞNG • Nhiệt độ • pH • Áp suất thẩm thấu • Oxy Nhiệt độ Tốc độ tăng trưởng Các PƯ enzym tăng Nhiệt độ tối ưu Các PƯ enzym cao nhất Nhiệt độ NĐ tối thiểu Màng bị tạo gel, quá trình vận chuyển chậm, tăng trưởng ko diễn ra NĐ tối đa Protein biến tính, màng tb bị phá hỏng, ly giải NHIỆT ĐỘ •Nhóm ưa lạnh: To~<15oC •Nhóm trung bình: To~20- 40oC •Nhóm ưa nhiệt: To~45- 60oC •Nhóm ưa nhiệt cao: To~>80oC NHIỆT ĐỘ Hầu hết VK phát triển tốt ở pH trung tính (6-8) Nấm mốc, nấm men phát triển tốt ở pH acid (5 – 6) pH • Môi trường hoạt tính nước thấp: VSV lấy nước bằng cách tăng nồng độ chất tan nội bào ÁP SUẤT THẨM THẤU Phân loại VSV theo nhu cầu oxy Oxy Nhóm Mối liên hệ với oxy Hiếu khí Bắt buộc Cần Tùy ý Không cần nhưng tăng trưởng tốt hơn nếu có oxy Vi hiếu khí Cần nhưng mới mức thấp hơn trong không khí Kỵ khí Bắt buộc Có hại hoặc chết Chịu đc kk (tùy ý) Không cần, tăng trưởng tốt hơn nếu ko có oxy Sản phẩm của hô hấp là các dạng độc tính cao của oxy như: superoxid (O2-), hydroxyl (OH*), H2O2 có khả năng oxy hóa các chất hữu cơ/ tb  VSV có enzym phân hủy oxy độc: catalase, peroxidase, superoxid dismutase Oxy Oxy Ý nghĩa trong nuôi cấy VSV •VSV hiếu khí: lắc, khuấy, sục khí tiệt trùng vào MT •VSV kỵ khí: khử oxy trong MT như thioglycolat, cho khí tiêu oxy vào bình Oxy Phân loại vi khuẩn theo nhu cầu oxy Một số khái niệm • Sự vô trùng (Sterility) / Sự vô khuẩn (Aseptic) • Tiệt trùng (Sterilisation) / Sát trùng (Antiseptic) / Tẩy trùng (Disinfection) KIỂM SOÁT VSV • Chất kìm khuẩn (Bacteriostatic agent) / Chất diệt khuẩn (Bacteriocidal agent) • Sự nhiễm trùng (Contamination) • Vệ sinh (Sanitation) • Nhiệt ẩm có áp suất: 121oC, 1.1 kg/cm2. Dùng cho sản phẩm y tế, dụng cụ, MT nuôi cấy • Nhiệt ẩm không áp suất: 62.8oC/30ph hoặc 71.7oC/15ph (PP Pasteur, Tyndall) • Nhiệt khô: 180oC/2h. Thủy tinh, bột, dầu (lò sấy) • Tia tử ngoại: không khí, bề mặt KIỂM SOÁT VSV – pp vật lý • Tia phóng xạ: chỉ khâu, đồ nhựa dùng 1 lần • Lọc: dung dịch (màng cellulose 0.45, 0.22µm) hoặc không khí (lọc HEPA) Nhiệt ẩm có áp suất Nhiệt ẩm không áp suất Nhiệt ẩm không áp suất Nhiệt ẩm không áp suất TIA TỬ NGOẠI + NHIỆT KHÔ (TỦ SẤY) + TIA PHÓNG XẠ PP LỌC • Dung môi hữu cơ • Kim loại nặng • Phenol và dẫn xuất KIỂM SOÁT VSV – pp hóa học • Halogen • Chất tẩy • Chất tác động bề mặt Yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả tẩy trùng • Thời gian • Nhiệt độ KIỂM SOÁT VSV – pp hóa học • pH • Loại VSV • Nồng độ chất tẩy trùng • Môi trường xung quanh • Tác nhân chọn lọc trên VSV, ít ảnh hưởng đến tb chủ • Kháng sinh: chất nguồn gốc tự nhiên/ tổng hợp, tác động tại chỗ/ hệ thống, hiệu quả kìm khuẩn/ diệt khuẩn Đích tác động của kháng sinh Kháng sinh KIỂM SOÁT VSV – hóa trị liệu Ức chế tổng hợp thành tế bào β-lactam (penicillin, cephalosporin) Ức chế tổng hợp màng tế bào Polymycin Kháng nấm (Amphotericin B, Nystatin) Ức chế tổng hợp acid nucleic Quinolon, Rifampicin 5-nitroimidazol Ức chế tổng hợp protein Aminoglycosid, Tetracyclin, Spectinomycin Chloramphenicol, Erythromycin SỰ TRAO ĐỔI CHẤT CỦA VSV Sự trao đổi chất nhằm cung cấp: • Vật liệu để xây dựng cơ thể • Năng lượng ở dạng thích hợp cho tb. Quan trọng nhất là NL ở dạng ATP, xem như “tiền tệ năng lượng” cho các PƯ trao đổi NL của tb Năng lượng được tạo ra bởi cơ chế hô hấp, quang hợp, lên men Đại cương Glucose Đường phân EM, HMP, ED Acid pyruvic CT Krebs CO2 Chuỗi chuyền điện tử Oxy SO42-, NO32- HH hiếu khí (OXH hoàn toàn) Hô hấp kỵ khí A. lactic Rượu Lên men (OXH không hoàn toàn) Chất nhận điện tử cuối cùng là: Chất hữu cơ H2O S2-, NH3