Đánh giá và ứng dụng mô hình ruồi giấm drosophila melanogaster trong nghiên cứu sàng lọc cây thuốc có hoạt tính kháng ung thư - Vũ hoàng giang

TAP CHI SINH HOC 2015, 37(1se): 245-248 DOI: 10.15625/0866-7160/v37n1se. ĐÁNH GIÁ VÀ ỨNG DỤNG MÔ HÌNH RUỒI GIẤM Drosophila melanogaster TRONG NGHIÊN CỨU SÀNG LỌC CÂY THUỐC CÓ HOẠT TÍNH KHÁNG UNG THƯ Vũ Hoàng Giang, Cao Thị Thùy Trang, Nguyễn Minh Cần, Đặng Ngọc Ánh Sương, Đặng Thị Phương Thảo* Trường Đại học Khoa học tự nhiên, ĐHQG tp. Hồ Chí Minh, *thaodp@hcmus.edu.vn TÓM TẮT: Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành đánh giá mô hình ruồi giấm Drosophila melanogaster biểu hiện vượt mức protein YorkieS168A nhằm ứng dụng trong sàng lọc cây thuốc có hoạt tính kháng ung thư. Nhân tố phiên mã Yorkie (Yki) có vai trò trong kiểm soát kích thước mô và có liên quan đến nhiều loại ung thư. Chúng tôi nhận thấy biểu hiện vượt mức protein YkiS168A tại mô mắt ruồi giấm đã gây ra kiểu hình tăng sinh bất thường của mắt ruồi. Như hiện tượng thấy được trong một khối u của tế bào ung thư, các kết quả khảo sát của chúng tôi cho thấy kiểu hình mắt bất thường của ruồi gây ra do sự tăng sinh không kiểm soát của các tế bào, thể hiện qua các tín hiệu kháng thể PH3 sau lằn phân sinh morphogenesis furrow. Ngoài ra, sàng lọc ban đầu cho thấy cao chiết ethanol 50% từ cây xạ đen (Ehretia asperula Zoll. & Mor.) đã có tác dụng làm giảm kiểu hình mắt bất thường của mô hình này. Tất cả các kết quả trên cho thấy, mô hình ruồi giấm biểu hiện vượt mức YkiS168A có tiềm năng trong sàng lọc sơ cấp các cây thuốc có hoạt tính kháng ung thư. Từ khóa: Drosophila melanogaster, Ehretia asperula, kháng ung thư, nhân tố phiên mã yorkie, xạ đen. MỞ ĐẦU Mô hình ruồi giấm có nhiều ưu điểm như: vòng đời ngắn, dễ nuôi, ít tốn kém, có thể triển khai ở qui mô lớn, bộ gene đã được giải trình tự, hơn 70% các gene gây bệnh ở người có độ tương đồng cao so với gene ở ruồi giấm [5]. Với các ưu điểm này, mô hình ruồi giấm rất thích hợp cho việc sàng lọc ban đầu các hợp chất tiềm năng có khả năng chữa bệnh, đặc biệt là ung thư, giúp rút ngắn thời gian cũng như chi phí cho phát triển các loại thuốc mới. Nhiều gene gây ung thư và các con đường tín hiệu liên quan đến ung thư ở người đã được nghiên cứu trên mô hình ruồi giấm [1]. Con đường Hippo được phát hiện đầu tiên trên ruồi giấm, có vai trò trong việc kiểm soát kích thước mô thông qua việc điều hoà nhân tố phiên mã Yki [4]. Các sai hỏng trong con đường này dẫn đến sự phát triển quá mức của mô. Sự phosphoryl hoá Yki tại Ser168 đóng vai trò quan trọng, tạo vị trí gắn cho protein 14-3-3, giúp chuyển vị Yki ra khỏi nhân và định vị trong tế bào chất [2]. Yki kích thích sự phiên mã các gene thúc đẩy tăng trưởng và tăng sinh tế bào, cũng như các gene ức chế apoptosis gồm cyclin E, cyclin B, DIAP1 và bantam [6]. Nghiên cứu của Oh và cộng sự đã cho thấy đột biến S168A gây ra kiểu hình mắt bất thường trên ruồi giấm [3]. Nhận thấy tiềm năng ứng dụng của mô hình này, chúng tôi tiến hành đánh giá việc sử dụng mô hình ruồi giấm Drosophila melanogaster biểu hiện vượt mức YkiS168A cho sàng lọc các cây thuốc có hoạt tính kháng ung thư. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Các dòng ruồi Các dòng ruồi được nuôi trên môi trường chuẩn ở 25oC. Dòng ruồi CantonS được sử dụng như dòng ruồi hoang dại. Các dòng ruồi mang phức hợp gene UAS-lacZ (mã số 107532), UAS-YkiS168A (mã số 28818) và dòng ruồi mang GMR-GAL4 trên nhiễm sắc thể X được lấy từ ngân hàng ruồi Bloomington và Kyoto. Biểu hiện vượt mức protein Lai ruồi cái mang phức hợp gene GMR-GAL4 với ruồi đực mang phức hợp gene UAS-YkiS168A. Protein YkiS168A sẽ được biểu hiện ở thế hệ con lai F1. Nhân tố điều hoà phiên mã GAL4 được biểu hiện tại mô mắt ruồi giấm nhờ promoter chuyên biệt cho mô mắt GMR, bám lên trình tự điều hoà phiên mã UAS giúp biểu hiện vượt mức protein mục tiêu (hình 1a). Các phép lai được thực hiện trên môi trường tổng hợp Formula 4-24 Instant Medium, Blue (Carolina Biological Supply Company, Hoa Kỳ). Đánh giá kiểu hình mắt Các đánh giá được thực hiện ở một ngày tuổi. Ghi nhận kiểu hình mắt theo hướng nhìn từ một bên mắt và nhìn từ đỉnh đầu bằng máy ảnh Canon PowerShot A2400IS và kính hiển vi soi nổi ZMZ600 (Nikkon, Nhật Bản). Nhuộm miễn dịch huỳnh quang Thu nhận đĩa tiền phân sinh mắt của ấu trùng bậc ba. Cố định mẫu bằng Paraformaldehyde (PFA) 4% trong 15 phút, ở 25oC. Ủ mẫu với kháng thể kháng PH3 (Cell Signaling, Nhật Bản) (1:1000); beta galactosidase (Cell Signaling, Nhật Bản) (1:500) trong 2 giờ ở 25oC. Sau đó ủ với kháng thể bậc hai có gắn chất phát huỳnh quang Alexa 488 (Invitrogen, Nhật Bản) (1:400) trong 2 giờ ở 25oC. Xem kết quả dưới kính hiển vi huỳnh quang Olympus BX41 (Olympus, Hoa Kỳ). Tín hiệu huỳnh quang được phân tích bằng phần mềm ImageJ, xử lý thống kê bằng phần mềm GraphPad Prism 6.0. Đối với thí nghiệm chứng minh sự biểu hiện yki trong đĩa phân sinh mắt ruồi, chúng tôi sử dụng kháng thể kháng V5 (một peptide tín hiệu được gắn kèm với yki) (cell signaling, Nhật Bản) với tỷ lệ 1:500. Các bước nhuộm kháng thể bậc 2 và quan sát được thực hiện như mô tả bên trên. Thu nhận cao chiết cây thuốc bằng phương pháp ngâm dầm (maceration) Thu nhận mẫu cây thuốc, định danh. Ngâm mẫu trong dung môi ethanol 50% ở 25oC, khuấy đảo và thay dung môi mới mỗi ngày trong 7 ngày. Dịch chiết được lọc hai lần qua giấy lọc, cô cạn dung môi ở 45oC. Làm khô cao bằng máy đông khô VirTis BenchTop K (SP Scientific, Hoa Kỳ). Bảo quản cao trong tủ mát 4oC. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Biểu hiện vượt mức YkiS168A gây kiểu hình bất thường tại mô mắt ruồi giấm trưởng thành Sử dụng hệ thống biểu hiện định hướng mô GAL4/UAS, trong đó Gal4 được biểu hiện nhờ hoạt động của promoter đặc hiệu mô mắt GMR và sau đó Gal4 gắn trên trình tự UAS ở thượng nguồn gene yki và gây ra sự biểu hiện vượt mức YkiS168A tại mô mắt ruồi giấm (hình 1a). Kết quả cho thấy, kiểu hình mắt của dòng ruồi biểu hiện vượt mức YkiS168A có sự thay đổi màu sắc, tăng kích thước, tạo thành các nếp nhăn trên bề mặt và mất cấu trúc trật tự của các mắt đơn cũng như gai mắt (hình 1b, GMR>YkiS168A). Ruồi biểu hiện vượt mức một protein ngoại lai khác là β-galactosidase tại mô mắt (hình 1b, GMR>lacZ) và ruồi biểu hiện Gal4 tại mô mắt (hình 1b, GMR>CS) cho kiểu hình mắt bình thường. Kết quả này khẳng định kiểu hình mắt với kích thước to, màu sắc bất thường gây ra bởi sự biểu hiện vượt mức yki trong mô mắt ruồi. 3 2 1 Hình 1. a. Hệ thống biểu hiện định hướng mô GAL4/UAS. b. Ảnh hưởng của sự biểu hiện vượt mức YkiS168A lên kiểu hình mắt (b1: mắt ruồi nhìn nghiêng theo chiều thân; b2: mắt ruồi nhìn thẳng theo chiều thân; b3: đĩa tiền phân sinh mắt được nhuộm với kháng thể kháng V5 và kháng thể kháng β-galactosidase). Biểu hiện vượt mức YkiS168A làm tăng tín hiệu PH3 tại đĩa tiền phân sinh mắt của ấu trùng bậc ba Chúng tôi tiến hành nhuộm miễn dịch huỳnh quang đĩa tiền phân sinh mắt của ấu trùng bậc ba với kháng thể kháng PH3 (Phospho-Histone 3), dấu hiệu nhận biết giai đoạn phân bào (M phase). Kết quả cho thấy, có sự tăng các tín hiệu huỳnh quang ở sau lằn phân sinh (MF-Morphogenesis Furrow) trên đĩa mắt của dòng ruồi biểu hiện vượt mức YkiS168A (hình 2, GMR>YkiS168A). Ngược lại, ở hai dòng ruồi đối chứng (hình 2, GMR>CS, GMR>LacZ) các tế bào phát triển theo qui luật bình thường, tế bào ở sau lằn phân sinh (MF) hầu như ngừng phân chia và đi vào giai đoạn biệt hóa. Điều này cho thấy, sự biểu hiện vượt mức YkiS168A đã gây ra các bất thường trong điều hòa chu kỳ tế bào, làm mất kiểm soát sự tăng sinh của tế bào. Chính điều này đã tạo nên kiểu hình mắt bất thường trên ruồi trưởng thành. Các kết quả trên cho thấy, mô hình ruồi giấm biểu hiện vượt mức YkiS168A đã mô phỏng được đặc điểm mất kiểm soát trong tăng sinh của tế bào ung thư, và có triển vọng để phát triển thành mô hình sàng lọc sơ cấp các cây thuốc tiềm năng cho hỗ trợ và điều trị ung thư. Hình 2. Sự biểu hiện vượt mức YkiS168A làm tăng tín hiệu PH3 trên đĩa tiền phân sinh mắt của ấu trùng bậc ba (****: p<0,0001) Hình 3. Ảnh hưởng của cao chiết từ thân (a) và lá (b) cây xạ đen lên mô hình ruồi biểu hiện vượt mức YkiS168A Cao chiết từ thân và lá cây xạ đen làm giảm kiểu hình bất thường ở mắt ruồi giấm biểu hiện vượt mức YkiS168A Xạ đen (Ehretiaasperula Zoll. & Mor.) thường được sử dụng trong các bài thuốc dân gian hỗ trợ điều trị ung thư. Tuy nhiên, công dụng của xạ đen vẫn chưa được chứng minh ở mức in vivo. Chúng tôi bổ sung cao chiết từ thân và lá cây xạ đen vào thức ăn và nuôi phôi của dòng ruồi biểu hiện vượt mức YkiS168A trên môi trường này. Kết quả quan sát mắt ruồi trưởng thành cho thấy, với nồng độ cao chiết xạ đen 100 mg/ml, ruồi thử nghiệm có màu mắt sáng hơn, các nếp gấp trên bề mặt mắt giảm so với ruồi không ăn cao chiết. Hiệu quả này rõ hơn ở nồng độ 150 mg/ml (hình 3). KẾT LUẬN Mô hình ruồi giấm biểu hiện vượt mức YkiS168A đã mô phỏng được đặc điểm mất kiểm soát tăng sinh của các tế bào ung thư, gây ra kiểu hình bất thường trên mắt ruồi trưởng thành. Với các ưu điểm về chi phí duy trì, khả năng sinh sản, thời gian thí nghiệm và khả năng đánh giá tác động của các nhân tố lên quá trình phát triển mắt, mô hình mắt ruồi giấm biểu hiện vượt mức YkiS168A có tiềm năng rất lớn để phát triển thành mô hình sàng lọc sơ cấp các cây thuốc có hoạt tính kháng ung thư ở quy mô lớn. Bước đầu khảo sát ảnh hưởng của cao chiết từ lá và thân cây xạ đen (Ehretiaasperula Zoll. & Mor.) lên mô hình này cho thấy, các cao chiết này đều có khả năng phục hồi kiểu hình mắt của mô hình, cải thiện sức sống ruồi trưởng thành. TÀI LIỆU THAM KHẢO Brumby A. M., Richardson H. E., 2005. Using Drosophila melanogaster to map human cancer pathways. Nature Reviews Cancer, 5(8): 626-639. Oh H., Irvine K. D., 2008. In vivo regulation of Yorkie phosphorylation and localization. Development, 135(6): 1081-1088. Oh H., Irvine K. D., 2009. In vivo analysis of Yorkie phosphorylation sites. Oncogene, 28(17): 1916-1927. Pan D., 2007. Hippo signaling in organ size control. Genes & Development, 21(8): 886-897. Reiter L. T., Potocki L., Chien S, Gribskov M., Bier E., 2001. A systematic analysis of human disease-associated gene sequences in Drosophila melanogaster. Genome Research, 11(6): 1114-1125. Zhao B., Tumaneng K., Guan K. L., 2011. The Hippo pathway in organ size control, tissue regeneration and stem cell self-renewal. Nature Cell Biology, 13(8): 877-883. EVALUATE Drosophila melanogaster MODEL AND APPLY FOR ANTI-CANCER HERB SCREENING Vu Hoang Giang, Cao Thi Thuy Trang, Nguyen Minh Can, Dang Ngoc Anh Suong, Dang Thi Phuong Thao University of Science, Vietnam National University in Ho Chi Minh city SUMMARY In this study, we evaluate Drosophila melanogaster model which over-express YorkieS168A protein in order to apply the model for anti-cancer herb screening. Transcriptional co-activator YorkieS168A (Yki) plays a role in organ size control and concerns some cancer diseases. In fly model, over-expression of YorkieS168A protein at eye tissue causes abnormal eye phenotype. As mass of cancerous cells, the abnormal eye phenotype is resulted by miss-control of cell proliferation as shown by anti PH3 signal after morphogenesis furrow. Interestingly, our results also show that ethanol 50% extraction of Ehretia asperula Zoll. & Mor. reduces abnormal eye phenotype in over-expressed YkiS168A flies. All the results show that over-expressed YkiS168A fly model serves as a potential model for anti-cancer herb screening. Keywords: Drosophila melanogaster, Ehretia asperula, anti-cancer, transcription factor yorkie, xạ đen. Ngày nhận bài: 22-10-2014