Đặc điểm trình tự nucleotide cystatin II phân lập từ MRNA của hai mẫu ngô địa phương Sơn La và Hà Giang - Vì Thị Xuân Thủy

Vì Thị Xuân Thủy và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 119(05): 101 - 106 101 ĐẶC ĐIỂM TRÌNH TỰ NUCLEOTIDE CYSTATIN II PHÂN LẬP TỪ mRNA CỦA HAI MẪU NGÔ ĐỊA PHƢƠNG SƠN LA VÀ HÀ GIANG Vì Thị Xuân Thủy1*, Đặng Thị Hoa2, Nguyễn Vũ Thanh Thanh2, Chu Hoàng Mậu3 1Trường Đại học Tây Bắc, 2Trường Đại học Khoa học - ĐH Thái Nguyên, 3Trường Đại học Sư phạm - ĐH Thái Nguyên TÓM TẮT Cysteine proteinase thực hiện chức năng trƣởng thành protein, làm mới protein để phù hợp với những thay đổi của môi trƣờng và loại bỏ protein bất thƣờng. Cystatin là một dạng protein ức chế hoạt động của cysteine proteinase, nó đóng vai trò nhƣ cơ chất để xâm nhập vào trung tâm hoạt động của cysteine proteinase vì thế ngăn cản việc đi vào của cơ chất protein khác. Do đó, cystatin có mối liên quan đến khả năng chống vi sinh vật, chống côn trùng, trong đó có mọt gây hại của thực vật. Trong nghiên cứu này, chúng tôi trình bày kết quả phân lập, tách dòng và xác định trình tự nucleotide của gen cystatin II từ mRNA của hai mẫu ngô địa phƣơng Sơn La (SL) và Hà Giang (HG). Gen cystatin II phân lập đƣợc có kích thƣớc 405 bp, mã hoá 134 amino acid. Có 9 vị trí 38130, nhƣng không có sự sai khác ở điểm gắn kết của vùng chức năng CY. Gen cystatin II đã phân lập đƣợc sử dụng để thiết kế vector chuyển gen nhằm cải thiện khả năng kháng mọt của cây ngô. Từ khóa: Cystatin, cysteine proteinase, gen cystatin II, mọt ngô, Zea mays MỞ ĐẦU* Ở Việt Nam, ngô (Zea mays L.) là cây lƣơng thực quan trọng thứ hai sau [0 , ngô lai rất dễ bị mọt xâm hại. Mọt ngô (Sitophilus zeamais . Sâu non nở trong hạt thƣờng ă [4], [8]. - ở động vật, thực vật và vi sinh vật [2]. Ở động vật không xƣơng sống, cysteine proteinase là enzyme tiêu hóa [2], [9 cysteine proteinase gen cystatin ch * Tel: 0983 484171, Email: xuanthuytbu@gmail.com . cysteine proteinase . . Trong bài cystatin II kế vector chuyển gen mang cấu trúc cystatin II . , Sử dụng hai mẫu ngô địa phƣơng thu thập ở tỉnh Sơn La (SL) và tỉnh Hà Giang (HG). RNA tổng số đƣợc tách chiết bằng Trizol Reagent KIT; cDNA đƣợc tổng hợp theo quy trình Maxima® First Strand cDNA Synthesis KIT; gen cystatin đƣợc khuếch đại bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu theo chu kỳ nhiệt: 940C/4 phút - (940C/45 giây - 580C/30 Vì Thị Xuân Thủy và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 119(05): 101 - 106 102 giây - 72 0 C/60 giây) 30 chu kỳ - 72 0 C/10 phút. Sản phẩm PCR đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8%; tinh sạch sản phẩm PCR theo GeneJET PCR Purification KIT và gắn vào vector tách dòng pBT rồi biến nạp vào tế bào khả biến E.coli DH5α bằng sốc nhiệt (420C trong 1 phút 30 giây). Vi khuẩn mang vector tái tổ hợp đƣợc chọn lọc trên môi trƣờng LB đặc bổ sung X-g -PCR với cặp mồi M13. Plasmid tái tổ hợp đƣợc thu nhận bằng cách tách chiết theo phƣơng pháp tách dòng phân tử [7 tự động ABI Prism 3130 - USA/Japan. Số liệu đƣợc xử lý bằng phần mềm BioEdit, DNAStar. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Nhân bản gen cystatin II từ mRNA Cặp mồi đặc hiệu ZmCysF/Zm để khuếch đại đoạn mã hoá của gen cystatin II tin về trình tự gen cystatin II cystatin II ƣớc tính khoảng 400 bp. ZmCysF:5‟ACCATGCCCAACAAACATCG AATCG 3‟ ZmCysR:5‟TTAGGCGCTAGCACCCTCTT CA 3‟ ngô 5 - 7 ngày tuổi, RNA tổng số đƣợc sử dụng làm khuôn cho phản ứng phiên mã ngƣợc tạo cDNA với mồi ngẫu nhiên (Random Hexamer Primer). Phản ứng PCR nhân bản đoạn mã hóa của gen cystatin II với cặp mồi đã thiết kế ZmCysF/ZmCysR, 1kb đƣợc thể hiện ở hình 1A. - 400bp, hàm lƣợ cystatin II 38130 trên Ngân hàng gen Quốc tế. Nhƣ vậy, chúng tôi có thể sơ bộ kết luận đã nhân bản đƣợc gen cystatin II từ RNA của hai mẫu ngô địa phƣơng nghiên cứu. bào khả biến E.coli DH5α và chọn lọc khuẩn lạc trắng bằng phản ứng colony-PCR với cặp mồi M13. Những khuẩn lạc trắng dƣơng tính với colony-PCR có khả năng mang vector tái tổ hợp pBT_cystatin II. Sau khi tách plasmid từ sinh khối vi khuẩn, chúng tôi thực hiện kiểm tra sự có mặt của gen cystatin II bằng cách sử dụng enzyme giới hạn BamHI để cắt plasmid tái tổ hợp (Hình 1B). Theo tính toán lý thuyết, vector pBT có kích thƣớc 2700 bp, sản phẩm PCR gen đích 400 bp thì plasmid tái tổ hợp có kích thƣớc khoảng 3100 bp. Kết quả điện di kiểm tra (Hình 1B) cho thấy, các dòng khuẩn lạc trắng dƣơng tính với colony-PCR đều mang plasmid tái tổ hợp (pBT_cystatin II). Các plasmid tái tổ hợp đƣợc sử dụng để xác định trình tự nucleotide. Xác định trình tự cDNA cystain II của hai mẫu ngô nghiên cứu Kết quả xác định trình tự nucleotide của gen cystatin II 2) cystatin II nucleotide của gen cystatin II công bố trên 1). protein cystatin D38130 của GenBank (H 3) protein cystatin 134 amino acid, trong đó có 9 amino acid sai khác ở các vị trí cụ thể đƣợc trình bày ở bảng 2. Vì Thị Xuân Thủy và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 119(05): 101 - 106 103 A B Hình 1. A: Hình ảnh điện di sản phẩm RT-PCR nhân gen cystatin II của hai mẫu ngô SL và HG (M: DNA Marker 1kb); B: BamHI(M: DNA marker 1kb; SL, HG: plasmid tái tổ hợp pBT_cystatinII cắt bởi BamHI; ĐC: plasmid tái tổ hợp pBT_cystatinII không cắt bởi BamHI) Hình 2. Kết quả so sánh trình tự gen cystatin II của các hai mẫu ngô nghiên cứu và D38130 trên GenBank 500 bp 250 bp ~400 bp M SL HG ~2700 bp 500 bp 250 bp ~3100 bp M SL HG ĐC ~400 bp Vì Thị Xuân Thủy và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 119(05): 101 - 106 104 Hình 3. Trình tự amino acid suy diễn của cytatin ở hai mẫu nghiên cứu và D38130 trên GenBank Bảng 2 cho thấy, trong 9 vị trí sai khác amino acid của protein cystatin suy diễn của hai mẫu SL, HG và D38130 thì có các vị trí thứ 24, 40, 48, 49,118 ở hai mẫu SL, HG là giống nhau chỉ có sự sai khác với D38130. 94,0% đến 95,5%. Bảng 1. Kết quả so sánh trình tự gen cystatin II của hai mẫu ngô nghiên cứu và D38130 trên GenBank Vị trí D38130 HG SL 27 C A C 31 G G T 66 G C G 71 A C C 100 G G A 119 T C T 130 C A C 143 A G G 146 A G G 344 G C C 355 T T C 362 A A G Bảng 2. nghiên cứu và D38130 trên GenBank Vị trí D38130 HG SL 11 A A S 24 N T T 34 D D N 40 V A A 44 Q K Q 48 E G G 49 N S S 118 K N N 119 F F L , gen cystatin II . 5 vị trí amino acid, đó là các vị trí thứ 44, 48, 49, 118, 119. Sự sai khác nà cystatin II [5 [6 cystatin II . proteinase [6 [2 Vì Thị Xuân Thủy và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 119(05): 101 - 106 105 , lúa gạo và đậu xanh. KẾT LUẬN Gen cystatin II ngô địa phƣơng HG, SL có kíc 134 amino acid. Trình tự nucleotide của gen cystatin II kết với . Trình tự gen cystatin II phục vụ chuyển gen ở cây ngô. Lời cảm ơn: Công trình được hoàn thành có sử dụng thiết bị Phòng thí nghiệm trọng điểm về công nghệ gen –Viện Công nghệ Sinh học và thuộc nội dung của đề tài Khoa học-Công nghệ cấp ĐHTN, - - . TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Abe M., Arai S. 1991, Some propeties of a cystein proteinase inhibitor from corn endosperm. Agricultural and biological chemistry, 55(9): 2417-2418. 2. Grudkowska M., Zagdanska B., (2004). Multifuncationl role of plant cysteine proteinase. Acta biochimica Polonica, 51: 609- 624 3. Nguyễn Đức Lƣơng, Dƣơng Văn Sơn, Lƣơng Văn Hinh, (2000), Giáo trình cây ngô, Nxb Nông nghiệp. 4. Markham R.H., Bosque-Pérez N.A., Borgemeister C., Meikle W.G., 1994. Developing pest management strategies for the maize weevil, Sitophilus zeamais and the larger grain borer, Prostephanus truncatus, in the humid and sub- humid tropics. FAO Plant Protection Bulletin 42: 97-116. 5. Massonneau A., Condamine P., Wisniewski J.P., Zivy M., Rogowsky P.M., 2005. Maize cystatins respond to developmental cues, cold stress and drought. Biochim Biophys Acta. 1729 (3):186-99. Meriem B., Urte S., Juan V., Marie-Claire G., Dominique M., 2010. Plant cystatins, Biochimie 92: 1657-1666. 6. Moeller D.A., Tiffin P., 2005. Genetic diversity and the evolutionary history of plant immunity genes in two species of Zea. Mol Biol Evol., 22 (12): 2480-90. 7. Nikolay S. Outchkourov, Willem Jan De Kogel, Antje Schuurman-de Bruin, Magnus Abrahamson, Maarten A. Jongsma, 2004. Specific cysteine protease inhibitors act as deterrents of western flower thrips, Frankliniella occidentalis (Pergande), in transgenic potato. Plant Biotechnol. J, 2(5): 439–448 8. Rafael Guttiérrez-Campos, Juan Antonio Torres-Acosta, Luis Jorge Saucedo-Arias and Miguel Angel Gomez-Lim, 1999. The use of cysteine proteinase inhibitors to engineer resistance against potyviruses in transgenic tobacco plants. Nat. Biotechnol. 17: 1223-1226. 9. Sambrook J., Russell D.W. 2001. Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY. 10. Senthilkumar R; Cheng C.P; Yeh K.W. 2010. Genetically pyramiding protease-inhibitor genes for dual broad-spectrum resistance against insect and phytopathogens in transgenic tobacco. Plant Biotechnol J. 8(1):65-75. 11. Throne, J.E. 1994. Life History of Immature Maize Weevils (Coleoptera: Curculionidae) on Corn Stored at Constant Temperatures and Relative Humidities in the Laboratory. Environmental Entomology, 23 (6): 1459-1471. 12. Turk B., Turk V., Turk D., 1997. Structural and functional aspects of papain-like cysteine proteinases and their protein inhibitors, Biol. Chem. Hopp seyler, 378 (3-4): 141-150 Vì Thị Xuân Thủy và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 119(05): 101 - 106 106 SUMMARY CHARACTERISTICS OF CYSTATIN II GENE ISOLATED FROM mRNA OF HA GIANG, SON LA LOCAL MAIZE CULTIVARS Vi Thi Xuan Thuy 1* , Dang Thi Hoa 2 , Nguyen Vu Thanh Thanh 2 , Chu Hoang Mau 3 1Tay Bac University, 2College of Science - TNU, 3College of Education - TNU Cysteine proteinase perform functions mature protein, protein refreshed to match the changing environment and eliminate abnormal proteins. Cystatin is the protein inhibitor of cysteine proteinase activity, it roles as a substrate into the active center of cysteine proteinase, that prevents the other substrate proteins go into. Therefore, cystatin correlation to anti- microbial, anti- insects including maize weevil. In this report, we present the results of amplified, cloning and determine the cystatin II gene sequence of two local maize samples (HG, SL). The coding region of cystatin II gene isolated from some maize samples has the size of 405 nucleotides, encoding 134 amino acids. Compare amino acid sequence of the protein cystatin inference of two maize samples with amino acid sequences of cystatin was from codes D38130 (in GenBank) has 12 different amino acids, but is not differences in the binding sites of CY function. The cDNA sequences of cystatin II genes be used to design vector in transgenic technique to improve resistance to maize weevil. Keyword: Cystatin, cysteine proteinase, cystatin II gene, maize weevil, Zea mays Ngày nhận bài:5/3/2014; Ngày phản biện:16/3/2014; Ngày duyệt đăng: 5/5/2014 Phản biện khoa học: TS. Hoàng Thị Thu Yến – Trường Đại học Khoa học - ĐHTN * Tel: 0983 484171, Email: xuanthuytbu@gmail.com