Điều kiện ủ thích hợp và khả năng thủy phân tinh bột và protein trong bã sắn của chủng Bacillus Subtilis C7 - Phạm Hồng Ngọc Thùy

Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 2/2016 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 101 THOÂNG BAÙO KHOA HOÏC ĐIỀU KIỆN Ủ THÍCH HỢP VÀ KHẢ NĂNG THỦY PHÂN TINH BỘT VÀ PROTEIN TRONG BÃ SẮN CỦA CHỦNG BACILLUS SUBTILIS C7 SUITABLE FERMENTING CONDITIONS AND HYDROLYSIS OF STARCH AND PROTEIN IN CASSAVA RESIDUE OF BACILLUS SUBTILIS C7 Phạm Hồng Ngọc Thùy1, Nguyễn Thị Thanh Hải2, Nguyễn Minh Trí3 Ngày nhận bài: 09/10/2014; Ngày phản biện thông qua: 21/6/2015; Ngày duyệt đăng: 15/6/2016 TÓM TẮT Chủng Bacillus subtilis C7 có khả năng sinh các enzyme amylase và protease để thủy phân tinh bột và protein có trong bã sắn. Bã sắn được ủ với chủng Bacillus subtilis C7 ở mật độ 106CFU/g hỗn hợp để nâng cao hiệu quả sử dụng tinh bột và protein. Chế độ ủ bã sắn với chủng Bacillus subtilis C7 thích hợp như sau: Nhiệt độ ủ 36 ± 1°C, thời gian ủ 48 giờ, tỉ lệ nước/hỗn hợp là 2/1 (v/w), tỉ lệ đậu nành bổ sung 10% (w/w). Hiệu suất thủy phân tinh bột sau khi ủ theo chế đô trên là 26,42 ± 0,43%; hàm lượng axit amin đạt 0,87 ± 0,01%. Từ khóa: Bacillus subtilis C7, bã sắn, tinh bột, protein ABSTRACT Bacillus subtilis C7 has ability to synthesize amylase and protease to hydrolyze starch and protein in cassava residue. Cassava residue was added Bacillus subtilis C7 at the bacterial density 106CFU/g mixture and fermented in order to enhance the effect of utilizing starch and protein. Suitable fermenting conditions of cassava residue with Bacillus subtilis C7 are as follows: Fermenting temperature was 36 ± 1oC, fermenting time was 48 hours, the ratio of water to mixture was 2/1 (v/w), the content of added soybean was 10% (w/w). The hydrolysis productivity of starch after the fermentation was 26.42 ± 0.43% and the content of amino acid was 0.87 ± 0.01%. Keywords: Bacillus subtilis C7, cassava residue, starch, protein 1 Khoa Công nghệ thực phẩm – Trường Đại học Nha Trang, 2 Viện Công nghệ sinh học và Môi trường – Trường Đại học Nha Trang, 3 Trường Đại học Nha Trang I. ĐẶT VẤN ĐỀ Sắn được xem là cây lương thực có sản lượng lớn thứ hai sau cây lúa và đang có xu hướng tiếp tục tăng về diện tích và sản lượng. Hiện nay, sắn chủ yếu được dùng làm nguyên liệu cho các nhà máy chế biến tinh bột; bã sắn công nghiệp là phụ phẩm của quá trình sản xuất tinh bột, nó chiếm khoảng 45% so với khối lượng sắn nguyên củ [6]. Thành phần bã sắn chứa chất hữu cơ chiếm 97,2% chất khô, trong đó có tinh bột chiếm 68%, protein thô 3,6% [11]. Nếu không sử dụng nguồn bã sắn hiệu quả sẽ gây lãng phí và ô nhiễm môi trường. Hiện nay, bã sắn đã và đang được sử dụng làm nguồn thức ăn chăn nuôi, nhưng nhằm cung cấp thêm chất xơ là chính, chưa chú ý đến khai thác hiệu quả các chất khác có trong bã sắn như tinh bột và protein. Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 2/2016 102 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG Chủng vi khuẩn Bacillus subtilis C7 được phân lập và tuyển chọn từ đất cho thấy có khả năng sinh bốn loại enzyme: amylase, protease, phytase, cellulose [5]; hiệu quả thủy phân cellulose và phytase đã được khảo sát bởi Mạch Trần Phương Thảo và các cộng sự (2014) [4]. Nghiên cứu này tập trung vào tìm điều kiện ủ thích hợp và đánh giá khả năng thủy phân tinh bột và protein của chủng Bacillus subtilis C7 với mục đích nâng cao hiệu quả khi dùng bã sắn làm thức ăn chăn nuôi. II. ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Đối tượng và vật liệu nghiên cứu 1.1. Chủng Bacillus subtilis C7: Được phân lập từ mẫu đất (lấy mẫu từ đất vườn, thuộc phường Vĩnh Hải, thành phố Nha Trang). Chủng này được lưu trữ tại Phòng thí nghiệm Vi sinh thuộc Trung tâm thí nghiệm thực hành, Trường Đại học Nha Trang. 1.2. Bã sắn: Bã sắn được thu nhận từ các nhà máy chế biến tinh bột sắn tại Cam Ranh, tỉnh Khánh Hòa và sấy khô đến hàm lượng ẩm từ 5 – 6% để tiến hành nghiên cứu. 1.3. Đậu nành: Đậu nành được sấy khô đến hàm lượng ẩm khoảng 5 – 6%, sau đó xay nhỏ và sử dụng cho nghiên cứu. 2. Phương pháp nghiên cứu 2.1. Bố trí thí nghiệm Bã sắn xay nhỏ được bổ sung thêm bột đậu nành với tỉ lệ lần lượt là 0%, 5%, 10%, 15%, 20% (w/w), sau đó được thêm nước với tỉ lệ nước/hỗn hợp lần lượt là 1/1; 1,5/1; 2/1; 2,5/1 (v/w) và được hấp vô trùng ở nhiệt độ 121oC trong 15 phút rồi làm nguội. Chủng Bacillus subtilis C7 được bổ sung với tỷ lệ 106CFU/g hỗn hợp và ủ ở các mức nhiệt độ khác nhau 24 ± 1°C; 30 ± 1°C và 36 ± 1°C với các khoảng thời gian từ 12 đến 96 giờ (bước nhảy là 12 giờ). Hiệu suất thủy phân tinh bột và hàm lượng axit amin sau khi ủ được xác định để chọn thông số thích hợp cho quá trình ủ bã sắn với chủng Bacillus subtilis C7. 2.2. Phương pháp phân tích các chất 2.2.1. Xác định độ ẩm Độ ẩm được xác định theo TCVN 4326:2001 [7]. 2.2.2. Xác định hàm lượng tinh bột Hàm lượng tinh bột trong 2g mẫu được xác định thông qua hàm lượng đường glucose tạo thành từ quá trình thủy phân tinh bột bằng HCl, trong đó hàm lượng glucose được xác định bằng thuốc thử DNS (3,5-Axit Dinitrosalicylic). Hàm lượng tinh bột được tính bằng cách lấy hiệu số giữa hàm lượng glucose trong mẫu sau khi thủy phân bằng HCl và trước khi thủy phân nhân với hệ số 0,9 [3], thí nghiệm được thực hiện với 3 lần lặp. 2.2.3. Xác định hàm lượng nitơ axit amin Hàm lượng nitơ axit amin được tính bằng cách lấy hàm lượng đạm formol trừ đi hàm lượng nitơ NH3. Trong đó hàm lượng đạm formol được xác định bằng phương pháp chuẩn độ, hàm lượng NH3 được xác định theo phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước [2]. Khối lượng mẫu dùng để xác định hàm lượng đạm formol và hàm lượng nitơ NH3 là 2g, thí nghiệm được lặp lại 3 lần. 3. Phương pháp xử lý số liệu Kết quả trình bày là trung bình cộng của 3 lần thí nghiệm ± Độ lệch chuẩn SD. Số liệu được xử lý bằng phần mềm MS. Excel 2003, SPSS 16.0. III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 1. Ảnh hưởng của thời gian ủ đến sự thủy phân tinh bột và protein Bã sắn được phối trộn với 5% bột đậu nành (w/w), tỷ lệ nước/hỗn hợp là 2/1 (v/w) và được hấp vô trùng. Sau đó, hỗn hợp được Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 2/2016 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 103 Khi tăng thời gian ủ từ 0 giờ đến 48 giờ thì hiệu suất thủy phân tinh bột tăng. Cụ thể, sau khi ủ 12 giờ hiệu suất thủy phân tinh bột là 12,29 ± 0,34%, nếu tăng thời gian ủ lên 48 giờ thì hiệu suất thủy phân tinh bột tăng lên gấp đôi. Tuy nhiên tiếp tục tăng thời gian ủ thì hiệu suất thủy phân tinh bột thay đổi không đáng kể (p > 0,05). Điều này có thể giải thích như sau: Từ 12 giờ tới 48 giờ hiệu suất thủy phân tinh bột tăng dần do đây là giai đoạn sinh tổng hợp mạnh mẽ các enzyme thủy phân cơ chất trong quá trình sinh trưởng của Bacillus subtilis C7. Ở giai đoạn này hoạt độ amylase cao, quá trình thủy phân diễn ra mạnh. Sau đó tiếp tục tăng thời gian lên thì hoạt độ amylase giảm nên hiệu suất thủy phân tinh bột không tăng lên nữa. Kết quả nghiên cứu của Gaewchingduang và cộng sự (2010) cũng cho thấy lượng đường khử thu hồi lớn nhất khi tiến hành ủ bã sắn với a - amylase thương mại trong điều kiện nhiệt độ 55oC trong thời gian 48 giờ [9]. Do đó, thời gian ủ bã sắn với Bacillus subtilis C7 thích hợp là 48 giờ để quá trình thủy phân tinh bột đạt hiệu suất cao. Đối với quá trình thủy phân protein, khi tăng thời gian ủ bã sắn với vi khuẩn Bacillus subtilis C7 từ 12 đến 36 giờ thì hàm lượng axit amin tăng và đạt cực đại ở thời gian ủ từ 24 - 36 giờ. Nhưng nếu tiếp tục tăng thời gian ủ lên 48 giờ thì hàm lượng nitơ axit amin giảm 8% và tiếp tục giảm hơn 40% khi ủ đến 84 giờ. Hiện tượng này có thể được giải thích là do khi kéo dài thời gian thủy phân thì một phần axit amin được vi khuẩn Bacillus subtilis C7 sử dụng và một phần axit amin tiếp tục bị phân hủy tạo thành các sản phẩm cấp thấp nên hàm lượng axit amin giảm. Như vậy, thời gian ủ thích hợp để thủy phân tinh bột và protein là 48 giờ. 2. Ảnh hưởng của nhiệt độ ủ đến sự thủy phân tinh bột và protein Bã sắn được phối trộn với 5% bột đậu nành (w/w), tỷ lệ nước/hỗn hợp là 2/1 (v/w). Hỗn hợp được hấp vô trùng và làm nguội, sau đó chủng Bacillus subtilis C7 được bổ sung với tỷ lệ 106CFU/g hỗn hợp và ủ ở các nhiệt độ 24 ± 1oC, 30 ± 1oC, 36 ± 1oC, thời gian ủ được xác định từ kết quả thí nghiệm trên. Kết quả được thể hiện trên hình 3 và hình 4. Hình 1. Hiệu suất thủy phân tinh bột theo thời gian ủ Hình 2. Hàm lượng nitơ axit amin theo thời gian ủ (Các chữ cái a, b, c, d thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa giữa các giá trị trung bình (p ≤ 0,05)) làm nguội, bổ sung Bacillus subtilis C7 với tỷ lệ 106CFU/g hỗn hợp và được ủ ở nhiệt độ phòng trong thời gian từ 12 đến 96 giờ. Sau từng thời gian ủ, chúng tôi xác định hiệu suất thủy phân tinh bột và hàm lượng axit amin trong hỗn hợp để chọn thời gian ủ thích hợp. Kết quả được thể hiện trên hình 1 và hình 2. Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 2/2016 104 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG Ba mức nhiệt độ là 24 ± 1oC, 30 ± 1oC và 36 ± 1oC được chọn để nghiên cứu sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự thủy phân tinh bột và protein vì kết quả nghiên cứu sẽ được ứng dụng thủy phân bã sắn dùng trong chăn nuôi heo thịt, việc lựa chọn ba mức nhiệt độ này có thể áp dụng vào thực tế sản xuất ở Việt Nam khi điều kiện thời tiết thay đổi giữa các mùa trong năm; ở các địa phương trồng sắn và sản xuất tinh bột. Khi tăng nhiệt độ từ 24 ± 1oC đến 36 ± 1oC thì hiệu suất thủy phân tinh bột tăng. Nghiên cứu của Suman và Ramesh (2010) trên B. subtilis KCPSS-12SS cho thấy 35oC là nhiệt độ tối ưu để chủng này sinh tổng hợp α-amylase cực đại [12]. Ngoài ra, Kokab và cộng sự (2003) khi nuôi cấy rắn chủng B. subtilis trên môi trường vỏ chuối được băm nhỏ cũng cho kết quả tương tự [10]. Hàm lượng nitơ axit amin tăng cao nhất khi ủ ở nhiệt độ 36 ± 1°C. Kết quả này tương tự như kết quả của Ahaotu và cộng sự (2011) khi nghiên cứu thủy phân protein sắn ở nhiệt độ 36 ± 1°C thì hiệu suất thủy phân đạt hiệu quả cao [8]. Từ những kết quả trên cho thấy khi thủy phân bã sắn ở nhiệt độ 36 ± 1°C thì hiệu quả thủy phân tinh bột và hàm lượng axit amin cao hơn nhiệt độ ủ ở 24 ± 1°C và 30 ± 1°C. Vì vậy, chúng tôi chọn nhiệt độ ủ bã sắn với chủng Bacillus subtilis C7 là 36 ± 1°C. 3. Ảnh hưởng của tỷ lệ nước đến sự thủy phân tinh bột và protein Bã sắn được phối trộn 5% đậu nành (w/w), tỷ lệ nước/hỗ hợp được nghiên cứu lần lượt là 1/1; 1,5/1; 2/1; 2,5/1 (v/w). Sau đó hỗn hợp được hấp vô trùng, làm nguội và bổ sung chủng Bacillus subtilis C7 với tỷ lệ 106CFU/g hỗn hợp. Sau 48 giờ ủ ở nhiệt độ 36 ± 1oC, tiến hành xác định hiệu suất thủy phân tinh bột và hàm lượng axit amin trong các mẫu có tỷ lệ nước bổ sung khác nhau. Kết quả được thể hiện trên hình 5 và hình 6. Hình 3. Ảnh hưởng của nhiệt độ ủ đến hiệu suất Hình 4. Ảnh hưởng của nhiệt độ ủ đến hàm thủy phân tinh bột lượng nitơ axit amin (Các chữ cái a, b, c thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa giữa các giá trị trung bình (p ≤ 0,05)) Hình 5. Ảnh hưởng của tỷ lệ nước/hỗn hợp Hình 6. Ảnh hưởng của tỷ lệ nước/hỗn hợp đến hiệu suất thủy phân tinh bột đến hàm lượng nitơ axit amin (Các chữ cái a, b, c thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa giữa các giá trị trung bình (p ≤ 0,05)) Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 2/2016 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 105 Khi tăng tỷ lệ nước/hỗn hợp từ 1/1 (v/w) lên 2/1 (v/w) thì hiệu suất thủy phân tinh bột tăng. Hiệu suất thủy phân tinh bột đạt cao nhất ở tỷ lệ nước/hỗn hợp là 2/1 (v/w) và thấp nhất ở tỷ lệ nước/hỗn hợp là 1/1 (v/w). Nếu tăng tỷ lệ nước/hỗn hợp lên 2,5/1 (v/w) thì hiệu suất thủy phân tinh bột thay đổi không đáng kể (p > 0,05). Điều này có thể giải thích như sau: Nếu độ ẩm tăng cao quá 55 - 70% sẽ làm giảm độ thoáng khí của môi trường, còn thấp hơn sẽ kìm hãm sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn cũng như sự sinh tổng hợp tạo enzyme amylase. Trong điều kiện vô trùng tốt (trong tủ ấm phòng thí nghiệm) hoạt lực amylase cao nhất thu được ở độ ẩm môi trường 65-68% [1]. Do đó, khi ủ bã sắn với Bacillus subtilis C7 nên chọn tỷ lệ nước/hỗn hợp là 2/1 (v/w) sẽ thích hợp cho quá trình thủy phân tinh bột. Đối với quá trình thủy phân protein, khi tăng tỷ lệ nước/hỗn hợp từ 1/1 (v/w) đến 2,5/1 (v/w) thì hàm lượng nitơ axit amin tăng. Cụ thể, ở tỷ lệ 1/1 (v/w) hàm lượng nitơ axit amin là 0,61 ± 0,01%; tăng tỷ lệ lên 2/1 (v/w) thì hàm lượng nitơ axit amin là 0,81 ± 0,01%. Khi tỷ lệ nước/hỗn hợp tăng đến 2,5/1 (v/w) thì hàm lượng nitơ axit amin thay đổi không đáng kể (p > 0,05). Từ những kết quả trên cho thấy tỷ lệ nước/ hỗn hợp là 2/1 (v/w) là thích hợp nhất. 4. Ảnh hưởng của tỉ lệ đậu nành đến sự thủy phân tinh bột và protein Bã sắn được bổ sung thêm bột đậu nành với tỷ lệ bột đậu nành lần lượt là 0%, 5%, 10%, 15% và 20% (w/w). Sau đó cho thêm nước với tỷ lệ nước/hỗn hợp là 2/1 (v/w) và hấp vô trùng. Hỗn hợp được để nguội và bổ sung chủng Bacillus subtilis C7 với mật độ 106CFU/g rồi tiến hành ủ ở nhiệt độ 36 ± 1oC trong 48 giờ. Hiệu suất thủy phân tinh bột và hàm lượng axit amin được thể hiện trên hình 7 và hình 8. Hình 7. Ảnh hưởng của tỷ lệ đậu nành đến hiệu Hình 8. Ảnh hưởng của tỷ lệ đậu nành đến hàm suất thủy phân tinh bột lượng nitơ axit amin (Các chữ cái a, b, c, d thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa giữa các giá trị trung bình (p ≤ 0,05)) Hiệu suất thủy phân tinh bột đạt cao nhất khi bổ sung 10% đậu nành, thấp nhất khi không bổ sung đậu nành. Khi tiếp tục tăng tỷ lệ đậu nành bổ sung lên 15% và 20% thì hiệu suất thủy phân tinh bột lại giảm. Cụ thể, hiệu suất thủy phân tinh bột ở mẫu không bổ sung đậu nành là 15,27 ± 0,22%, khi bổ sung 10% đậu nành thì hiệu suất thủy phân tinh bột tăng lên, đạt 26,42 ± 0,43%. Hiệu suất thủy phân tinh bột ở tỷ lệ đậu nành 15% và 20% giảm so với bổ sung 10% đậu nành, lần lượt là 24,29 ± 0,19 % và 24,75 ± 0,45%. Hàm lượng nitơ axit amin tăng ở tỷ lệ đậu nành 5% và 10%, giảm dần khi tỷ lệ đậu nành bổ sung tăng hơn 10%. Cụ thể, ở 5% hàm lượng nitơ axit amin 0,83 ± 0,03%, nếu tăng tỷ lệ đậu nành lên 10% thì hàm lượng nitơ axit amin tăng lên 0,87 ± 0,01%. Nếu tiếp tục tăng tỷ lệ đậu nành lên 20% thì hàm lượng nitơ axit amin giảm còn 0,84 ± 0,01%. Khi tăng tỷ lệ đậu nành lên 15% và 20% thì hàm lượng nitơ axit amin và hiệu suất thủy phân tinh bột có xu hướng giảm dần do trong môi trường ủ có nhiều thành phần chất dinh dưỡng nên Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 2/2016 106 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG vi khuẩn Bacillus subtilis C7 sử dụng trực tiếp và làm chậm quá trình thủy phân tinh bột và protein, một phần axit amin sẽ được vi khuẩn sử dụng, một phần tiếp tục bị phân hủy tạo NH3. Do đó, chúng tôi chọn tỉ lệ đậu nành bổ sung khi ủ bã sắn là 10% (w/w). IV. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1. Kết luận Chế độ ủ bã sắn với chủng Bacillus subtlis C7 (mật độ 106CFU/g hỗn hợp) để hiệu quả thủy phân tinh bột và protein cao là: Nhiệt độ ủ 36 ± 1°C, thời gian ủ 48 giờ, tỉ lệ nước/hỗn hợp là 2/1 (v/w), tỉ lệ đậu nành bổ sung 10% (w/w). Hiệu suất thủy phân tinh bột sau khi ủ theo chế độ trên là 26,42 ± 0,43%; hàm lượng axit amin đạt 0,87 ± 0,01%. 2. Kiến nghị Ứng dụng quy trình ủ bã sắn với chủng Bacillus subtlis C7 trong chăn nuôi heo thịt. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt 1. Quách Đĩnh, 1982. Sử dụng chế phẩm enzyme trong công nghiệp thực phẩm. NXB Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội. 2. Nguyễn Thị Hiền, Từ Việt Phú, Trần Thanh Đại, 2010. Phân tích thực phẩm. NXB Lao động. 3. Nguyễn Đức Lượng, Cao Cường, 2003. Thí nghiệm công nghệ sinh học, Tập 1: Thí nghiệm hóa sinh học. NXB Đại học Quốc Gia TP. HCM. 4. Mạch Trần Phương Thảo, Phạm Hồng Ngọc Thùy, Nguyễn Minh Trí, 2014. Khả năng thủy phân phytate và cellulose trong bã sắn của chủng Bacillus subtilis C7. Tạp chí Khoa học - Công nghệ thủy sản. Số 3/2014, trang 180-184. 5. Nguyễn Minh Trí, Mạch Trần Phương Thảo, Nguyễn Thị Thanh Hải, Phạm Hồng Ngọc Thùy, 2013. Tuyển chọn chủng Bacillus spp. sinh enzyme và nhân sinh khối trên môi trường bã sắn. Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn. Số 223/2013, trang 84-88. 6. Bùi Quang Tuấn, 2005. Ủ bã sắn làm thức ăn dự trữ cho trâu bò. Tạp chí chăn nuôi số 7. 7. TCVN 4326:2001 (ISO 6496:1999). Thức ăn chăn nuôi - Xác định độ ẩm và hàm lượng chất bay hơi khác. Tiếng Anh 8. Ahaotu, I., Oqueke, C. C., Owuamanam, C. I., Ahaotu, N. N. , Nwosu, J. N., 2011. Protein improvement in Gari by the use of pure cultures of microorganisms involved in the natural fermentation process. Pakistan Journal of Biological Sciences, 14: 933-938. 9. Gaewchingduang, S., Pengthemkeerati, P., 2010. Enhancing effi ciency for reducing sugar from cassava bagasse by pretreatment. World Academy of Science, Engineering and Technology, 4: 625-628. 10. Kokab, S., Asghar, M., Rehman, K., Asad, M. J., Adedyo, O., 2003. Bio-Processing of Banana Peel for α-amylase production by Bacillus subtilis. International Journal of Agriculture and Biology, 1: 36-39. 11. Sriroth, K., Chollakup, R., Chotineeranat, S., Piyachomkwan, K., Oates, C. G., 2000. Processing of cassava waste for improved biomass utilization. Bioresource Technology, 71: 63-69. 12. Suman, S. and Ramesh, K. 2010. Production of a thermostable extracellular amylase from thermophilic Bacillus species. Journal of Pharmaceutical Sciences and Research, 2: 149-154.