Đề tài Điều chế kháng huyết thanh thỏ kháng liên cầu gây bệnh trên cá rô phi

y, nhieät ñoä thích hôïp ñeå beänh phaùt trieån khoaûng 300C . Tuy nhieân beänh cuõng xuaát hieän khi nhieät ñoä nöôùc thaáp hôn vaø dao ñoäng bình thöôøng. Phoøng trò: caûi tieán chaát löôïng nöôùc trong moâi tröôøng nuoâi. Giaûm thaáp maät ñoä nuoâi. Duøng vaccine phoøng beänh, coù theå duøng khaùng sinh ñeå ñieàu trò nhö trong beänh nhieãm khuaån huyeát do Aeromonas. 2.6.5 Nhieãm Staphylococcus Taùc nhaân gaây beänh: Staphylococcus epidermidis. Ñaây laø tuï caàu khuaån Gram döông. Ñoái töôïng nhieãm beänh: chæ gaây beänh treân caù roâ phi, khoâng gaây beänh treân caùc loaøi caù nuoâi gheùp vôùi caù roâ phi (Huang vaø ctv., 1998). 9 Daáu hieäu beänh lyù: ña soá caù beänh khoâng coù daáu hieäu beänh lyù beân ngoaøi roõ raøng, vaøi tröôøng hôïp thaáy maét loài, nhöõng thöông toån ôû da vaø vaây, buïng caêng chöùa nhieàu dòch, caù saép cheát lôø ñôø vaø bôi loäi quay voøng treân maët nöôùc hoaëc ñaùy ao, laù laùch söng to, thaän tröôùc vaø laù laùch xuaát hieän nhöõng khoái u traéng hay vaøng. Ngoaøi ra caù nhieãm naëng coøn thaáy nhöõng veát thöông hình troøn ôû gan, thaän giöõa, tuyeán sinh duïc, daï daøy vaø ruoät. Khoâng coù thöông toån ôû tim vaø naõo. Nhieàu tröôøng hôïp thaáy coù khoái u ôû mang. Phoøng trò: qua kieåm tra khaùng sinh ñoà cho thaáy S. epidermidis nhaïy caûm vôùi Ampicilline (10 mg), Erythromycine (15 mg), Gentamycine (10 mg), Kanamycine (30 mg), Lincomycine (2 mg), Oxaccillin (1 mg), Oxytetracyline (30 mg), Penecilline G (10 UI), Streptomycine (10 mg) vaø ñeà khaùng vôùi sulfadiazine (300 mg), (Huang vaø ctv.,1998), Sulfonamide, Clortetracycline (Vuõ Thò Taùm vaø ctv., 1993). 2.6.6 Moät soá beänh do kyù sinh truøng 2.6.6.1 Beänh truøng baùnh xe Taùc nhaân gaây beänh: moät soá loaøi trong hoï truøng baùnh xe nhö: Trichodina centrostrigata, T. domerguei, T. heterodentata, T. nigra, T. orientalis, Trichodinella epizootica, Tripartiella bulbosa, T. clavodonta. Daáu hieäu beänh lyù: khi môùi maéc beänh, treân thaân, vaây caù coù nhieàu nhôùt maøu hôi traéng ñuïc, ôû döôùi nöôùc thaáy roõ hôn so vôùi khi baét caù leân caïn. Da caù chuyeån maøu xaùm, caù caûm thaáy ngöùa ngaùy, thöôøng noåi töøng ñaøn leân maët nöôùc. Moät soá con taùch ñaøn bôi quanh bôø ao. Khi beänh naëng truøng baùm daøy ñaëc ôû vaây, mang, phaù huûy caùc tô mang khieán caù bò ngaït thôû, nhöõng con beänh naëng mang ñaày nhôùt vaø baïc traéng. Caù bôi loäi maát phöông höôùng. Cuoái cuøng caù laät buïng maáy voøng, chìm xuoáng ñaùy ao vaø cheát. Phaân boá lan truyeàn beänh: truøng baùnh xe gaây beänh chuû yeáu ôû giai ñoaïn caù gioáng, laø beänh kyù sinh ñôn baøo nguy hieåm nhaát cuûa giai ñoaïn naøy. Truøng baùnh xe ít gaây beänh ôû giai ñoaïn caù thòt. Khi öông caù trong nhaø, beänh gaây aûnh höôûng nghieâm troïng tyû leä cheát cao (70 – 100%). Beänh thöôøng phaùt vaøo muøa xuaân, muøa thu, khi nhieät ñoä nöôùc 25 – 30oC. 2.6.6.2 Beänh truøng quaû döa Taùc nhaân gaây beänh: truøng quaû döa Ichthyophthyrius multifiliis. Daáu hieäu beänh lyù: da, mang, vaây cuûa caù beänh coù nhieàu truøng baùm thaønh caùc haït laám taám raát nhoû, maøu hôi traéng ñuïc (ñoám traéng), coù theå thaáy roõ baèng maét thöôøng (ngöôøi nuoâi caù coøn goïi laø beänh vaåy nhôùt). Da, mang caù coù nhieàu nhôùt, maøu saéc nhôït nhaït. 10 Caù beänh noåi ñaàu treân taàng maët, bôi lôø ñôø yeáu ôùt. Luùc ñaàu caù taäp trung gaàn bôø, nôi coù coû raùc, quaãy nhieàu do ngöùa ngaùy. Truøng baùm nhieàu ôû mang, phaù hoaïi bieåu moâ mang laøm caù ngaït thôû. Khi caù yeáu quaù chæ coøn ngoi ñaàu leân ñeå thôû, ñuoâi baát ñoäng caém xuoáng nöôùc. Phaân boá lan truyeàn beänh: beänh gaëp ôû nhieàu loaøi caù nuoâi. Caù roâ phi löu qua ñoâng ôû mieàn Baéc hoaëc nuoâi trong nhaø, thöôøng bò beänh truøng quaû döa laøm caù cheát haøng loaït. Beänh phaùt vaøo muøa xuaân, muøa ñoâng. 2.6.6.3 Beänh saùn laù ñôn chuû Taùc nhaân gaây beänh: saùn laù ñôn chuû Cichlidogyrus tilapiae, C. sclerosus, Gyrodactylus niloticus. Daáu hieäu beänh lyù: Cichlidogyrus, Gyrodactylus kyù sinh treân da vaø mang caù, laøm cho mang vaø da caù tieát ra nhieàu dòch nhôøn aûnh höôûng ñeán hoâ haáp caù. Toå chöùc da vaø mang coù saùn kyù sinh bò vieâm loeùt taïo ñieàu kieän cho vi khuaån, naám vaø moät soá sinh vaät xaâm nhaäp gaây beänh. Phaân boá lan truyeàn beänh: caù coù theå bò beänh khi öông gioáng vôùi maät ñoä daøy vaø coù theå gaây cheát haøng loaït trong giai ñoaïn beå öông. Beänh phaùt vaøo muøa xuaân, muøa thu, muøa ñoâng. 2.6.6.4 Beänh raän caù Taùc nhaân gaây beänh: raän caù Caligus sp. Daáu hieäu beänh lyù: raän caù thöôøng kyù sinh ôû vaây, mang caù roâ phi, laøm cho da caù bò vieâm loeùt taïo ñieàu kieän cho vi khuaån, naám, kyù sinh truøng khaùc xaâm nhaäp, vì vaäy noù thöôøng cuøng löu haønh vôùi beänh ñoám traéng, beänh ñoám ñoû, lôû loeùt neân daãn ñeán caù cheát haøng loaït. Caù bò Caligus kyù sinh coù caûm giaùc ngöùa ngaùy, vaän ñoäng maïnh treân maët nöôùc, bôi loäi cuoàng daïi, cöôøng ñoä baét moài giaûm. Phaân boá lan truyeàn beänh: raän caù kyù sinh ôû nhieàu loaøi caù nuoâi. Caù roâ phi nuoâi maät ñoä daøy, raän caù kyù sinh ñaõ gaây cheát haøng loaït ôû caùc ñaàm nöôùc lôï hoaëc nöôùc ngoït. 2.7 Phöông Phaùp Phoøng Beänh Chung Phoøng trò beänh caù laø moät vaán ñeà raát quan troïng, nhieàu ñòa phöông vaø hoä gia ñình nuoâi caù caàn nhaän roõ vai troø cuûa coâng vieäc naøy. Phaùt hieän ñöôïc beänh caù ñaõ khoù, chöõa beänh cho caù laïi caøng khoù hôn. Vì caù soáng trong moâi tröôøng nöôùc khoâng theå tieâm cho haøng ngaøn, haøng vaïn con caù hoaëc raát 11 khoù caáp thuoác qua thöùc aên vôùi ñuû lieàu ñieàu trò. Nhöng vôùi lieàu löôïng bao nhieâu thì coù taùc duïng khoûi beänh maø khoâng laøm cho caù bò ngoä ñoäc thuoác cuõng laø vaán ñeà khoâng deã. Vì vaäy vieäc phoøng beänh cho caù heát söùc quan troïng. Neáu khi caù ñaõ maéc beänh phaûi phaùt hieän kòp thôøi vaø chuaån ñoaùn ñuùng beänh thì vieäc ñieàu trò môùi coù hieäu quaû. Phoøng beänh cho caù Beänh caù thöôøng phaùt sinh do nhöõng nguyeân nhaân sau: − Do moâi tröôøng nöôùc, thöùc aên vaø ñieàu kieän nhieät ñoä khoâng thích hôïp cho ñôøi soáng cuûa caù. − Do vieäc nuoâi döôõng chaêm soùc khoâng toát ñeå caù gaày yeáu, söùc ñeà khaùng vôùi beänh taät keùm. − Do thaân theå caù bò xaây xaùc, vi khuaån coù ñieàu kieän xaâm nhaäp vaøo veát thöông. − Khi thôøi tieát thay ñoåi ñoät ngoät, oi böùc roài chuyeån sang möa gioâng laøm moâi tröôøng nöôùc thay ñoåi, thieáu oxy vaø xuaát hieän nhieàu khí ñoäc laøm caù noåi ñaàu cheát haøng loaït. − Ñoái vôùi caù nuoâi beø vôùi maät ñoä daøy ñaëc khi coù moät vaøi con beänh seõ laây lan nhanh choùng laøm caù cheát haøng loaït. Naém ñöôïc nhöõng nguyeân nhaân neâu treân, ta caàn thöïc hieän moät soá bieän phaùp phoøng beänh sau ñaây: - Caûi taïo vaø xöû lyù ao, beø thaät kyõ tröôùc khi nuoâi. - Taïo mieãn dòch cho caù baèng vaccine. - Loaïi nhöõng con caù gioáng ñaõ bò xaây xaùc yeáu söùc tröôùc khi thaû. - Tröôùc khi vaän chuyeån xuaát nhaäp caù töø nôi khaùc caàn phaûi kieåm tra dòch beänh. 2.8 Lieân Caàu Khuaån Streptococcus Iniae Gaây Beänh Treân Caù Roâ Phi 2.8.1 Ñaëc ñieåm hình thaùi, sinh lyù, sinh hoùa S. iniae coù daïng hình caàu, coù theå ñöùng rieâng leû, thaønh töøng caëp hay taïo thaønh chuoãi daøi. Vi khuaån baét maøu gram döông. 12 Vi khuaån phaùt trieån toát treân caùc moâi tröôøng thaïch Tryptic Soy, Brain Heart Infulsion, Muller – Hinton agar vaø thaïch maùu cöøu. Nhieät ñoä nuoâi caáy thích hôïp 25 – 28 0C. Sau 48h nuoâi caáy, vi khuaån taïo thaønh khuaån laïc nhoû maøu traéng ñuïc. Moät soá chuûng khuaån laïc trong suoát coù tính nhaày sau 24h nuoâi caáy. Treân moâi tröôøng thaïch maùu, khuaån laïc taïo voøng dung huyeát beta nhoû, trong suoát, rìa khoâng roõ. Vi khuaån khoâng phaùt trieån ôû ñieàu kieän pH 9,6; NaCl 6,5%; nhieät ñoä 10 0C vaø 45 0C (Nguyen vaø Kanai, 1999). S. iniae thuûy phaân esculin vaø tinh boät, khoâng thuûy phaân gelatin. Vi khuaån leân men ñöôøng glucose, maltose, mannitol, khoâng leân men arabinose, lactose, raffinose vaø xylose. Veà ñaëc ñieåm sinh hoùa khaùc, S. iniae cho phaûn öùng catalase oxydase, VP, indol vaø H2S aâm tính, MR vaø DNase döông tính (Nguyen vaø Kanai, 1999). 2.8.2 Trieäu chöùng vaø beänh tích Thöôøng xaûy ra vôùi tyû leä caù cheát raát cao vaøo caùc thaùng cuoái muøa heø vaø ñaàu muøa thu. Ñaây laø khoaûng thôøi gian nhieät ñoä nöôùc cao nhaát trong naêm. Taïi caùc thôøi ñieåm khaùc trong naêm caù cheát raûi raùc, ngoaïi tröø nhöõng thaùng muøa ñoâng luùc nhieät ñoä nöôùc xuoáng thaáp nhaát ôû caùc nöôùc oân ñôùi khoâng thaáy xuaát hieän beänh. Veà ñoä tuoåi caù thöôøng coù beänh, haàu heát baùo caùo ñeà caäp beänh xaûy ra trong giai ñoaïn nuoâi thöông phaåm. Caù beänh coù trieäu chöùng chung khaù ñieån hình treân nhieàu loaøi. Caù bôi lôø ñôø hay maát ñònh höôùng gaàn maët nöôùc. Beân ngoaøi, caù bò tröôùng buïng do tích tuï dòch vieâm xoang buïng, xuaát huyeát ñieåm, ñoám ñoû ôû vuøng quanh mieäng vaø haäu moân, xuaát huyeát naëng ôû vaây löng vaø ngöïc, xuaát huyeát, vieâm coù muû, loài moät hoaëc caû hai maét. Beân trong gan, laùch, thaän nhaït maøu vaø söng to. 13 2.8.3 Phöông phaùp phoøng trò beänh do lieân caàu khuaån gaây ra Phoøng beänh: Caùc bieän phaùp nhö giaûm maät ñoä nuoâi, traùnh cho aên thöùc aên thöøa, veä sinh beå nuoâi caàn ñöôïc thöïc hieän thöôøng xuyeân. Traùnh ñeán möùc toái ña chuyeån ñaøn, chia ñaøn, phaân côõ caù trong thôøi gian dòch beänh thöôøng xaûy ra. Trò beänh: Khaùng sinh dieät khuaån phoå roäng hay dieät khuaån gram döông vôùi taùc duïng toaøn thaân coù hieäu quaû ñieàu trò toát, Erythromycin vaø moät soá khaùng sinh khaùc nhö doxycyline, kitasamycin, ankil – trimethil – ammonium – calcium – oxytetraciline, josamycin, oleandomycin vaø lincomycin cuõng thöôøng ñöôïc söû duïng trò beänh do lieân caàu khuaån ôû Nhaät Baûn (Kitao vaø Aoki, 1979). 2.8.4 Nghieân cöùu huyeát thanh hoïc Pier vaø ctv. (1978) ñieàu cheá khaùng huyeát thanh thoû khaùng S. iniae. Khaùng huyeát thanh thoû naøy khoâng cho phaûn öùng ngöng keát vôùi baát kyø loaøi vi khuaån thuoäc gioáng Streptococcus naøo khaùc. Theo kinh nghieäm chung cuûa taùc giaû baøi vieát, caùc chuûng S. iniae phaân laäp taïi Nhaät Baûn coù hai daïng khuaån laïc khaùc nhau sau 24h uû treân caùc moâi tröôøng thaïch thích hôïp. Moät loaïi khuaån laïc coù tính nhaày, trong vaø moät daïng khoâng nhaày, ñuïc. Khuaån laïc nhaày coù theå chuyeån thaønh khuaån laïc khoâng nhaày khi keùo daøi thôøi gian uû nhöng khoâng xaûy ra tröôøng hôïp ngöôïc laïi. Khaùng huyeát thanh thoû ñieàu cheá töø teá baøo vi khuaån cuûa chuûng khuaån laïc nhaày seõ cho phaûn öùng ngöng keát vôùi caû hai khuaån laïc nhaày vaø khoâng nhaày. Khaùng huyeát thanh thoû ñieàu cheá töø teá baøo vi khuaån cuûa chuûng khuaån laïc khoâng nhaày seõ chæ cho phaûn öùng ngöng keát vôùi daïng khuaån laïc ñoù. Vi khuaån taïo khuaån laïc nhaày coù ñoäc löïc maïnh hôn vi khuaån taïo khuaån laïc khoâng nhaày. 2.9 Cô Cheá Hình Thaønh Khaùng Huyeát Thanh 2.9.1 Caùc ñònh nghóa Chaát sinh mieãn dòch laø chaát khi ñöa vaøo cô theå ñoäng vaät ôû ñieàu kieän thích hôïp coù khaû naêng gaây ñaùp öùng mieãn dòch. Khaùng nguyeân laø chaát coù khaû naêng lieân keát vôùi khaùng theå. Taát caû caùc chaát sinh mieãn dòch ñeàu laø khaùng nguyeân. 14 Khaùng theå laø caùc globulin coù trong huyeát thanh cuûa ñoäng vaät coù khaû naêng lieân keát ñaëc hieäu vôùi khaùng nguyeân ñaõ kích thiùch sinh ra noù. Khaùng theå theo ñònh nghóa treân ñaây ñöôïc goïi laø khaùng theå mieãn dòch hay khaùng theå ñaëc hieäu. Khaùng theå chuû yeáu ñöôïc tìm thaáy trong huyeát thanh cuûa ñoäng vaät, do vaäy huyeát thanh chöùa khaùng theå khaùng khaùng nguyeân ñöôïc goïi laø khaùng huyeát thanh. 2.9.2 Lieàu löôïng vaø ñöôøng vaøo cuûa khaùng nguyeân Lieàu löôïng vaø caùch ñöa khaùng nguyeân vaøo cô theå aûnh höôûng lôùn ñeán khaû naêng sinh khaùng theå. Khi ñöa lieàu quaù ít seõ khoâng ñuû kích thích ñaùp öùng mieãn dòch, coøn quaù nhieàu coù theå daãn ñeán traïng thaùi teâ lieät mieãn dòch. ÔÛ tình traïng traøn ngaäp khaùng nguyeân seõ khoâng ñaùp öùng mieãn dòch. Khi ñöa löôïng nhoû khaùng nguyeân vaøo cô theå seõ kích thích maïnh teá baøo T, taïo trí nhôù mieãn dòch vaø daãn ñeán ñaùp öùng mieãn dòch. Nhöng neáu tieâm nhaéc laïi thì ñaùp öùng mieãn dòch dòch theå seõ taêng leân, taïo khaû naêng mieãn dòch cao vaø beàn vöõng. Ñoù laø nguyeân lyù tieâm vacxin. Trong töï nhieân khaùng nguyeân coù theå vaøo cô theå qua nhieàu con ñöôøng khaùc nhau nhö qua nieâm maïc ñöôøng hoâ haáp, sinh duïc, qua da (do coân truøng ñoát hoaëc do xaây xaùc). Ngöôøi ta coù theå chuû ñoäng tieâm khaùng nguyeân vaøo trong da, döôùi da, trong baép thòt hay tónh maïch, giuùp khaùng nguyeân nhanh choùng tieáp caän vôùi heä thoáng mieãn dòch. 2.9.3 Tính ñaëc hieäu cuûa khaùng nguyeân Söï lieân keát cuûa khaùng nguyeân vaø khaùng theå hay giöõa khaùng nguyeân vaø teá baøo lympho luoân mang tính ñaëc hieäu cao. Khoâng phaûi toaøn boä khaùng nguyeân tham gia vaøo kích thích heä thoáng mieãn dòch maø chæ coù moät phaàn nhaát ñònh cuûa khaùng nguyeân goïi laø quyeát ñònh khaùng nguyeân hay epitop môùi lieân keát vôùi khaùng theå hoaëc teá baøo lympho. Phaàn töông öùng vôùi quyeát ñònh khaùng nguyeân naèm treân moãi khaùng theå goïi laø vò trí keát hôïp khaùng nguyeân hay paratop, coøn phaàn töông öùng vôùi teá baøo lympho laø thuï theå, thuï theå cuûa teá baøo T (TCR). Moãi epitop chæ gaén ñaëc hieäu vôùi moät paratop hoaëc TCR vaø chæ sinh ra moät doøng khaùng theå ñaëc hieäu. 2.9.4 Caùc loaïi khaùng nguyeân Khaùng nguyeân trong töï nhieân raát ña daïng, tuyø theo quan ñieåm vaø möùc ñoä quan taâm maø coù söï phaân loaïi khaùc nhau. Moät vaøi loaïi khaùng nguyeân ñieån hình: Khaùng nguyeân vi khuaån: thaønh phaàn khaùng nguyeân cuûa vi khuaån raát phöùc taïp, coù theå coi teá baøo vi khuaån nhö laø moät tuùi chöùa khaùng nguyeân. Coù hai loaïi: khaùng nguyeân hoøa tan – laø caùc enzym ngoaïi baøo, ngoaïi ñoäc toá tieát ra beân ngoaøi vaø loaïi khaùng nguyeân khoâng hoøa tan – laø thaønh phaàn cuûa teá baøo. 15 Khaùng ngyeân virut: coù hai nhoùm chính ñoù laø khaùng nguyeân V – laø moät phaàn hoaëc toaøn boä haït virut nguyeân veïn coù khaû naêng kích thích sinh khaùng theå trung hoøa virut vaø khaùng nguyeân S laø khaùng nguyeân hoøa tan. Khaùng nguyeân S caáu truùc khueách taùn töø haït virut, coù theå laø glycoprotein voû ngoaøi hoaëc acid nucleic. Khaùng nguyeân S khoâng caáu truùc taùch töø teá baøo chuû ñaõ bò nhieãm virut. Khaùng nguyeân protein: laø khaùng nguyeân maïnh nhaát vì coù troïng löôïng phaân töû lôùn vaø coù caáu truùc ña daïng do caùc acid amin saép xeáp thay ñoåi theo caùc toå hôïp khaùc nhau. Tính ñaëc hieäu phuï thuoäc raát nhieàu vaøo trình töï acid amin cuõng coù theå taïo neân moät doøng khaùng theå khaùc. Khi duøng enzym phaù vôõ caùc caáu truùc laäp theå (baäc 2, 3, 4) cuûa protein seõ laøm thay ñoåi tính khaùng nguyeân. Caùc polypeptic coù troïng löôïng phaân töû thaáp, coù tính khaùng nguyeân yeáu do caáu truùc ñôn ñieäu. Khaùng nguyeân polysaccarite: ña soá polysaccarite laø khaùng nguyeân yeáu vì caáu truùc laëp ñi laëp laïi, thieáu söï ña daïng veà maët hoùa hoïc vaø khi vaøo cô theå chuùng bò phaân giaûi. Khaùng nguyeân polysaccarite ñieån hình laø khaùng nguyeân nhoùm maùu A, B. Tuy nhieân thoâng thöôøng trong cô theå polysaccarite thöôøng tham gia vaøo caùc thaønh phaàn phöùc taïp hôn nhö glycoprotein maøng vi khuaån, voû capxit cuûa vi khuaån, … Khaùng nguyeân lipit: baûn thaân lipit khoâng phaûi laø chaát sinh mieãn dòch, nhöng khi gaén vôùi protein ( lipoprotein) thì trôû thaønh khaùng nguyeân. Khaùng nguyeân acid nucleic: acid nucleic (ADN, ARN) laø khaùng nguyeân yeáu, nhöng khi gaén vôùi proteâin (nucleoprotein) hoaït tính sinh mieãn dòch seõ taêng leân. 2.9.5 Caùc teá baøo tham gia vaøo ñaùp öùng mieãn dòch Teá baøo B (Bone): tieàn thaân cuûa teá baøo Plasma ( töông baøo) saûn xuaát khaùng theå. Teá baøo T ( Thymus): quaàn theå teá baøo lympho bieät hoùa trong tuyeán öùc. Teá baøo T hoã trôï: teá baøo T hoã trôï teá baøo B bieät hoùa thaønh teá baøo plasma saûn xuaát khaùng theå. Interluekin (IL 1 – IL 10): do baïch caàu tieát ra coù taùc duïng kích thích hoaït hoùa vaø bieät hoùa teá baøo lympho. Trí nhôù mieãn dòch: sau khi tieáp xuùc vôùi khaùng nguyeân laàn 1 moät soá teá baøo B vaø T coù khaû naêng löu tröõ thoâng tin ñeå khi gaëp laïi KN coù khaû naêng saûn xuaát KT. Bieät hoùa teá baøo B: söï bieán ñoåi teá baøo nguoàn thaønh teá baøo B taêng tröôûng trong tuûy xöông, giai ñoaïn khoâng caàn kích thích cuûa khaùng nguyeân sau ñoù bieán ñoåi thaønh teá baøo plasma (caàn söï kích thích cuûa khaùng nguyeân). 16 Epitop: phaàn khaùng mang teân quyeát ñònh khaùng nguyeân ñöôïc nhaän bôûi Paratop cuûa KT hoaëc TCR cuûa teá baøo T. Paratop: vò trí keát hôïp cuûa KT (nôi gaén vôùi quyeát ñònh KN). Thuï theå ñaëc hieäu teá baøo T (TCR: T – cell receptor) laø protein maøng caém saâu vaøo maøng sinh chaát giuùp teá baøo T nhaän dieän ñöôïc khaùng nguyeân. Phaân töû phöùc hôïp phuø hôïp toå chöùc chính (MHC: Major Histocompatibility Complex) hoaït ñoäng nhö ñieåm trung chuyeån giuùp teá baøo T phaân bieät khaùng nguyeân laï hay quen. 2.9.5.1 Teá baøo lympho Teá baøo lympho phaân taùn khaép cô theå trong tuaàn hoaøn maùu vaø baïch huyeát. Coù hai loaïi teá baøo lympho: lympho B (goïi taét laø teá baøo B) vaø lympho T ( goïi taét laø teá baøo T). Tuy caû hai ñeàu coù nguoàn goác chung laø teá baøo nguoàn trong tuûy xöông nhöng teá baøo T ñöôïc bieät hoùa vaø tröôûng thaønh trong tuyeán öùc ( Thymus, neân kyù hieäu laø T) coøn teá baøo B bieät hoùa vaø tröôûng thaønh trong tuûy xöông (Bone marrow neân kyù hieâïu laø B). Baûng 2.1 Tyû leä phaân boá cuûa caùc teá baøo lympho T vaø B Cô quan Teá baøo T Teá baøo B Tuûy xöông Moät soá Nhieàu Tuyeán öùc Nhieàu Raát hieám OÁng ngöïc 85% 15% Haïch lympho 80% 20% Laùch 65% 36% 2.9.5.2 Ñaïi thöïc baøo Ñaïi thöïc baøo laø teá baøo coù kích thöôùc lôùn coù khaû naêng baét giöõ, xöû lyù khaùng nguyeân cuõng nhö hôïp taùc vôùi caùc teá baøo lympho ñeå saûn xuaát khaùng theå ñaëc hieäu. Khi khaùng nguyeân xaâm nhaäp vaøo bieåu moâ seõ tieáp xuùc vôùi thöïc baøo, chaün haïn ñaïi thöïc baøo. Teá baøo naøy seõ baét giöõ, nuoát caùc teá baøo coù kích thöôùc lôùn nhö vi khuaån vaø tieát enzym phaân huûy nhö proteinaza, lipaza vaø lyzosym ñeå tieâu hoùa chuùng, laøm boäc loä quyeát ñònh khaùng nguyeân naèm trong ñaïi thöïc baøo. Khaùng nguyeân sau khi xöû lyù seõ ñöôïc ñaïi thöïc baøo duøng ñeå baét ñaàu giai ñoaïn sôùm cuûa quaù trình toång hôïp khaùng theå. ÔÛ ñaây ñaïi thöïc baøo ñoùng vai troø teá baøo trình dieän khaùng nguyeân, goïi taét laø APC (Antigen presenting cell). Coù nghóa laø chuùng seõ ñaåy khaùng nguyeân laï ra beà maët, taïo ñieàu kieän cho khaùng nguyeân tieáp caän teá baøo T. 17 2.9.6 Taù chaát 2.9.6.1 Nguyeân lyù taùc duïng cuûa taù chaát Taù chaát laø chaát phuï gia khi troän vôùi khaùng nguyeân seõ taêng cöôøng ñaùp öùng mieãn dòch vôùi khaùng nguyeân ñoù. Khi gaén vôùi taù chaát, khaùng nguyeân bò phaân giaûi chaäm hôn, phoùng thích daàn daàn trong cô theå töông töï nhö khi tieâm khaùng nguyeân lieàu nhoû nhieàu laàn. Taù chaát taêng cöôøng ñaùp öùng mieãn dòch baèng caùch kích thích ñaïi thöïc baøo laøm nhieäm vuï thöïc baøo hoaëc kích thích teá baøo T vaø B. Taù chaát laø nhöõng chaát trô khoù phaân giaûi nhö daàu, paraphin, hydroxyt nhoâm, … Cô cheá taùc ñoäng cuûa taù chaát duøng trong vacxin ñöôïc giaûi thích nhö sau: Taù chaát coù taùc duïng gaây vieâm, kích thích quaù trình thöïc baøo giuùp quaù trình ñaùp öùng mieãn dòch xaûy ra maïnh hôn. Taù chaát haáp thu khaùng nguyeân vaø thaûi khaùng nguyeân ra töø töø ôû choã tieâm. Taù chaát coøn coù taùc duïng leân teá baøo lympho T hoã trôï. 2.9.6.2 Caùc loaïi taù chaát thoâng duïng a. Nhoùm muoái nhoâm Nhoâm hydroxit Al(OH)3 – keo pheøn Nhoâm phosphat AlPO4 Nhoâm kali sulphat AlK(SO4)2.12H2O – pheøn chua Trong nhoùm muoái nhoâm thì dung dòch pheøn chua vaø keo pheøn thöôøng ñöôïc duøng nhaát trong saûn xuaát vacxin. Dung dòch pheøn chua duøng laøm chaát boå trôï ñöôïc ñieàu cheá khaù ñôn giaûn, ñöôïc pha thaønh dung dòch, haáp tieät truøng vaø cho vaøo canh truøng ñaõ dieät baèng formol. Dung dòch keo pheøn duøng laøm chaát boå trôï ñöôïc ñieàu cheá phöùc taïp hôn. b. Nhoùm nhuõ daàu ÔÛ daïng nhuõ nöôùc trong daàu thì khaùng nguyeân naèm trong haït nöôùc trong dung dòch daàu seõ coù hieäu löïc toát hôn khi khaùng nguyeân naèm töï do trong nöôùc ôû daïng nhuõ 18 daàu trong nöôùc. Caùc haït nhuõ cuõng di chuyeån töø choã tieâm vaøo haïch lympho vaø ñoâi khi coøn xa hôn. Montanide laø dung dòch nhuõ töông, ñöôïc saûn xuaát döôùi nhieàu daïng ñeå phuø hôïp laøm chaát boå trôï cho caùc loaïi vaccine: daïng nhuõ töông nöôùc trong daàu (water in oil), daïng nhuõ töông daàu trong nöôùc (oil in water) hoaëc daïng nöôùc trong daàu trong nöôùc (water in oil in water). Veà nguoàn goác Montanide coù theå laø daàu khoaùng (mineral oil), daàu khoâng khoaùng (nonmineral oil) hoaëc troän laãn. Daïng nhuõ töông Montanide nöôùc trong daàu laø chaát boå trôï cho hieäu quaû cao, coù taùc duïng keùo daøi mieãn dòch. Daïng naøy laø nhuõ töông coù tính oån ñònh cao vaø ñoä nhôùt thaáp. Söû duïng daïng nhuõ töông nöôùc trong daàu coøn cho pheùp giaûm lieàu vaccine hoaëc giaûm noàng ñoä khaùng nguyeân trong moät lieàu vaccine. Daïng nhuõ töông Montanide daàu trong nöôùc raát deã thay ñoåi, daïng naøy duøng laøm chaát boå trôï cho vaccine coù ñaùp öùng mieãn dòch ngaén. 2.9.7 Cô cheá hình thaønh khaùng theå Khaùng nguyeân ñöôïc ñöa tôùi moïi nôi trong cô theå nhôø heä maùu vaø heä baïch huyeát. Khaùng theå ñöôïc taïo thaønh ôû caû laùch vaø haïch lympho nhöng khoâng ñöôïc taïo thaønh ôû gan. Neáu ta tieâm khaùng nguyeân vaøo tónh maïch thì laùch laø nôi taïo nhieàu khaùng theå nhaát, ngöôïc laïi neáu ta tieâm döôùi da, trong da hay maøng buïng thì khaùng theå seõ ñöôïc taïo thaønh nhieàu trong haïch lympho. Sau khi coù söï xaâm nhaäp ñaàu tieân cuûa khaùng nguyeân laø thôøi kyø tieàm aån, luùc naøy khoâng thaáy baát kyø khaùng theå naøo xuaát hieän trong maùu. Sau ñoù noàng ñoä khaùng theå taêng daàn roài laïi giaûm xuoáng. Phaûn öùng vôùi muoãi tieâm thöù nhaát goïi laø ñaùp öùng khaùng theå nguyeân phaùt. Khi tieâm khaùng nguyeân laàn hai sau vaøi ngaøy hay vaøi tuaàn, noàng ñoä khaùng theå taêng leân nhanh choùng, ñaït ñeán 10 – 100 laàn nhieàu hôn noàng ñoä tieâm laàn thöù nhaát. Söï taêng nhanh choùng noàng ñoä khaùng theå naøy ñöôïc goïi laø ñaùp öùng khaùng theå thöù phaùt. Noàng ñoä khaùng theå giaûm daàn theo thôøi gian, nhöng ôû caùc laàn tieâm sau nöõa noù seõ laëp laïi. 19 Sô ñoà 2.1 Söï bieät hoùa teá baøo B thaønh teá baøo plasma saûn xuaát khaùng theå 2.9.8 Baûn chaát vaø tính chaát cuûa khaùng theå Trong huyeát thanh cuûa ngöôøi vaø ñoäng vaät coù vuù chöùa albumin, α , β , γ - globulin, thì γ - globulin laø khaùng theå. Vì baûn chaát cuûa khaùng theå laø protein, neân caùc taùc nhaân hoùa, lyù nhö nhieät ñoä, axit, kieàm laøm bieán tính protein thì cuõng coù theå phaù huûy khaùng theå. Hoaït tính khaùng theå phuï thuoäc vaøo pH moâi tröôøng vaø nhieàu yeáu toá khaùc. Amon sulfat, natri sulfat, coàn ôû 50C coù theå laøm keát tuûa khaùng theå nhöng khoâng laøm maát tính chaát cuûa chuùng, do ñoù ngöôøi ta lôïi duïng tính chaát naøy ñeå tinh khieát khaùng theå. Hai ñaëc tính sinh hoïc quan troïng cuûa khaùng theå laø khaû naêng phaûn öùng ñaëc hieäu vôùi khaùng nguyeân vaø khaû naêng bieåu hieän nhö moät khaùng nguyeân, töùc laø kích thích sinh khaùng theå choáng laïi chính noù. Khaùng theå choáng laïi khaùng theå laø khaùng khaùng theå. MHC - II Teá baøo TH Khaùng theå Teá baøo plasma Teá baøo B nhôù Teá baøo B Khaùng nguyeân Sinh interleukin 20 2.9.9 Phaûn öùng ngöng keát Khi cho khaùng theå ñaëc hieäu phaûn öùng vôùi khaùng nguyeân hoøa tan ôû ñieàu kieän chuaån seõ xuaát hieän keát tuûa coù theå nhìn thaáy baèng maét thöôøng. Phaûn öùng naøy ñöôïc duøng phoå bieán ñeå phaùt hieän khaùng nguyeân khi ñaõ coù saün khaùng theå ñaëc hieäu hoaëc ñeå phaùt hieän khaùng theå khi ñaõ coù saün khaùng nguyeân hoaø tan ñaëc hieäu. Phaûn öùng keát tuûa bò öùc cheá khi coù quaù thöøa khaùng nguyeân hoaëc khaùng theå. Söï keát tuûa toái öu khi coù noàng ñoä khaùng nguyeân – khaùng theå thích hôïp. ÔÛ phaûn öùng keát tuûa ñoøi hoûi phaûi coù khaùng nguyeân hoøa tan, coøn ôû phaûn öùng ngöng keát laïi caàn caùc khaùng nguyeân höõu hình. Ñoù laø caùc khaùng nguyeân coù kích thöôùc lôùn nhö hoàng caàu vaø teá baøo vi sinh vaät. Phaûn öùng ngöng keát nhaïy hôn phaûn öùng keát tuûa neân ñöôïc duøng ñeå ñònh tính vaø baùn ñònh löôïng khaùng theå trong huyeát thanh. Ñaàu tieân cho khaùng nguyeân höõu hình vaøo daõy oáng nghieäm coù ñoä pha loaõng khaùng theå taêng daàn (oáng 1 – 1/20, oáng 2 – 1/40, oáng 3 – 1/80, …). Hieäu giaù khaùng theå laø ñoä pha loaõng cao nhaát maø vaãn xaûy ra ngöng keát. Chaúng haïn ôû oáng thöù 3 coù ñoä pha loaõng lôùn nhaát maø vaãn quan saùt thaáy ngöng keát thì ta noùi hieäu giaù cuûa khaùng huyeát thanh laø 80. 21 III. VAÄT LIEÄU VAØ PHÖÔNG PHAÙP NGHIEÂN CÖÙU 3.1 Thôøi Gian vaø Ñòa Ñieåm Thöïc Hieän Ñeà Taøi Thôøi gian thöïc hieän ñeà taøi töø thaùng 4/2005 ñeán thaùng 8/2005 Ñòa ñieåm thu maãu: khu vöïc nuoâi caù beø taïi soâng Caùi Taéc, phöôøng Long Phöôùc, Quaän 9. Ñòa ñieåm phaân tích maãu: phoøng thí nghieäm Khoa Thuûy Saûn Tröôøng Ñaïi Hoïc Noâng Laâm Thaønh Phoá Hoà Chí Minh 3.2 Vaät Lieäu Vaø Trang Thieát Bò Duøng trong Nghieân Cöùu 3.2.1 Duïng cuï nghieân cöùu OÁng nghieäm, ñóa pechi, que caáy, ñeøn coàn, keùo, hoäp ñöïng boâng, bình tam giaùc, pippet, lam, lamella, … 3.2.2 Trang thieát bò maùy moùc Goàm: Tuû laïnh, tuû caáy vi sinh, tuû khöû truøng duïng cuï, kính hieån vi ñoä phoùng ñaïi 100 laàn, maùy chuïp aûnh, maùy ly taâm 6000 voøng/phuùt, maùy laéc, noài haáp aùp löïc. 3.2.3 Moâi tröôøng nuoâi caáy vaø baûo quaûn gioáng vi khuaån Moâi tröôøng thaïch: Nutrient Agar (NA), Muller Hinton Agar (MHA). Moâi tröôøng canh: Nutrient Broth (NB) Moâi tröôøng giöõ gioáng vi khuaån goàm Nutrient Broth (NB) vaø glycerol. 22 3.3 Phöông Phaùp nghieân Cöùu 3.3.1 Phöông phaùp thu maãu caù beänh vaø vaän chuyeån beänh phaåm Duïng cuï: tuùi nylon. Nguyeân taéc thu maãu caù beänh: Nhaèm ñaûm baûo tính chính xaùc cuûa coâng taùc phaân tích maãu caù beänh phuïc vuï cho vieäc chuaån ñoaùn beänh sau naøy chuùng ta caàn phaûi tuaân thuû nghieâm ngaët nguyeân taéc thu maãu beänh phaåm. Phaûi kieåm tra ngay khi vôùt caù ra khoûi maët nöôùc, caùc bieåu hieän beänh lyù beân ngoaøi. Thu maãu caù soáng vaän chuyeån ngay veà phoøng thí nghieäm trong thôøi gian ngaén nhaát. Nuoâi caáy taêng sinh Maãu caù beänh Phaân laäp vi khuaån Nuoâi caáy thuaàn chuûng Taïo FKC Taïo khaùng theå Thöû phaûn öùng ngöng keát vôùi Streptococcus Baûo quaûn Tieâm vaøo thoû Baûo quaûn Keát luaän Moå, khaùm noäi taïng Quan saùt trieäu chöùng 23 Thu maãu caù theo töøng beø (loàng ) hoaëc ao, maãu caù beänh phaûi coù nhöõng bieåu hieän beänh lyù ñaëc tröng. 3.3.2 Phöông phaùp chung Tieán haønh phaân laäp vi khuaån coù trong caùc maãu gan, thaän vaø naõo cuûa caù roâ phi ñang bò beänh. Söû duïng chính nhöõng vi khuaån phaân laäp ñöôïc nuoâi caáy taêng sinh sau ñoù tieâm vaøo thoû khoûe maïnh. Sau moät thôøi gian trích laáy huyeát thanh thoû kieåm tra xem coù khaùng theå khaùng lieân caàu khuaån hay khoâng. 3.3.2.1 Phöông phaùp kieåm tra daáu hieäu beân ngoaøi vaø khaùm moå beänh tích Quan saùt caùch caù bôi, maét, vaây, vaây, da, buïng vaø mang cuûa caù beänh, nhaän ñònh söï khaùc bieät so vôùi caù bình thöôøng. Kieåm tra caùc cô quan beân trong. Caù ñöôïc moå baèng ba ñöôøng caét: Ñöôøng thöù nhaát: baét ñaàu töø tröôùc haäu moân cho ñeán phaàn ñaàu, döøng tröôùc naép mang. Ñöôøng thöù hai: baét ñaàu töø tröôùc haäu moân chaïy leân phía treân theo naép mang phuùc maïc veà phía ñaàu ñeán phaàn hôû cuûa mang caù. Ñöôøng thöù ba: noái hai ñöôøng caét 1 vaø 2. Hình 3.1 Caùch moå xoang buïng caù 3 1 2 24 Sau khi caét boû phaàn cô thòt, caùc cô quan noäi taïng loä ra ngoaøi quan saùt dòch xoang buïng, chaát dòch nhieàu hay ít, ñoä trong, ñuïc. Gan: kieåm tra maøu saéc, beà maët, rìa cuûa gan, caét moät maãu nhoû ñaët treân phieán kính laøm tieâu baûn töôi, kieåm tra vi khuaån gaây beänh. Thaän: kieåm tra maøu saéc, kích côõ. 3.3.2.2 Phöông phaùp caáy maãu beänh phaåm a. Caáy maãu beänh phaåm töø thaän caù Ñeå traùnh taïp truøng töø ngoaøi da vaø caùc cô quan noäi taïng beân trong thao taùc caáy phaûi heát söùc caån thaän: - Ñaùnh vaåy caù. - Saùt truøng da caù baèng coàn 700 - Moå caù baèng ba ñöôøng caét. - Duøng keïp ñaõ khöû truøng baèng coàn 700 gaït caùc phaàn noäi taïng sang moät beân. Duøng muõi keùo ñaõ khöû truøng raïch leân thaän moät ñöôøng nhoû. Duøng que caáy voøng ñöa vaøo choã raïch. Sau ñoù caáy ria treân moâi tröôøng thaïch N.A. Caùc ñóa thaïch ñöôïc uû ôû nhieät ñoä trong phoøng thí nghieäm. b. Caáy maãu beänh phaåm töø gan caù Duøng muõi keùo ñaõ khöû truøng raïch leân beà maët gan caù moät ñöôøng ngaén khoaûng 0,5 cm, ñöa que caáy voøng vaøo nôi raïch laáy chaát gan. Sau ñoù caáy ria treân moâi tröôøng thaïch N.A. Caùc ñóa thaïch ñöôïc uû ôû nhieät ñoä trong phoøng thí nghieäm. c. Caáy maãu beänh phaåm töø naõo caù Saùt truøng maët ngoaøi cuûa soï naõo baèng coàn 700. Sau ñoù caét boán ñöôøng caét moãi ñöôøng khoaûng 0,5 – 1 cm sao cho loä phaàn naõo ra. Duøng que caáy voøng ñöa vaøo naõo caù. Sau ñoù caáy ria treân moâi tröôøng thaïch N.A. Caùc ñóa thaïch ñöôïc uû ôû nhieät ñoä trong phoøng thí nghieäm. 25 Hình 3.2 Caùch moå naõo caù 3.3.2.3 Kieåm tra vi khuaån gaây beänh vaø laøm thuaàn Sau 24h nuoâi caáy, baûo quaûn ôû nhieät ñoä phoøng vi khuaån ñaõ moïc treân moâi tröôøng ta tieán haønh quan saùt maøu saéc, hình thaùi, maät ñoä, kích côõ cuûa khuaån laïc. Quan saùt hình thaùi cuûa vi khuaån Streptococcus sp. treân kính hieån vi. Nhoû moät gioït nöôùc muoái sinh lyù leân lam kính, duøng que caáy voøng chuyeån moät khuaån laïc vaøo trong nöôùc muoái sinh lyù roài quan saùt döôùi kính hieån vi. Caáy chuyeàn vi khuaån sang ñóa thaïch khaùc. Choïn khuaån laïc ñieån hình, duøng que caáy laáy khuaån laïc ñoù caáy ria treân moâi tröôøng thaïch N.A. Moãi laàn ria hô que caáy treân ñeøn coàn ñeå thu ñöôïc caùc khuaån laïc rieâng reõ. Caùc ñóa thaïch ñöôïc uû ôû nhieät ñoä phoøng thí nghieäm. Sau 24h vi khuaån ñaõ phaùt trieån maïnh, tieán haønh quan saùt moät laàn nöõa, kieåm tra möùc ñoä thuaàn cuûa khuaån laïc treân kính hieån vi töông töï nhö treân. Caáy chuyeån vi khuaån töø moâi tröôøng thaïch sang moâi tröôøng canh NB ñeå nuoâi caáy taêng sinh. Duøng que caáy voøng queùt vaøi khuaån laïc ñieån hình ñaõ ñöôïc kieåm tra möùc ñoä thuaàn chuyeån vaøo moâi tröôøng canh NB ñeå nuoâi taêng sinh. Trong quaù trình nuoâi taêng sinh laéc ñeàu lieân tuïc ñeå vi khuaån taêng sinh maïnh. Nuoâi caáy laéc trong 24h ôû nhieät ñoä phoøng. 26 3.3.2.2 Taïo FKC Sau 24h vi khuaån taêng sinh maïnh, sau ñoù baát hoaït vi khaån baèng Formalin vôùi lieàu löôïng ñöôïc tính baèng coâng thöùc: VFormalin = 0,5% x Vdd Trong ñoù: VFormalin : Theå tích Formalin Vdd : Theå tích dung dòch cuûa moâi tröôøng canh NB Baûo quaûn trong ñieàu kieän 40C khoaûng 24 – 48h Sau khi baát hoaït vi khuaån baèng Formalin, ta tieán haønh thu nhaän vi khuaån baèng caùch ly taâm moâi tröôøng ñaõ nuoâi taêng sinh vi khuaån laáy phaàn coâ ñaëc naèm döôùi ñaùy oáng ly taâm, coù maøu traéng. Thöïc hieän ly taâm 6000 voøng/phuùt trong voøng 15 phuùt. Vi khuaån thu ñöôïc röûa baèng nöôùc muoái sinh lyù 3 laàn. Sau moãi laàn röûa ly taâm laïi ñeå röûa saïch heát formalin. Caân khoái löôïng cuûa vi khuaån thu ñöôïc. Sau khi röûa ta ñem pha vôùi nöôùc muoái sinh lyù vôùi tyû leä 10 mg/ml. Baûo quaûn ôû nhieät ñoä khoaûng 4 – 100C. 3.3.2.5 Taïo khaùng theå baèng caùch tieâm vaøo cô theå thoû Löïa choïn thoû khoûe maïnh, khoâng bò nhieãm beänh, khoâng bò dò hình. Thoû coù troïng löôïng 2 kg. Hình 3.3 Thoû thí nghieäm 27 Pha dung dòch vi khuaån – nöôùc muoái sinh lyù ôû treân vôùi daàu khoaùng vôùi tyû leä 1:1. Laéc ñeàu cho daàu khoaùng hoøa ñeàu vaø saùnh. Tieâm hoãn hôïp dung dòch vi khuaån – nöôùc muoái sinh lyù – daàu khoaùng treân vôùi lieàu löôïng 2 ml/laàn. Phöông phaùp tieâm: Caïo saïch loâng phaàn löng cuûa thoû, saùt truøng baèng coàn 700 tröôùc khi tieâm. Duøng kim tieâm nhoû tieâm döôùi da traùnh khoâng phaïm vaøo phaàn thòt cuûa thoû. Quan saùt tình traïng söùc khoûe cuûa thoû trong suoát quaù trình taïo khaùng theå. Baûng 3.1 Caùc laàn tieâm vaø laáy maùu kieåm tra khaùng theå. Laàn tieâm Ngaøy laáy maùu Dung dòch tieâm Lieàu löôïng (ml) 1 14 FKC + DK 2 2 28 FKC + DK 2 3 35 FKC + DK 2 4 42 FKC + DK 2 FKC (Formalin Killed Cell): huyeàn phuø vi khuaån baát hoaït baèng formalin DK: daàu khoaùng 3.3.2.6 Kieåm tra khaùng theå Kieåm tra xem trong huyeát thanh thoû coù khaùng theå khaùng lieân caàu khuaån hay khoâng. Söû duïng vi khuaån Streptococcus sp. ñöôïc phaân laäp töø caù beänh qua caùc laàn thu maãu vaø caù gaây beänh thöïc nghieäm. Phöông phaùp kieåm tra: laáy maùu thoû cho vaøo oáng nghieäm ñaët nghieâng vaø ñeå yeân töø 1 – 2 h vaø giöõ laïnh khoaûng 1h, sau ñoù ñem ly taâm vôùi toác ñoä 2000 voøng/phuùt trong voøng 15 phuùt. Sau ñoù huùt laáy huyeát thanh laø phaàn trong naèm ôû treân coù maøu vaøng nhaït ta thöïc hieän phaûn öùng ngöng keát vôùi vi khuaån soáng vaø vi khuaån ñaõ ñöôïc baát hoaït baèng Formalin ñeå kieåm tra xem coù khaùng theå khaùng lieân caàu khuaån hay khoâng. a. Thöïc hieän phaûn öùng ngöng keát treân phieán kính 28 Phöông phaùp: nhoû vaøi gioït huyeát thanh – vi khuaån soáng, huyeát thanh – vi khuaån baát hoaït treân phieán kính quan saùt trong voøng 3 phuùt. Ñoái vôùi vi khuaån soáng, duøng que caáy voøng laáy moät ít vi khuaån thuaàn ñang nuoâi treân ñóa thaïch hoøa vaøo vaøi gioït nöôùc muoái sinh lyù ñaõ coù saün treân lamme vaø cuøng hoøa vôùi vaøi gioït huyeát thanh quan saùt trong voøng 3 phuùt. Sau ñoù thu nhaän keát quaû. Ñeå kieåm tra xem hoaït löïc cuûa khaùng theå coù maïnh hay khoâng ta pha loaõng huyeát thanh ra laøm 2, 4, 8 laàn sau ñoù kieåm tra nhö treân. Neáu treân kính coù nhieàu keát tuûa coù maøu traéng ñuïc li ty thì ta thu ñöôïc keát quaû coù khaùng theå khaùng vi khuaån Streptococcus sp. b. Thöïc hieän phaûn öùng treân microplate 96 gieáng 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A O O O O O O O O O O O O B O O O O O O O O O O O O C O O O O O O O O O O O O D O O O O O O O O O O O O E O O O O O O O O O O O O F O O O O O O O O O O O O G O O O O O O O O O O O O H O O O O O O O O O O O O Ñóa microplate 96 gieáng (ñaùy hình chöõ “U”) Phöông phaùp thöïc hieän treân ñóa microplate theo caùc böôùc sau: (1) Theâm 25 μl nöôùc muoái sinh lyù vaøo taát caû caùc gieáng tröø coät thöù nhaát. (2) Cho 25 μl huyeát thanh vaøo caùc gieáng ôû coät 1 vaø 2. Vi khuaån Huyeát thanh Phieán kính 29 (3) Duøng pipette ñeå troän hoãn hôïp trong gieáng thöù 2. Nhö vaäy, ta seõ ñöôïc hoãn hôïp huyeát thanh pha loaõng 2 laàn. (4) Chuyeån 25 μl cuûa gieáng thöù 2 sang gieáng thöù 3 roài troän hoãn hôïp cho ñeàu. Tieáp tuïc nhö theá cho ñeán gieáng thöù 12. Cuoái cuøng, ta ñöôïc moät daõy pha loaõng baäc 2. (5) Theâm 25 μl huyeàn phuø vi khuaån (FKC) vaøo moãi gieáng, roài boïc ñóa laïi baèng moät mieáng phim. Laéc nheï ñóa treân maët phaúng baøn ñeå hoãn hôïp hoøa troän laïi vôùi nhau. Baûo quaûn ñóa ôû nhieät ñoä phoøng trong voøng 24h. Ghi nhaän keát quaû ôû nhöõng gieáng cuoái cuøng coù xuaát hieän keát tuûa, ta keát luaän ñöôïc ôû laàn pha loaõng naøo thì cho phaûn öùng ngöng keát. Gieáng 1 2 3 4 5 6 7 8 Nöôùc muoái sinh lyù (μl) 25 25 25 25 25 25 25 Huyeát thanh (μl) 25 25 Vi khuaån (μl) 25 25 25 25 25 25 25 25 Toång coäng (μl) 50 50 50 50 50 50 50 50 30 IV. KEÁT QUAÛ VAØ THAÛO LUAÄN 4.1 Keát Quaû Thu Maãu Caù Beänh 4.1.1 Bieåu hieän beänh tích Qua caùc ñôït thu maãu chuùng toâi thu nhaän ñöôïc maãu caù beänh coù nhöõng bieåu hieän beänh tích nhö nhau. Caù ñöôïc thu coù troïng löôïng töø 50 – 250 g/con. Caù beänh vôùi caùc daáu hieäu beänh nhö sau: Caù coù bieåu hieän taùch ñaøn, bôi lôø ñôø, boû aên, vaây bò lôû loeùt, ñuïc hoaëc loài maét, buïng tröôùng to. Hình 4.1 Trieäu chöùng caù beänh Tröôùng buïng Ñuïc giaùc maïc 31 Hình 4.2 Trieäu chöùng caù beänh Giaûi phaãu xoang buïng caù thaáy coù chaát dòch maøu vaøng nhaït hoaëc trong; gan, maät, thaän söng to. Hình 4.3 Giaûi phaãu xoang buïng caù baèng 3 ñöôøng caét Loài maét 1 2 3 32 Hình 4.4 Giaûi phaãu naõo caù 4.1.2 Keát quaû phaân laäp vi khuaån Chuùng toâi tieán haønh phaân laäp vi khuaån trong maãu gan, thaän, naõo vaø nuoâi caáy treân moâi tröôøng thaïch NA thu ñöôïc keát quaû nhö sau: Maãu beänh phaåm ñöôïc phaân laäp vaø nuoâi caáy treân moâi tröôøng NA (Nutrient Agar). UÛ ôû nhieät ñoä phoøng thí nghieäm 24 giôø, chuùng toâi xaùc ñònh ñöôïc: ña soá caùc khuaån laïc moïc treân ñóa thaïch NA ñeàu coù hình troøn, rìa ñeàu, boùng, loài thaáp, taâm hôi ñaäm, ñöôøng kính töø 0,5 – 0,7 mm. 33 Hình 4.5 Hình thaùi khuaån laïc vi khuaån streptococcuss sp. treân ñóa petri Sau khi xem xeùt hình daïng, choïn moät vaøi khuaån laïc treân ñóa NA laøm tieâu baûng nhuoäm gram ñeå xem hình thaùi vi khuaån. Quan saùt döôùi kính hieån vi ghi nhaän ñöôïc: vi khuaån baét maøu tím, gram döông, coù daïng hình caàu, coù theå ñöùng rieâng leû, thaønh töøng caëp hay taïo thaønh chuoãi daøi. Hình 4.6 Hình daïng vi khuaån Streptococus sp. 4.2 Keát Quaû Taïo FKC Laáy vi khuaån Streptococcus ñaõ phaân laäp ñöôïc caáy vaøo 800ml moâi tröôøng canh NB (coù maøu vaøng trong). Sau 24 giôø chuùng toâi nhaän thaáy moâi tröôøng canh NB chuyeån 34 sang maøu vaøng ñuïc vaø ñem kieåm tra treân kính hieån vi nhaän thaáy ña soá vi khuaån daïng chuoãi daøi, moät soá caëp ñoâi vaø ñöùng rieâng leû. Sau ñoù baát hoaït vi khuaån baèng formalin 35 – 37%. Theå tích formol caàn pha vaøo 800 ml moâi tröôøng canh NB laø 4 ml. Baûo quaûn ñieàu kieän 5 – 9 0C trong voøng 24h. Hình 4.7 Vi khuaån baát hoaït baèng formalin sau khi ly taâm Sau khi ly taâm moâi tröôøng taêng sinh NB vaø röûa vi khuaån, chuùng toâi thu ñöôïc khoái löôïng vi khuaån Streptococcus baát hoaït baèng formalin laø 238 mg. Pha vi khuaån vôùi nöôùc muoái sinh lyù theo tyû leä 10 mg/ml thu ñöôïc 23,8 ml hoãn hôïp dung dòch vi khuaån vaø nöôùc muoái sinh lyù. 4.3 Keát Quaû Taïo Khaùng Theå Treân Thoû 4.3.1 Laàn tieâm thöù nhaát Sau laàn tieâm ñaàu tieân, thoû khoâng coù bieåu hieän gì khaùc thöôøng rieâng treân löng ôû ngay nhöõng choã tieâm bò söng to. Ñeán ngaøy thöù 14 laáy maùu thoû vaø tieáp tuïc tieâm laàn thöù hai. 35 Sau khi laáy maùu thoû ñaët nghieâng oáng nghieäm ñeå taêng dieän tích maët thoaùng vaø giöõ yeân töø 1 – 2h cho ñeán khi maùu hoaøn toaøn ñoâng ñaëc laïi, sau ñoù ñeâm oáng nghieäm boû vaøo trong tuû laïnh khoaûng 1h. Ñem ly taâm vaø huùt laáy phaàn huyeát thanh coù maøu vaøng nhaït, trong naèm ôû phaàn treân cuûa oáng ly taâm. Thöïc hieän phaûn öùng ngöng keát treân vi khuaån baát hoaït vaø treân vi khuaån soáng chuùng toâi nhaän thaáy: Phaûn öùng ngöng keát khoâng xaûy ra cho keát quaû aâm tính. Keát luaän: ôû laàn tieâm thöù nhaát naøy khoâng coù khaùng theå khaùng vi khuaån Streptoccus sp. 4.3.2 Laàn tieâm thöù 2 14 ngaøy sau khi tieâm vi khuaån baát hoaït laàn thöù hai, tieáp tuïc laáy maùu thoû. Caùc thao taùc laáy huyeát thanh vaãn thöïc hieän nhö treân. Kieåm tra phaûn öùng ngöng keát vôùi huyeát thanh thu ñöôïc, chuùng toâi nhaän thaáy: Treân vi khuaån baát hoaït xuaát hieän nhöõng chaám nhoû ly ty coù maøu traéng ñuïc bieåu hieän roõ treân phieán kính. Tieáp tuïc tieán haønh pha loaõng leân 2 laàn thì thaáy vaãn coù keát tuûa maøu traéng ñuïc ly ty raát khoù nhìn thaáy. Treân vi khuaån soáng vaãn thöïc hieän caùc thao taùc nhö treân chuùng toâi thu ñöôïc keát quaû töông töï nhö ôû vi khuaån baát hoaït. Keát luaän: ÔÛ laàn tieâm thöù 2 coù khaùng theå khaùng vi khuaån streptococcus. Nhöng khi pha loaõng huyeát thanh leân ñeán laàn thöù 2 thì haàu nhö phaûn öùng ngöng keát treân phieán kính khoâng xaûy ra, chöùng toû löôïng khaùng theå khaùng vi khuaån streptococcus coù trong huyeát thanh vaãn coøn thaáp. Vôùi laàn tieâm thöù 2, khaùng theå thu ñöôïc khoâng ñaït keát quaû nhö mong ñôïi neân chuùng toâi ñaõ tieáp tuïc tieâm vi khuaån laàn thöù 3. 4.3.3 Laàn tieâm thöù 3 36 Laàn tieâm naøy chuùng toâi chæ tieâm 1ml FKC khoâng pha daàu khoaùng nhö nhöõng laàn tieâm tröôùc. 7 ngaøy sau khi tieâm vi khuaån laàn thöù 3 laáy huyeát thanh vaø thu ñöôïc keát quaû nhö sau: Kieåm tra khaùng theå treân vi khuaån baát hoaït chuùng toâi nhaän thaáy xuaát hieän raát nhieàu nhöõng chaám nhoû maøu traéng keát tuûa laïi. Tieáp tuïc pha loaõng khaùng theå leân 2 laàn, 4 laàn vaãn nhìn thaáy phaûn öùng ngöng keát xaûy ra. Nhöng ôû laàn thöù 4 khoâng thaáy nhieàu nhö ôû laàn thöù 2. Khi pha loaõng huyeát thanh leân 8 laàn khoâng thaáy phaûn öùng ngöng keát xaûy ra. Keát luaän: ÔÛ laàn tieâm naøy löôïng khaùng theå coù trong huyeát thanh taêng leân raát nhieàu so vôùi caùc laàn tieâm tröôùc coù theå vì lyù do khoâng pha daàu khoaùng trong laàn tieâm naøy. Löôïng khaùng theå taêng leân nhieàu nhöng vaãn chöa cao vì phaûn öùng ngöng keát chæ nhìn thaáy ñöôïc vôùi ñoä pha loaõng 4 laàn. Vì vaäy chuùng toâi tieáp tuïc tieâm vi khuaån vaøo thoû laàn thöù tö. 4.3.4 Laàn tieâm thöù 4 Sau 42 ngaøy chuùng toâi laáy maùu thoû vaø kieåm tra khaùng theå chuùng toâi thu ñöôïc keát quaû döông tính. ÔÛ laàn tieâm naøy khaùng theå cuõng taêng hôn so vôùi nhöõng laàn tröôùc cuï theå laø khi pha loaõng leân 8 laàn maø vaãn coù phaûn öùng ngöng keát xaûy ra ôû caû vi khuaån baát hoaït vaø vi khuaån soáng. Baûng4.1 Keát quaû kieåm tra soá laàn pha loaõng khaùng theå trong caùc ñôït thu maùu. Soá laàn pha loaõng Vi khuaån soáng Vi khuaån baát hoaït Ngaøy thu maùu 0 2 4 8 0 2 4 8 14 - - - - - - - - 28 + - - - + + - - 35 + + + - + + + - 42 + + + + + + + + (-): Keát quaû aâm tính, phaûn öùng ngöng keát khoâng xaûy ra. 37 (+): Keát quaû döông tính, phaûn öùng ngöng keát xaûy ra 4.3.5 Keát quaû phaûn öùng ngöng keát treân micrplate 96 gieáng Hình 4.8 Keát quaû phaûn öùng ngöng keát treân microplate A: Döông tính: vi khuaån baát hoaït phaân taùn ñeàu ôû ñaùy gieáng. B: AÂm tính: vi khuaån baát hoaït laéng tuï taïo thaønh ñoám traéng nhoû ôû ñaùy gieáng. ÑC: Thoû ñoái chöùng. TN: Thoû thí nghieäm. 0, 2, 4, 8: Soá laàn pha loaõng. Sau laàn thu maùu kieåm tra naøy chuùng toâi ñaõ laáy 20 ml maùu thoû sau ñoù ñeå yeân 2h sau ñoù giöõ ôû nhieät ñoä 40C khoaûng 1h vaø ñeâm ly taâm ôû vaän toác 3000 voøng/phuùt khoaûng 20 phuùt. ÑC TN TN A B 0 82 4 38 Hình 4.9 Thu maùu thoû Thu ñöôïc 8 ml huyeát thanh ñaõ kieåm tra coù khaùng theå khaùng lieân caàu khuaån Streptoccus sp. vaø cho phaûn öùng ngöng keát vôùi FKC ôû ñoä pha loaõng 8 laàn. 4.4 Keát Quaû Kieåm Tra Khaùng Theå Thoû Khaùng Lieân Caàu Khuaån Treân Caù Gaây Beänh Thöïc Nghieäm Söû duïng caù gaây beänh thöïc nghieäm ñaõ ñöôïc tieán haønh trong ñeà taøi toát nghieäp cuûa Ñaït vaø Tuyeàn. Caùc roâ phi ñoû ñaõ bò gaây nhieãm baèng vi khuaån soáng Streptococcus sp. Phöông phaùp gaây nhieãm: Tieâm huyeàn phuø vi khuaån Streptococcus soáng vôùi noàng ñoä 1,5 x 105 CFU/ml tieâm 0,1 ml cho caù 50 gam, tieâm vaøo xoang buïng caù. 15 ngaøy sau khi tieâm, moå caù phaân laäp vi khuaån ñeå xaùc ñònh tình traïng caûm nhieãm ñoái vôùi vi khuaån ñaõ gaây nhieãm. Tieán haønh moå 161 con caù ñaõ ñöôïc gaây nhieãm, caáy maãu beänh phaåm töø thaän vaø naõo caù nuoâi caáy treân moâi tröôøng thaïch NA. Sau 24h nuoâi caáy kieåm tra thaáy coù 12 ñóa 39 moïc vi khuaån. Khuaån laïc coù daïng hình troøn, rìa ñeàu, boùng, loài thaáp, ñöôøng kính töø 0,5 – 0,7 mm. Kieåm tra treân kính hieån vi thì thaáy vi khuaån coù daïng hình caàu ñöùng rieâng leû, caëp ñoâi hay lieân keát thaønh chuoãi daøi. Kieåm tra khaùng theå thoû vôùi vi khuaån vöøa phaân laäp ñöôïc treân phieán kính ñeàu cho phaûn öùng ngöng keát. Tieám haønh pha loaõng vi khuaån leân 4 laàn vaãn cho phaûn öùng ngöng keát döông tính. Nhöng khi pha loaõng leân 8 laàn thì chæ coù moät vaøi phieán kính cho phaûn öùng ngöng keát. Keát luaän khaùng theå thoû vaãn cho phaûn öùng ngöng keát treân caù gaây nhieãm thöïc nghieäm vaø cho keát quaû khoâng khaùc bieät so vôùi vi khuaån phaân laäp ñöôïc ôû caùc laàn thu maãu thöïc ñòa. 40 V. KEÁT LUAÄN VAØ ÑEÀ NGHÒ 5.1 Keát Luaän Caù beänh coù bieåu hieän taùch ñaøn, bôi lôø ñôø, boû aên, ñuïc hoaëc loài maét, buïng tröôùng to. Phaân laäp ñöôïc vi khuaån Streptococcus sp. coù daïng hình caàu, coù theå ñöùng rieâng leû, thaønh töøng caëp hay taïo thaønh chuoãi daøi. Sau 42 ngaøy tieâm FKC vôùi lieàu löôïng 10mg/l vaøo thoû thu ñöôïc 8ml huyeát thanh vaø cho phaûn öùng ngöng keát vôùi vi khuaån Streptococcus sp. ôû ñoä pha loaõng 8 laàn. Khaùng huyeát thanh thoû khaùng lieân caàu khuaån (Streptococcus sp) treân caù gaây beänh thöïc nghieäm cho keát quaû ngöng keát töông töï nhö ôû vi khuaån phaân laäp qua caùc laàn thu maãu ngoaøi thöïc ñòa. 5.2 Ñeà Nghò Tieáp tuïc nghieân cöùu ñònh danh vi khuaån ôû möùc ñoä loaøi. Ñieàu cheá khaùng huyeát thanh thoû khaùng caùc loaøi vi khuaån khaùc gaây beänh treân caù roâ phi. 41 TAØI LIEÄU THAM KHAÛO Taøi Lieäu Tieáng Vieät NGOÂ TROÏNG LÖ – THAÙI BAÙ HOÀ, 2002. Kyõ thuaät nuoâi thuûy ñaëc saûn nöôùc ngoït. Nhaø xuaát baûn noâng nghieäp, Haø Noäi. NGUYEÃN DUY KHOAÙT, 2000. Soå tay höôùng daãn nuoâi caù nöôùc ngoït. Nhaø xuaát baûn noâng nghieäp, Haø Noäi. NGUYEÃN HÖÕU THÒNH, 2004. Boä moân Quaûn lyù söùc khoûe Ñoäng vaät Thuûy Saûn, Khoa Thuûy Saûn, Ñaïi Hoïc Noâng Laâm Thaønh Phoá Hoà Chí Minh. TRAÀN TROÏNG CHÔN, 2000. Beänh caù – toâm. Baøi giaûng tröôøng Ñaïi Hoïc Noâng Laâm Thaønh Phoá Hoà Chí Minh. NGUYEÃN TRI CÔ, 2004. Ñieàu tra tình hình nuoâi vaø dòch beänh treân caù roâ phi nuoâi beø ôû ñoàng baèng soâng Cöûu Long vaø caùch phoøng trò. Khoa Thuûy Saûn, Tröôøng Ñaïi Hoïc Noâng Laâm Thaønh Phoá Hoà Chí Minh. DÖÔNG PHÖÔÏNG UYEÂN, 2004. Khaûo saùt kyõ thuaät nuoâi vaø beänh do streptococcus sp. gaây ra treân caù roâ phi nuoâi beø. Khoa Thuûy Saûn, Tröôøng Ñaïi Hoïc Noâng Laâm Thaønh Phoá Hoà Chí Minh. PHAÏM VAÊN TY, 1998. Mieãn dòch hoïc. Nhaø xuaát baûn Ñaïi Hoïc Quoác Gia Haø Noäi. ÑOÃ NGOÏC LIEÂN, 2001. Mieãn dòch hoïc cô sôû. Nhaø xuaát baûn Ñaïi Hoïc Quoác Gia Haø Noäi. VOÕ VAÊN TUAÁN, 2005. Hieän traïng vaø tình hình beänh vi khuaån treân caù roâ phi ñoû nuoâi loàng beø taïi tænh Ñoàng Nai. Khoa Thuûy saûn, Tröôøng Ñaïi hoïc Noâng Laâm Thaønh Phoá Hoà Chí Minh. www.vietinh.com.vn/fish/carophi/carophi.htm 42 Taøi Lieäu Tieáng Anh KITAO AND AOKI, 1979. Therapeutic studies of doxycyline of steptoccosis of cultured yellowtail (Seriola quinqueradiata). Bulletin of the faculty of Agricultere, Miyazaki University, 26, 357–363. PIER, G.B. AND MADIN, S. H. AND AL-NAKEEB S. 1978. Isolation and characterization of a second isolate of Streptococcus iniae. International Journal of Systematic Bacteriology. 28, 311-314. NGUYEN, H.T., KANAI, K.1999. Selective agars for the isolation of Streptococcus iniae from Japenese flounder (Paralichthys olivaceus), and its cultural enviroment. Journal of Applied Microbiology. 86, 769–776. www.elsevier.nl/locate/aqua-online DOWNLOAD» AGRIVIET.COM GIÔÙI THIEÄU VEÀ TAØI LIEÄU Tài liệu bạn đang xem được download từ website WWW.AGRIVIET.COM WWW.MAUTHOIGIAN.ORG »Agriviet.com là website chuyên đề về nông nghiệp nơi liên kết mọi thành viên hoạt động trong lĩnh vực nông nghiệp, chúng tôi thường xuyên tổng hợp tài liệu về tất cả các lĩnh vực có liên quan đến nông nghiệp để chia sẽ cùng tất cả mọi người. Nếu tài liệu bạn cần không tìm thấy trong website xin vui lòng gửi yêu cầu về ban biên tập website để chúng tôi cố gắng bổ sung trong thời gian sớm nhất. »Chúng tôi xin chân thành cám ơn các bạn thành viên đã gửi tài liệu về cho chúng tôi. Thay lời cám ơn đến tác giả bằng cách chia sẽ lại những tài liệu mà bạn đang có cùng mọi người. Bạn có thể trực tiếp gửi tài liệu của bạn lên website hoặc gửi về cho chúng tôi theo địa chỉ email Webmaster@Agriviet.Com Lưu ý: Mọi tài liệu, hình ảnh bạn download từ website đều thuộc bản quyền của tác giả, do đó chúng tôi không chịu trách nhiệm về bất kỳ khía cạnh nào có liên quan đến nội dung của tập tài liệu này. Xin vui lòng ghi rỏ nguồn gốc “Agriviet.Com” nếu bạn phát hành lại thông tin từ website để tránh những rắc rối về sau. Một số tài liệu do thành viên gửi về cho chúng tôi không ghi rỏ nguồn gốc tác giả, một số tài liệu có thể có nội dung không chính xác so với bản tài liệu gốc, vì vậy nếu bạn là tác giả của tập tài liệu này hãy liên hệ ngay với chúng tôi nếu có một trong các yêu cầu sau : • Xóa bỏ tất cả tài liệu của bạn tại website Agriviet.com. • Thêm thông tin về tác giả vào tài liệu • Cập nhật mới nội dung tài liệu www.agriviet.com