Đề tài Các phương pháp chuyển gen

Các phương pháp chuyển genNhóm sv thực hiện:1. Nguyễn Thị Hồng2. Nguyễn Thị Ngát 3. Phạm Thị Huyền4. Phạm Thị Thu Hiền5. Lê Thị YếnKhái niệm chuyển nạp genChuyển nạp gen là quá trình những đoạn ADN ngoại lai, mã hóa một thông tin di truyền nhất định (tính trạng), có thể được tách ra từ thực vật, vi khuẩn hay động vật, được chuyển sang một nền di truyền mới. Nó bao gồm cả việc tạo ra những cây hữu dục bình thường và có biểu hiện gen mới chuyển nạp.Các phương phápchuyển genChuyển gen trựctiếpChuyển gen giántiếpChuyển Gennhờ kỹ thuậtsiêu âmChuyểnGen nhờKỹ thuậtXungđiệnKỹ thuậtchuyểnGennhờSilicon carbideChuyểnGen nhờsúng bắngenChuyểnGen trựctiếp thôngquaống phấnChuyển Gen nhờvsv đấtAgrobacteriumChuyển Gen nhờViruswww.themegallery.com1.1. Phương pháp trực tiếp chuyển gen thông qua ống phấn (nuôi cấy mô)Được đề xuất lần đầu tiên năm 1988 trên cây lúa bởi nhóm Ray Wu đại học Cornell (Mỹ) dựa trên sự kế thừa công trình của Duan và Chen (TQ, 1985) với tỷ lệ hạt chuyển gen/hạt thí nghiệm là 20%.Ở Việt Nam, phương pháp này đang được viện Nghiên cứu cây bông và viện CNSH thử nghiệm ở quy mô lớn trên cây bông.www.themegallery.com1.1. Phương pháp trực tiếp chuyển gen thông qua ống phấn (nuôi cấy mô)Trên lúa: tiến hành từ 1-2 giờ sau khi hoa nở vớiCADN = 50 µg/ml1.2.Chuyển gen bằng súng bắn genNguyên tắc chung: Sử dụng các viên đạn có kích thước nhỏ nhưng tỷ trọng cao để đạt gia tốc cao, dưới tác dụng của 1 lực nén xuyên qua các vỏ và màng tế bào đưa lớp ADN bọc ngoài vào tế bào và tiếp cận với bộ gen của tế bào.Chuyển gen bằng súng bắn gen Tốc độ hạt đạt 300 - 600 m/sMật độ sử dụng các hạt không gây hư hại nghiêm trọng đến tế bào.Các hạt hình cầu bằng vàng hoặc tungsten, đk 1-1,5µm được bao bọc bằng các vecto tái tổ hợp chứa ADN cần chuyển nạp (đã được ngưng kết với CaCl2 hoặc polythylene glycol).1.2. Chuyển gen bằng súng bắn gen Ưu điểm: + Dễ dàng tiến hành+ Đối tượng nhận gen có thể rất đa dạng (ở dạng mô, phôi, tế bào và tế bào trần)Nhược điểm: Cây chuyển gen khó tái sinh1.3. Chuyển gen nhờ kỹ thuật điện xung (electroporation ) Kỹ thuật điện xung (electroporation) là một phương pháp cơ học được sử dụng để đưa các phân tử phân cực vào trong tế bào chủ qua màng tế bào. Trong phương pháp này, một xung điện cao thếtrong khoảnh khắc (vài phần nghìn giây) có khả năng làm rối loạn cấu trúc màng kép phospholipid, tạo ra các lỗ thủng tạm thời cho phép các phân tử DNA ngoại lai từ môi trường xâm nhập vào bên trong tế bào.1.3. Chuyển gen nhờ kỹ thuật điện xung (electroporation )Kỹ thuật điện xung dựa trên trạng thái tương đối yếu của các tương tác kỵ nước của phospholipid kép và khả năng tập hợp lại một cách tự động của nó sau khi bị rối loạn (Purves, 2001).Vì vậy, một xung điện chớp nhoáng có thể gây ra rối loạn ở các vị trí của màng một cách nhất thời, làm cho các phân tử phân cực có thể đi qua, nhưng sau đó màng có thế đóng kín lại nhanh chóng và tế bào không bị ảnh hưởng gì cả.Các tế bào chủ và DNA ngoại lai được tạo thành dịch huyền phù và cho vào trong một cuvette nhựa có điện cực.1.3. Chuyển gen nhờ kỹ thuật điện xung (electroporation )Máy xung gen(Gene Pulser Xcell Total System- Biorad – Mỹ)Cuvette nhựa có cựcỨng dụng của kỹ thuật điện xunga. Biến nạp DNA: Các gen đặc hiệu có thể được tạo dòng trong plamid và sau đó plasmid này được đưa vào tế bào chủ để nghiên cứu cấu trúc và chức năng của gen và protein.b. Chuyển plasmid trực tiếp giữa các tế bào: Tế bào vi khuẩn đã chứa plasmid có thể được ủ với một dòng khác không mang plasmid nhưng lại có đặc tính mong muốn khác. Ðiện áp của xung điện sẽ tạo ra các lỗ, cho phép một số plasmid đi ra khỏi tế bào và lại đi vào tế bào khác. Sau đó các tế bào mong muốn sẽ được chọn lọc bằng tính kháng thuốc kháng sinh hoặc bằng phương pháp tương tự khác (Withers, 1995). Kiểu chuyển gen này cũng có thể được thực hiện giữa các loài khác nhau. Vì vậy, một lượng lớn plasmid sinh trưởng trong các khuẩn lạc vi khuẩn được nhân lên một cách nhanh chóng và sau đó được chuyển vào các tế bào nấm men bằng kỹ thuật xung điện để nghiên cứu (Gunn, 1995).Ứng dụng của kỹ thuật điện xungDesign Inc. c. Dung hợp tế bào đa kích thích:Sự tạo thành các lỗ thủng trên màng xảy ra do xung điện chớp nhoáng tạo ra cho thấy đa kích thích sự dung hợp tế bào (Weber và Berrg, 1995). d. Phân phối thuốc qua da:Chỉ khi xung điện gây ra các lỗ tạm thời trên màng sinh chất, các lỗ tương tự đa tạo ra ở màng lipid kép của lớp da chết ở phía ngoài cùng. Các lỗ này cho phép thuốc đi qua da đến các mô đích. Các bệnh nhân thích phương pháp này hơn phương pháp tiêm (không cần kim tiêm) và có thể tránh được các vấn đề phân hủy hoặc hấp thu không đúng của liệu pháp uống thuốc (oral medication) trong hệ tiêu hóa (Praustmitz, 1993).Ứng dụng của kỹ thuật điện xunge. Liệu pháp hóa điện khối u ung thư (cancer tumor electrochemotherapy): Các nhà khoa học đang nghiên cứu tiềm năng của kỹ thuật xung điện để tăng tính hiệu quả của liệu pháp hóa học. Khi sử dụng kỹ thuật xung điện để biến nạp DNA, xung điện này sẽ phá vỡ màng tế bào ung thư và làm tăng lượng thuốc đi đến các vị trí. Một số nghiên cứu cho rằng đã làm giảm sự phát triển khối u khi áp dụng phương pháp này cho các tế bào ung thư ở hệ thống mô hình động vật (Maeda, 1998).f. Liệu pháp gen: Kỹ thuật xung điện cho phép các vector mang các gen quan tâm được biến nạp qua da đến các mô đích. Khi đa hợp nhất vào các tế bào của cơ thể, các protein được tổng hợp từ các gen này có thể thay thế gen sai hỏng và vì vậy đa điều trị các rối loạn di truyền (Inovio, 2002).1.4. Kỹ thuật chuyển gennhờ silicon carbide55%16%45%41%50% Silicon carbide là những vật liệu dạng sợi do hãng Arco Metals sản xuất. Sợi silicon carbide có đường kính rất nhỏ khoảng 0,6 µm và dài khoảng 10 - 80 µm. Khi lắc một hỗn hợp huyền phù tế bào đơn và plasmid tái tổ hợp mang gen mong muốn, gen chọn lọc với silicon carbide trên máy lắc vortes khoảng 5 giây, các tế bào sẽ bị thủng và các ADN ngoại lai có thể xâm nhập. Nuôi cấy tế bào tái sinh thành mô sẹo và cây, chọn lọc để tách ra những cây đã chuyển gen. Thường huyền phù tế bào đơn được thu hoạch vào ngày thứ 5 hoặc thứ 6 sau khi cấy truyền là giai đoạn tốt nhất để thực hiện quy trình chuyển gen.1.5. Phương pháp chuyển gen nhờ kỹ thuật siêu âm Nguyên tắc: Sau khi tách, protoplast được xử lý nhẹ bằng siêu âm có hiện diện của DNA ngoại lai. Sóng siêu âm giúp DNA đi vào tế bào và thể hiện.Các bước:1.Tách protoplast từ mô thịt lá. Treo protoplast đã tinh sạch trong môi trường có chứa 21% sucrose.2.Cắm đầu siêu âm của máy phát siêu âm ngập độ 3mm trong huyền phù protoplast và cho máy siêu âm phát với tần số 20 KHz theo từng nhịp ngắn 110 millisecond.Tổng thời gian tác động siêu âm từ 500-900 millisecond.1.5. Phương pháp chuyển gen nhờ kỹ thuật siêu âm 3. Protoplast được nuôi trên đĩa Petri trong môi trường thích hợp để xác định tỷ lệ chết do siêu âm phá vỡ màng. Ở điều kiện nói trên, khoảng 30-50% protoplast bị chết. Số protoplast còn lại tiếp tục phân chia và tái sinh.4. Nuôi cấy invitro để tái sinh cây5. Chọn lọc cây và đưa ra trồng ở môi trường ngoài2.1. Phương pháp chuyển gen nhờ virusƯu điểm: Virus dễ xâm nhập và lây lan trong cơ thể thực vậtTiêu chuẩn virus làm vecter chuyển gen + Hệ gen của virus phải là ADN + VR có khả năng di chuyển từ tế bào này sang tế bào khác qua các lỗ của vách tế bào + Có khả năng mang được ADN mới, sau đó chuyển gen này vào tế bào thực vật + Có phổ ký chủ rộng (trên nhiều loại cây trồng) + Không gây tác hại đáng kể cho thực vật + Có khả năng tải được các đoạn ADN gắn vào. Tuy nhiên, việc chuyển gen nhờ virus rất ít được sử dụng2.2 Chuyển gen nhờ vi sinh vật đất AgrobacteriumAgrobacterium là các vi khuẩn đất nhuộm gram (-)Gây ra các triệu chứng bệnh khi xâm nhiễmCó 4 loại chính nhưng trong đó A.tumefaciens (gây bệnh u thân) được sử dụng nhiều nhất trong việc chuyển geneVi khuẩn đất AgrobacteriumTi - plasmidBộ gene của vi khuẩn2.2.1. Cơ chế gây bệnhTrong A.tumefaciens chứa các plasmid có kích thước rất lớnPlasmid của A.tumefaciens chính là tác nhân gây bệnhPlasmid này đã chuyển vào tế bào thực vật các vật chất di truyền gây bệnh u cho cây gọi là các Ti-plasmid (Umor inducing plasmid)Ti-plasmid đã chuyển một đoạn ADN của nó xâm nhập vào gen của cây.2.2.2. Cấu trúc Ti-plasmidCó 3 vùng quan trọng1.Vùng ori (vùng tái bản)2.Vùng T-ADN3.Vùng vir (vir region)a. Vùng T-ADNĐược giới hạn bằng bờ trái (BL) và bờ phải (BR).Vùng bờ chứa 1đv lặp lại gồm 25bp chỉ sai khác ở 2 NuVùng BR cắt T-ADN, vùng BL ghép ADN vào genom cây chủChứa các gene tổng hợp auxin, cytokinin là các gene gây khối u và các gene tổng hợp các opine (gồm nopaline, octopine)Đoạn này được chuyển vào tế bào thực vật gắn vào bộ NST và gây ra bệnh ub. Vùng Vir (vir region)Chịu trách nhiệm hoạt động lây nhiễm, chuyển nạp (conjugative transfer)Cắt đứt BL & BR để giải phóng đoạn T- ADNBảo vệ sợi ADN bị cắtVận chuyển đoạn cắt xâm nhập vào tế bào thực vậtTăng cường quá trình tái tổ hợp với tb thực vậtTiêu hóa opine (thức ăn của vi khuẩn)Quá trình chuyển nạp gene của vi khuẩnHạn chế của Ti - plasmidKích thước lớn (200-800bp) do đó thao tác gặp khó khăn.Chứa nhiều đoạn ADN cần thiết phải cắt bỏ để chèn vào đoạn ADN mục tiêu.Ti-plasmid không tự tái bản trong E.coli nên phải bổ sung gốc tái bản của E.coliCần bổ sung các gen chỉ thị để chọn lọc cây và vi khuẩnCác hệ thống vecto chuyển genHệ thống vecto liên hợp (co-integrate vecto): Là sự liên hợp 2 loại plasmid: Ti-plasmid & plasmid trung gianPlasmid trung gianLà 1 plasmid tách dòng từ vk E.coli và có thể tái sinh được ở AgrobecteriumPlasmid này chứa vùng gắn gene cần chuyển nạp, các gene chỉ thị phục vụ việc chọn lọc và có mặt đoạn tương đồng Hệ thống vecto này nằm trong vk A.tumefacien và hoạt động theo cơ chế chuyển gen thông thường của vi khuẩn đấtCác hệ thống vecto chuyển geneHệ thống vecto nhị thểPlasmid tách dòng từ E.coli: có thiết kế vùng BL –các gene chỉ thị và vùng gắn gene cần chuyển - BRPlasmid cải tiến:Toàn bộ vùng T-ADN & vùng BL, BR bị cắt bỏ chỉ giữ lại vùng vir Hệ thống vecto này cũng hoạt động theo cơ chế chuyển gen của vk đất Agrobacterium một cách rất hiệu quảKỹ thuật đĩa lá trong chuyển gene bằng vi khuẩn AgrobacteriumKết luậnNhờ thành quả của phương pháp nuôi cấy mô, kết hợp với nhiều phương pháp chuyển gen tiên tiến có hiệu quả, chúng ta đã tạo ra được nhiều loài cây tái tổ hợp khác nhau. Việc hoàn thiện kỹ thuật tế bào trần là yêu cầu quan trọng hàng đầu để chuyển trực tiếp ADN vào cây một lá mầm. Tuy nhiên, việc tái sinh cây từ tế bào trần còn bị hạn chế, do vậy cần phải nghiên cứu kỹ thuật nuôi cấy tế bào trần thành công cho nhiều loài cây và với nhiều kiểu gen. Phương pháp bắn gen vào tế bào đang nuôi cấy, đặc biệt đối với những bộ phận như phôi non, đỉnh sinh trưởng có nhiều hứa hẹn vì nó làm tăng tần số tái tổ hợp và có thể áp dụng được cho nhiều loài cây.Kết luậnCần nhớ rằng công tác tạo cây chuyển gen chỉ tiến hành khi lòa cây cần muốn chuyển gen không có gen định chuyển, hoặc khi chúng ta cần có sự biến đổi sâu sắc hay chuyển vật chất di truyền từ loài sinh vật này sang loài sinh vật khác mà bằng con đường lai hữu tính không thể thực hiện được.thank for attention!!!Nguyễn Thị HồngNguyễn Thị Ngát Phạm Thị Thu Hiền Phạm Thị HuyềnLê Thị Yến