Điều tra tình hình nhiễm virut Laem Singh bằng kỹ thuật RT-PCR trên tôm sú nuôi (Penaeus monodon) ở Khánh Hòa

Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 3/2013 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 7 ĐIỀU TRA TÌNH HÌNH NHIỄM VIRUT LAEM SINGH BẰNG KỸ THUẬT RT-PCR TRÊN TÔM SÚ NUÔI (Penaeus monodon) Ở KHÁNH HÒA SURVEY ON LAEM SINGH VIRUS IN FARMED BLACK TIGER SHIRMP (Penaeus monodon) IN KHANH HOA PROVINCE USING RT-PCR Đặng Thúy Bình1, Nguyễn Viết Dũng2, Nguyễn Thị Anh Thư3, Văn Hồng Cầm4 Ngày nhận bài: 10/01/2013; Ngày phản biện thông qua: 20/5/2013; Ngày duyệt đăng: 10/9/2013 TÓM TẮT Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng phương pháp RT-PCR (Reverse Transcriptase Polymerase chain reaction) để khảo sát tình hình nhiễm virut Laem-Singh (LSNV) trên tôm sú giống và thương phẩm tại địa bàn tỉnh Khánh Hòa. 13 mẫu (16,25%) trong tổng số 80 mẫu tôm (thu ngẫu nhiên từ 11/2011 - 5/2012 tại các chợ, các trại nuôi tôm ở khu vực huyện Vạn Ninh, Ninh Hòa, Cam Ranh và Nha Trang - tỉnh Khánh Hòa) được xác định nhiễm LSNV. Trong đó, tôm sú thương phẩm có dấu hiệu chậm lớn nhiễm LSNV là 36,67% (11/30). 8% (2/25) tôm sú thương phẩm nhiễm LSNV tuy bề ngoài không có biểu hiện chậm lớn. Nghiên cứu chưa phát hiện có sự hiện diện của LSNV trên tôm sú giống (0 /25 mẫu tôm giống). Từ khóa: RT-PCR, LSNV, MSGS, Penaeus monodon, Khánh Hòa ABSTRACT In this research, RT-PCR (Reverse Transcriptase Polymerase chain reaction) method was used to identify the proportion of Laem-Singh virus infection in post-larvae and marketed shrimp in Khanh Hoa province. A survey of 80 P. monodon collected from 11/2011 to 5/2012 from markets, farms around Van Ninh, Ninh Hoa, Cam Ranh and Nha Trang (all belonged to Khanh Hoa Province) revealed that 16.25% (13 of 80) was infected by Laem-Singh virus (LSNV). Among these, 36,67% market shrimps with slow growth syndrome gave positive result with LSNV. In addition, 8% (2/25) commercial shrimp got LSNV infection without signal associated with disease or slow growth. There was no evidence of LSNV infection in post-larvae. Keywords: RT-PCR, LSNV, MSGS, Penaeus monodon, Khánh Hòa 1 TS. Đặng Thuý Bình, 2 Nguyễn Viết Dũng, 3 Nguyễn Thị Anh Thư, 4 Văn Hồng Cầm: Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường - Trường Đại học Nha Trang THOÂNG BAÙO KHOA HOÏC I. ĐẶT VẤN ĐỀ Virus Laem-Singh (LSNV) lần đầu tiên được phát hiện trên tôm sú Penaeus monodon có dấu hiệu chậm lớn ở tỉnh Laem Singh, Thái Lan năm 2003. Sittidilokratna và cs (2009) điều tra tình hình nhiễm LSNV trên tôm sú thu từ 1998 đến 2007. Kết quả cho thấy có đến 46/81 mẫu bị nhiễm LSNV ở Andhra Prades Ấn Độ; ở Malaysia và Indonesia chỉ có 1/6 mẫu nhiễm LSNV; ở Việt Nam là 2/6 và ở Thái Lan 39/40 mẫu tôm sú nuôi nhiễm LSNV. Theo Nguyễn Viết Dũng và cs (2011) tần xuất bắt gặp sự hiện diện của LSNV trên các mẫu tôm có biểu hiện chậm lớn ở các mẫu thu tại tỉnh Sóc Trăng (7/2008) và Kiên Giang (3/2008) là rất cao chiếm 63% số mẫu phân tích. Tôm bệnh MSGS có 3 trong số 5 đặc điểm sau: tôm tối sậm màu bất thường, kém ăn, hoạt động yếu; có đốm vàng sáng bất thường trên thân tôm, đốt bụng tôm có dạng thân đốt tre; râu tôm dễ bị đứt gãy; tốc độ tăng trưởng trung bình < 0,1g/ngày trong 4 tháng làm kéo dài vụ thu hoạch ao tôm nuôi . Nghiên cứu này áp dụng phương pháp RT-PCR một bước để xác định sự hiện diện của LSNV trên tôm sú ở khu vực tỉnh Khánh Hòa nhằm bước đầu khảo sát tình hình nhiễm LSNV trên địa bàn tỉnh. Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 3/2013 8 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Đối tượng và phương pháp thu mẫu Mẫu tôm sú (Penaeus monodon) gồm: 25 mẫu tôm giống, 30 mẫu tôm thương phẩm có dấu hiệu chậm lớn (Monodon Slow Growth Syndrome - MSGS) và 25 mẫu tôm thương phẩm khỏe mạnh được thu ngẫu nhiên tại các chợ thành phố Nha Trang, các trại nuôi ở khu vực huyện Vạn Ninh, Ninh Hòa và thành phố Cam Ranh - tỉnh Khánh Hòa, từ tháng 11/2011 tới tháng 5/2012. Mẫu tôm được thu sống và bảo quản trong thùng đá, vận chuyển nhanh về phòng thí nghiệm và bảo quản ở -400C. Tôm có dấu hiệu chậm lớn được thu ở giai đoạn từ 16 đến 104 ngày tuổi (trọng lượng trung bình 5,5 ± 0,3g và chiều dài trung bình 5,5 ± 0,5cm, n = 30). Những mẫu tôm này đều có dấu hiệu giảm lượng tiêu thụ thức ăn, bơi vào bờ bất thường. Tôm phát triển bình thường cũng được thu ở giai đoạn từ 16 đến 104 ngày tuổi (trọng lượng trung bình 6,8 ± 0,3g và chiều dài trung bình 7,4 ± 0,5cm, n = 25). Mẫu chứng dương LSNV được cung cấp bởi Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản 2 (RIA2). 2. Tách chiết RNA tổng số RNA tổng số của tôm sú P. monodon được tách chiết dựa trên phương pháp của Chomczynski và Sacchi (2011). Mẫu tôm (100-150mg từ mang của tôm thương phẩm hoặc 30-50 cá thể tôm giống được nghiền nhuyễn với các tác nhân biến tính mạnh (Guanidine 14M và phenol). Sau khi đã bổ sung dung dịch: phenol chloroform, ly tâm để loại bỏ các thành phần không mong muốn trong mẫu đồng thời để tách RNA hòa tan trong pha nước ra khỏi pha phenol. Tiếp đó, RNA được kết tủa bởi isopropanol và rửa hai lần với ethanol 75%. Cuối cùng hòa tan RNA với 100µl nước tinh khiết (DEPC-Diethyl pyrocarbonate). Trước khi tiến hành phản ứng RT-PCR, dung dịch RNA tổng số được biến tính ở 700C trong 10 phút và làm lạnh nhanh trong đá. 3. Phát hiện virut LSNV bằng phương pháp RT-PCR Phản ứng RT-PCR phát hiện virut LSNV được tiến hành theo Sritunyalucksana và cs (2006) và được hiệu chỉnh bởi Nguyễn Viết Dũng và cs (2011). Dung dịch tách chiết ARN đã biến tính được dùng cho phản ứng RT-PCR một bước để khuếch đại đoạn gen RdRp (RNA dependent RNA polymerase) sử dụng cặp mồi 20AF (5’- TTGCCTTCTCCC- GAGTGGTC - 3’) và 20AR (5’- CCGGCTGAGG- TAGCTGCTTG - 3’) (Sritunyalucksana và cs, 2006). Phản ứng được tiến hành với tổng thể tích 25µl (gồm 2µl khuôn ARN, 35pmol mỗi mồi), đệm Colorless GoTaq® Flexi 1X, 0,2 mM dNTPs, 2mM MgCl2, 5U AMV Reverse trancriptase, 1,25U Gotaq® Hotstart Polymerase (Promega, Mỹ). Phản ứng được chạy trên máy luân nhiệt Icycler (Bio-rad) theo chương trình nhiệt độ: Bước tổng hợp cDNA tại 440C trong 40 phút; tiếp theo là là bước biến tính DNA tại 950C trong 3 phút, sau đó là 35 chu kỳ tổng hợp DNA bắt đầu ở 940C trong 40 giây, 600C trong 20 giây, 720C trong 30 giây, cuối cùng là bước kéo dài tại 720C trong 10 phút. Sản phẩm của phản ứng PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 1,5% nhuộm ethidium bromide. Kết quả được ghi nhận sử dụng hệ thống ghi ảnh gel tự động Geldoc và phần mềm Quantity One (Bio-rad). III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 1. Dấu hiệu bệnh lí Mẫu tôm sú thương phẩm có dấu hiệu chậm lớn (30 mẫu), trong đó 8/30 có dấu hiệu lỏng vỏ (LSS - loose shell syndrome); 5/30 mẫu tôm bị bệnh đốm trắng (WSSV - White Spot Syndrome Virus); 3/30 mẫu tôm bị bệnh hoại tử cơ quan tạo máu và cơ quan biểu mô (IHHNV - Infectious Hypodermal and Hematopoietic Necrosis Virus). Tôm khỏe mạnh có trọng lượng và chiều dài trung bình lớn hơn tôm có dấu hiệu chậm lớn (Trọng lượng của tôm khỏe mạnh: 7,4 ± 0,5cm và trọng lượng của tôm chậm lớn: 6,8 ± 0,3g, n = 25; Chiều dài của tôm khỏe mạnh: 5,5 ± 0,5cm và chiều dài của tôm chậm lớn: 5,5 ± 0,3g, n = 30). Dấu hiệu bệnh lý và sự khác biệt kích thước được mô tả ở hình 1. Hình 1. Tôm sú thả nuôi sau 104 ngày được thu từ cùng một ao nuôi tôm ở xã Vạn Thạnh, huyện Vạn Ninh A. Tôm khỏe mạnh; B. Tôm có dấu hiệu chậm lớn; C. Tôm có dấu hiệu chậm lớn và lỏng vỏ Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 3/2013 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 9 Kết quả nghiên cứu không phát hiện có sự hiện diện của LSNV trên tôm giống (0/25 mẫu nghiên cứu). Ở Việt Nam đã phát hiện ra tôm sú giống bị nhiễm LSNV chiếm tỷ lệ 1%. Kết quả nghiên cứu này phù hợp với nghiên cứu của Nguyễn Viết Dũng và cs (2011), điều này cho thấy xác xuất phát hiện bệnh LSNV trên tôm giống là khá thấp. Tần suất bắt gặp của virus LSNV trên tôm sú có dấu hiệu chậm lớn ở khu vực nuôi tỉnh Khánh Hòa là 36,67%. Tôm thương phẩm có dấu hiệu chậm lớn được thu ở các chợ và đìa tại Nha Trang, Ninh Hòa và Cam Ranh. Trong đó, 3/8 mẫu tôm có dấu hiệu chậm lớn và lỏng vỏ (LSS); 3/5 mẫu tôm có dấu hiệu chậm lớn và dương tính với bệnh đốm trắng (WSSV); và 2/3 mẫu tôm có dấu hiệu chậm lớn và dương tính với bệnh hoại tử cơ quan tạo máu và cơ quan biểu mô (IHHNV) đều phát hiện dương tính với LSNV. Ở Thái Lan năm 2007, 39/40 mẫu tôm sú có dấu hiệu chậm lớn đã được phát hiện có nhiễm virus LSNV. Ở Việt Nam, 63% mẫu phân tích từ tôm có dấu hiệu chậm lớn phát hiện có sự hiện diện của LSNV tại tỉnh Sóc Trăng. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy trên các mẫu tôm có dấu hiệu chậm lớn ở khu vực trong tỉnh có tỉ lệ nhiễm LSNV thấp hơn so với mẫu ở Sóc Trăng - Việt Nam và mẫu ở Thái Lan, tuy nhiên tần suất 36,67% nhiễm LSNV trên địa bàn tỉnh là một con số đáng báo động. Nghiên cứu của Prakasha và cs (2007) cũng phát hiện 3 mẫu dương tính với LSNV có dấu hiệu lỏng vỏ (LSS); 2 trong 3 mẫu khác dương tính với LSNV cũng nhiễm virus đốm trắng (WSSV) và virus gây bệnh còi (MBV). Rõ ràng rằng nhiễm LSNV trên quần thể tôm có dấu hiệu chậm lớn có tỷ lệ khá cao, điều này cho thấy có mối quan hệ giữa tôm có dấu hiệu chậm lớn (MSGS) và nhiễm LSNV, cũng như tốc độ tăng trưởng chậm có thể ảnh hưởng bởi các bệnh lý khác (như LSS, WSSV, MBV, IHHNV hay HPV). Các mẫu tôm sú phát triển bình thường trên địa bàn tỉnh bị nhiễm LSNV là 8%. Sự xuất hiện của virus LSNV trên cả tôm có dấu hiệu chậm lớn và tôm phát triển bình thường cũng đã từng được ghi nhận trước đây. Ở Ấn Độ, tỉ lệ nhiễm virus LSNV trên các ao nuôi công nghiệp là 5,4% trong 56 mẫu phân tích ngẫu nhiên. Năm 2007 cũng tại Ấn Độ tỷ lệ nhiễm LSNV trên tôm không có dấu hiệu chậm lớn đã được ghi nhận cao hơn (56% trong 81 mẫu 2. Khuếch đại sản phẩm PCR Sản phẩm PCR khuếch đại bởi mồi 20AF và 20AR có kích thước 197 bp phù hợp với tính toán lý thuyết (hình 2). Kết quả cũng phù hợp với nghiên cứu của Sritunyalucksana và cs (2006) và Nguyễn Viết Dũng và cs (2011). Hình 2. Kết quả điện di sản phẩm của quy trình RT-PCR chẩn đoán bệnh LSNV trên tôm sú Giếng M: thang chuẩn DNA 100bp (GeneRulerTM); giếng 1, 2: Mẫu dương tính LSNV trên tôm khỏe mạnh; giếng 3, 4: mẫu dương tính LSNV trên tôm MSGS; giếng 5, 6: mẫu dương tính LSNV trên tôm có dấu hiệu lỏng vỏ; giếng 7, 8: mẫu dương tính LSNV trên tôm bị bệnh đốm trắng; giếng 9, 10: Mẫu dương tính với LSNV trên tôm bị bệnh IHHNV; giếng 11, 12: Mẫu âm tính trên tôm giống; giếng 13: Đối chứng âm; giếng 14: Đối chứng dương. 3. Tình hình nhiễm LSNV ở Khánh Hòa Kết quả phân tích cho thấy có 13/80 mẫu tôm sú thương phẩm bị nhiễm virus LSNV, không phát hiện mẫu tôm giống nhiễm LSNV. Kết quả phân tích tỷ lệ nhiễm trên các mẫu tôm sú thu thập được thể hiện ở bảng 1. Bảng 1. Kết quả khảo sát nhiễm LSNV mẫu tôm sú giống và nuôi thương phẩm tại khu vực tỉnh Khánh Hòa Tôm giống Tôm thương phẩm MSGS Tôm thương phẩm phát triển bình thường Số mẫu Tỷ lệ Số mẫu Tỷ lệ Số mẫu Tỷ lệ Mẫu dương tính 0/25 0% 11/30 36,67% 2/25 8% Tổng 13/80 (16,25%) Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 3/2013 10 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG nghiên cứu). Trong khi đó, tỷ lệ nhiễm LSNV trên các mẫu tôm thu ngẫu nhiên tại khu vực đồng bằng sông Cửu Long là 10,6%. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi ghi nhận sự hiện diện của virus LSNV trong hệ thống tôm nuôi ở khu vực tỉnh Khánh Hòa. Kết quả khảo sát cũng cho thấy tỷ lệ nhiễm LSNV trên tôm sú có dấu hiệu chậm lớn (36,67%) cao hơn tôm sú phát triển bình thường (8%). Điều này chứng tỏ có mối liên hệ giữa virus LSNV và hiện tượng tôm chậm lớn trên tôm nuôi ở Việt Nam đồng thời cũng phù hợp với kết luận của Panphut và cs (2011), virus LSNV là điều kiện cần chứ chưa phải là điều kiện đủ để gây ra bệnh chậm lớn trên tôm sú. Do virus LSNV đã được xác định hiện diện trên tôm sú và có khả năng lây nhiễm ở các loài giáp xác quanh khu vực nuôi (Kumar và cs, 2011) nên có thể ảnh hưởng đến sự lan truyền đến hệ thống canh tác, mặt khác LSNV liên quan đến bệnh chậm lớn vì vậy nếu kéo dài thời gian nuôi sẽ làm giảm năng suất, gây thiệt hại cho người nuôi vì phải kéo dài thời gian chăm sóc, phát sinh thêm chi phí thức ăn và thuốc men cho tôm. Vì vậy, việc áp dụng phương pháp RT- PCR để giám sát virus LSNV là cần thiết để nâng cao chất lượng tôm sú tại khu vực tỉnh Khánh Hòa. IV. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Virus LSNV đã hiện diện trong hệ thống nuôi tôm sú ở tỉnh Khánh Hòa. Tỷ lệ tôm sú nuôi thương phẩm có dấu hiệu chậm lớn nhiễm LSNV cao hơn trên tôm sú phát triển bình thường. Chưa phát hiện tôm giống nhiễm LSNV. Vì vậy, cần xây dựng hệ thống kiểm soát bệnh LSNV để cảnh báo cho người nuôi tôm nhằm nâng cao chất lượng tôm sú thương phẩm. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt 1. Nguyễn Viết Dũng, Trần Thị Phương Tú, Phạm Hùng Vân, Nguyễn Văn Hảo. Phát hiện virus Laem singh bằng kỹ thuật RT- PCR trên tôm sú nuôi (Penaeus monodon) ở đồng bằng sông Cửu Long. Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, ISSN 0866-7020, 2011: 86-90. Tiếng Anh 2. Chomczynski P and Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Analytical Biochemistry, 1987. 162(1): 156-159. 3. Krishnan P, Makesh M, Chaudhari A, Purushothaman CS and Rajendran KV. Natural host-range and experimental transmission of Laem-Singh virus (LSNV). Diseases of Aquatic Organisms, 2011. 96(1): 21-27. 4. Panphut W, Senapin SS, Sriurairatana SS, Withyachumnarnkul B and Flegel TW. A novel integrase-containing element may interact with Laem-Singh virus (LSNV) to cause slow growth in giant tiger shrimp. BMC Veterinary Research, 2011. 7(1): 18. 5. Prakasha BK, Ramakrishna RP, Karunasagar I and Karunasagar I. Detection of Laem-Singh virus (LSNV) in cultured Penaeus monodon from India. Diseases of Aquatic Organisms, 2007. 77(1): 83-86. 6. Pratoomthai B, Sakaew W, Sriurairatana S, Wongprasert K and Withyachumnarnkul B. Retinopathy in stunted black tiger shrimp Penaeus monodon and possible association with Laem-Singh virus (LSNV). Aquaculture, 2008. 284(1–4): 53-58. 7. Pratoomthai B, Wongprasert K, Flegel WT and Withyachumnarnkul B. Infection by Laem-Singh Virus in the fasciculated zone and organ of Bellonci of the eyes of small Penaeus monodon from Monodon slow-growth syndrome pond. Asian-Pacifi c Aquaculture, 2007. 199. 8. Sittidilokratna N, Dangtip S, Sritunyalucksana K, Babu R, Pradeep B, Mohan CV, Gudkovs N and Walker PJ. Detection of Laem-Singh virus in cultured Penaeus monodon shrimp from several sites in the Indo-Pacifi c region. Diseases of Aquatic Organisms, 2009. 84(3): 195-200. 9. Sritunyalucksana K, Apisawetakan S, Bono-nat A, Withyachumnarnkul B and Flegel TW. A new RNA virus found in black tiger shrimp Penaeus monodon from Thailand. Virus Research, 2006. 118(1–2): 31-38.