Đặc điểm sinh học của chủng edwardsiella ictaluri bị đột biến gen aroa dùng làm vaccine phòng bệnh gan thận mủ ở cá tra (pangasianodon hypophthalmus) - Hoàng Anh Tố Mai

Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 1/2015 140 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG KEÁT QUAÛ NGHIEÂN CÖÙU ÑAØO TAÏO SAU ÑAÏI HOÏC ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA CHỦNG EDWARDSIELLA ICTALURI BỊ ĐỘT BIẾN GEN aroA DÙNG LÀM VACCINE PHÒNG BỆNH GAN THẬN MỦ Ở CÁ TRA (PANGASIANODON HYPOPHTHALMUS) BIOLOGICAL CHARACTERISTICS OF aroA GENE KNOCKED-OUT EDWARDSIELLA ICTALURI STRAIN USED FOR VACCINE PRODUCTION TO PREVENT THE DISEASE OF WHITE SPOTS IN THE INTERNAL ORGAN OF STRIPED CATFISH (PANGASIANODON HYPOPHTHALMUS) Hoàng Anh Tố Mai1, Võ Văn Nha2 Ngày nhận bài: 24/9/2014; Ngà y phản biện thông qua: 11/11/2014; Ngày duyệt đăng: 10/2/2015 TÓM TẮT Nghiên cứu được tiến hành nhằm xác định các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa và sinh trưởng của chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri bị đột biến gen aroA (E. ictaluri ARO) từ chủng E. ictaluri gây bệnh gan thận mủ cá tra ở đồng bằng sông Cửu Long, Việt Nam (E. ictaluri WT). Kết quả nghiên cứu cho thấy chủng E. ictaluri ARO có đặc điểm hình thái, sinh lí, sinh hóa và sinh trưởng tương tự như chủng E. ictaluri WT. Chủng E. ictaluri ARO có thể nuôi cấy, bảo quản và tăng sinh khối để làm nguyên liệu sản xuất vaccine sống nhược độc phòng bệnh gan thận mủ cá tra sau này. Từ khóa: cá tra, Edwardsiella ictaluri đột biến gen aroA,gen aroA, vắc xin ABSTRACT The study was conducted to determine the morphological, physiological, biochemical, and growth of aroA gene knocked-out Edwardsiella ictaluri strain (E. ictaluri ARO). The results showed that the aroA gene knocked-out strain (E. ictaluri ARO) had similar phenotypes, physiological, biochemical, and growth characteristics as the wild-type WT. Further, the E. ictaluri ARO strain can be the culture, storage, and biomass for production of live attenuated vaccine to prevent the disease symptom of white spots in the internal organ of striped catfi sh. Keywords: Catfi sh Ca Tra, aroA gene knocked-out Edwardsiella ictaluri, aroA gene, vaccine 1 Hoàng Anh Tố Mai: Cao học Sinh học thực nghiệm - Trường Đại học Khoa học Huế 2 TS. Võ Văn Nha: Viện Nghiên cứu Nuôi trồng thủy sản III - Nha Trang I. ĐẶT VẤN ĐỀ Trên thế giới, các nghiên cứu đã phát hiện ra rằng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri là một tác nhân gây bệnh quan trọng trên cá nheo (catfi sh) ở Mỹ, cá trê trắng ở Thái Lan và trên một số loài cá da trơn khác ở Indonesia, Trung Quốc. Ở Việt Nam, các nhà khoa học trong và ngoài nước cũng cho rằng E. ictaluri là một tác nhân gây bệnh gan thận mủ trên cá tra nuôi ở đồng bằng sông Cửu Long. Bệnh nhiễm khuẩn gây bởi E. ictaluri đã làm tổn thất lớn cho nghề nuôi cá da trơn ở Mỹ hàng năm từ 20-30 triệu USD (Thune và công sự, 1997). Ở Việt Nam, E. ictaluri làm chết cá tra nuôi từ 10-90%, gây thiệt hại lớn cho người nuôi cá tra hàng năm (Võ Văn Nha, 2010). Vi khuẩn E. ictaluri có đặc tính sinh miễn dịch rất mạnh. Khi sử dụng chủng vi khuẩn E. ictaluri đột biến gen aroA làm vaccine phòng bệnh ESC cho cá da trơn ở Mỹ, Thune và cộng sự (1999) cho thấy, tỷ lệ sống của cá đạt 77,3-94,4% khi được ngâm vaccine 2 lần (Thune và cộng sự, 1999). Nghiên cứu này đã cung cấp thêm căn cứ cho thấy khả năng bảo hộ của chủng E. ictaluri đột biến gen aroA bằng công nghệ đột biến gen là chấp nhận được. Năm 2010-2012, chương trình công nghệ sinh học cấp Nhà nước do Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản III chủ trì đã tạo được dòng E. ictaluri đột biến gen aroA (E. ictaluri ARO) nhược độc, có khả năng sinh đáp ứng miễn dịch, làm nguyên liệu Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 1/2015 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 141 sản xuất vaccine phòng bệnh gan thận mủ cá tra bằng công nghệ đột biến gen (knocked-out gene). Tuy nhiên, cho đến nay việc nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng E. ictaluri ARO chưa thấy có tài liệu đề cập. Nghiên cứu này nhằm xác định và so sánh đặc điểm sinh học chủng E. ictaluri ARO với chủng E. ictaluri ban đầu chưa đột biến để làm cơ sở nuôi cấy, bảo quản và tăng sinh khối chủng E. ictaluri ARO, phục vụ sản xuất vắc xin nhược độc phòng bệnh gan thận mủ cá tra. II.VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Vật liệu Chủng E. ictaluri bị đột biến gen aroA (E. ictaluri ARO) từ chủng E. ictaluri “hoang dại” chưa đột biến (E. ictaluri WT) có độc lực cao gây bệnh gan thận mủ cá tra Việt Nam được cung cấp bởi đề tài cấp Nhà nước ở Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản III. Môi trường phân lập, nuôi cấy tăng sinh, kiểm tra sinh hóa chủng vi khuẩn E. ictaluri (đột biến gen aroA và chưa đột biến gen aroA) đã được sử dụng, gồm: Môi trường nuôi cấy không chọn lọc BHIA (Brain Heart Infusion Agar), hãng Biorad - Mỹ và môi trường nuôi cấy chọn lọc EIM (Edwardsiella Ictaluri Medium) theo Shotts và Waltman (1990) cho phân lập chủng E. ictaluri; Môi trường BHIB (Brain Heart Infusion Broth), hãng Biorad - Mỹ được sử dụng để nuôi cấy tăng sinh chủng E. ictaluri; Kít API 20E (Bio Merieux – Pháp), kết hợp một số phản ứng sinh lý, sinh hóa truyền thống (KIA, Manitol, O/F, LDC, ODC, NaCl ở 0; 5; 10; 15; 20; 25; 30‰) được sử dụng để kiểm tra các chỉ tiêu sinh vật hóa học. Ngoài ra, một số hóa chất, kháng sinh: Kanamycin, colistin sulphate, mannitol 0,35%, thuốc nhuộm Gram (cồn, acetone, fucsine, crystian violet), chlorin, NaCl cũng đã được sử dụng trong nghiên cứu này. 2. Phương pháp nghiên cứu 2.1. Xác định các chỉ tiêu về hình thái của E. ictaluri Quan sát khuẩn lạc vi khuẩn E. ictaluri: Vi khuẩn được nuôi cấy trên môi trường BHIA (Peptone: 10 g; Veal Brain heart extract: 12,5 g; Beef Brain heart extract: 5 g; NaCl: 5 g; Disodium phosphate: 2,5 g; Glucose: 2 g; Agar: 15 g; Nước cất cho đủ 1000 ml) ở nhiệt độ 280C, sau 48 giờ, quan sát hình dạng, màu sắc khuẩn lạc bằng mắt thường và đo kích thước khuẩn lạc bằng thước đo có độ chính xác đến mm. Hình dạng, kích thước vi khuẩn E. ictaluri: Được xác định bằng phương pháp nhuộm Gram (Barrow and Feltham, 1993), soi và đo kích thước vi khuẩn trên kính hiển vi (Olympus CX 31, Nhật) có gắn trắc vi thị kính, quan sát ở độ phóng đại 1000 lần. 2.2. Xác định đặc điểm sinh lý, sinh hóa của E. ictaluri Kiểm tra các đặc điểm sinh lý, sinh hóa: Sử dụng kít API 20E (Bio Merieux - Pháp) kết hợp một số phản ứng sinh lý, sinh hóa truyền thống (KIA, Mannitol, di động, oxidase, catalase, khả năng chịu mặn ở 0; 5; 10; 15; 20; 25; 30‰). Tính di động của vi khuẩn được quan sát bằng cách nhỏ một giọt nước lên lam kính, trải đều trên lam kính một ít vi khuẩn, đậy bằng lamen và quan sát bằng kính hiển vi ở độ phóng đại 1000 lần. Định danh vi khuẩn dựa vào hệ thống phân loại Bergey’s (Holt và công sự, 1994) 2.3. Xác định sự sinh trưởng của E. ictaluri Chủng E. ictaluri WT và chủng E. ictaluri ARO giữ đông ở -800C được đem nuôi cấy trên môi trường EIM, ủ ở 280C trong 48 giờ. Chọn khuẩn lạc đơn (có màu xanh lá, trong mờ) trên đĩa EIM đem cấy chuyền qua 5ml môi trường BHIB có bổ sung kháng sinh. Chủng E. ictaluri WT nuôi trong BHIB chứa 50 µg/ml colistin, chủng E. ictaluri ARO nuôi trong BHIB 50 µg/ml colistin và 50 µg/ml kanamycin. Tiến hành nuôi cấy lắc ở 280C, 250 vòng/phút trong 24 giờ. Chuyển dịch tăng sinh vào bình tam giác chứa môi trường BHIB có nồng độ kháng sinh tương tự bước tăng sinh trong 5ml môi trường BHIB (50 µg/ml colistin đối với chủng E. ictaluri WT và 50 µg/ml colistin + 50 µg/ml kanamycin đối với chủng E. ictaluri ARO). Tiếp tục nuôi cấy lắc ở 280C, 250 vòng/phút trong 24 giờ. Ghi nhận giá trị đo mật độ tế bào (OD) sau mỗi 2 giờ/lần bằng máy so màu quang phổ (Spectro 2000, Labomed, Inc.) ở bước sóng 600 nm kết hợp với phương pháp đếm số khuẩn lạc phát triển trên môi trường BHIA theo Koch. Hình 1. Sơ đồ xác định đường cong sinh trưởng phát triển của chủng E. ictaluri đột biến gen aroA trong môi trường BHIB Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 1/2015 142 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 1. Đặc điểm hình thái Trên môi trường nuôi cấy BHIA, vi khuẩn E. ictaluri bị đột biến gen aroA (E. ictaluri ARO) cũng như vi khuẩn E. ictaluri hoang dại chưa bị đột biến (E. ictaluri WT) đều phát triển chậm. Cụ thể, ở nhiệt độ 28 oC, sau 48 giờ nuôi cấy, khuẩn lạc vi khuẩn hình thành trên mặt đĩa thạch và hình dạng, kích thước vi khuẩn có các đặc điểm được thể hiện ở bảng 1 và hình 2, hình 3 Bảng 1. Đặc điểm khuẩn lạc, hình dạng và kích thước chủng E. ictaluri bị đột biến gen aroA (E. ictaluri ARO) và chủng chưa bị đột biến gen aroA (E. ictaluri WT) TT Đặc điểm E. ictaluri WT E. ictaluri ARO 1 Thời gian mọc khuẩn lạc (giờ) 24 24 2 Hình dạng khuẩn lạc trên môi trường BHIA sau 48 giờ Dạng tròn, trơn, hơi lồi Dạng tròn, trơn, hơi lồi 3 Màu sắc khuẩn lạc trên môi trường BHIA sau 48 giờ Màu trắng hơi mờ Màu trắng hơi mờ 4 Kích thước khuẩn lạc trên BHIA sau 48 giờ (mm) 2,45 ± 0,270 2,25 ± 0,100 5 Hình dạng vi khuẩn Que ngắn, đơn hoặc chuỗi ngắn Que ngắn, đơn hoặc chuỗi ngắn 6 Khả năng sinh bào tử Không Không 7 Kích thước vi khuẩn (µm) 2,50 - 3,13 x 0,75 - 1,00 2,48 - 2,95 x 0,30 - 0,75 8 Bắt màu thuốc nhuộm Gram Hồng (Gram âm) Hồng (Gram âm) Kết quả từ bảng 1 cho thấy ở nhiệt độ 280C, sau 48 giờ nuôi cấy trên môi trường BHIA, đường kính khuẩn lạc và kích thước vi khuẩn chủng E. ictaluri bị đột biến gen aroA (E. ictaluri ARO) nhỏ hơn không đáng kể so với chủng chưa đột biến (E. ictaluri WT). Cụ thể đường kính khuẩn lạc E. ictaluri ARO là 2,25 ± 0,100 mm so với 2,45 ± 0,270 mm của E. ictaluri WT; kích thước vi khuẩn E. ictaluri ARO là 2,48 - 2,95 x 0,30 - 0,75 µm so với 2,50 - 3,13 x 0,75 - 1,00 µm (bảng 1). Hình 2. Khuẩn lạc vi khuẩn E. ictaluri ARO (A) và E. ictaluri WT (B) trên môi trường BHIA B Hình 3. Vi khuẩn E. ictaluri chưa đột biến gen aroA (A) và vi khuẩn E. ictaluri bị đột biến gen aroA (B) B Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 1/2015 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 143 Cũng từ kết quả bảng 1, hình 2 và hình 3 cho thấy màu sắc, hình dạng, thời gian mọc khuẩn lạc và hình dạng vi khuẩn ở chủng bị đột biến gen aroA (E. ictaluri ARO) và chủng chưa đột biến gen aroA (E. ictaluri WT) đều tương tự nhau. Cụ thể, khuẩn lạc có màu trắng hơi mờ đục, dạng tròn trơn, hơi lồi, rìa có dạng không đồng nhất (Hình 2A, B). Khi nhuộm Gram và soi dưới kính hiển vi ở độ phóng đại 1000 lần, vi khuẩn chủng E. ictaluri ARO và E. ictaluri WT đều bắt màu hồng (vi khuẩn Gram âm) và có hình que ngắn, đơn hoặc chuỗi ngắn và không sinh bào tử (hình 3 A, B). Kết quả nghiên cứu về đặc điểm hình thái 108 chủng E. ictaluri thu được từ 181 cá tra bị bệnh gan thận mủ của Từ Thanh Dung và cộng sự (2004) cho thấy, khuẩn lạc tạo thành có màu trắng đục, rìa có dạng không đồng nhất, vi khuẩn bắt màu hồng thuốc nhuộm hematoxylin, hình que và có kích thước biến đổi cũng tương tự như những mô tả về hình thái chủng vi khuẩn E. ictaluri hoang dại (E. ictaluri WT) và chủng E. ictaluri đột biến gen aroA (E. ictaluri ARO) mà chúng tôi nghiên cứu. Điều này chứng tỏ chủng E. ictaluri bị đột biến gen aroA có hình dạng khá ổn định, không thay đổi sau khi đột biến và có thể nuôi cấy và bảo quản. Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu của Võ Văn Nha (2013). 2. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa chủng E. ictaluri bị đột biến gen aroA Các đặc tính sinh lý, sinh hóa của chủng vi khuẩn E. ictaluri bị đột biến gen aroA (E. ictaluri ARO) và chưa bị đột biến (E. ictaluri WT) được kiểm tra bằng kít API 20E kết hợp với phương pháp truyền thống. Kết quả thu được được thể hiện ở bảng 2. Hình 3. Vi khuẩn E. ictaluri chưa đột biến gen aroA (A) và vi khuẩn E. ictaluri bị đột biến gen aroA (B) B Bảng 2. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của E. ictaluri ARO và E. ictaluri WT Đặc điểm sinh lí, sinh hóa Các kí hiệu viết tắt E. ictaluri ARO E. ictaluri WT E. ictaluri theo Ber- gey’s, 1994 Hình dạng Que Que Que Gram - - - Di động + + + Oxidase Oxidase - - - Catalase Catalase + + + O/F Oxydation/Fermentation +/+ +/+ +/+ ONPG Orthonitrophenyl - - - ADH Arginin - - - LDC Lysin + + + ODC Ornithin - - V CIT Sodium citrat + + - H2S Sodium thisulfat - - - URE Urê - - - TDA Tryptophan - - - IND Indol - - - VP Sodium piruvac - - - GEL Gelatin - - - GLU Glucose + + + Gas Hơi - - V Khử Nitrate Nitrate + + + MAN Manitol - - - INO Inositol - - - SOR Sorbitol - - - RHA Rhamnose - - - SAC Sacrose - - - MEL Melibiose - - - AMY Amygdalin - - - ARA Arabinose - - - Lactose Lactose - - - Độ muối (‰) Natri clorua 0;5;10;15; 20 + + 25; 30 - - Ghi chú: +: dương tính; -: âm tính; V: biến đổi (có chủng âm tính, chủng dương tính) Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 1/2015 144 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG Kết quả từ bảng 2 cho thấy các đặc điểm sinh lý, sinh hóa của chủng vi khuẩn E. ictaluri bị đột biến gen aroA (E. ictaluri ARO) như: Gram âm, di động, cho phản ứng oxydase âm tính, catalase và lysin dương tính, âm tính với các loại đường ngoại trừ glucose (dương tính) đều tương đồng với chủng E. ictaluri “hoang dại” chưa đột biến (E. ictaluri WT) và tương đồng với khóa phân loại Bergey’s (Holt và cộng sự, 1994). Theo mô tả trong hệ thống phân loại của Bergey giống Edwardsiella có các đặc điểm là: Vi khuẩn dạng hình que thẳng, nhỏ, kích thước 1 μm x 2 - 3 μm, gram âm, có khả năng di động bằng vành lông rung (peritrichous fl agella) (E. ictaluri di động ở 250C, không di động ở 370C), yếm khí tùy tiện, có oxydation/fermentation (O/F) đều dương tính. Giống Edwardsiella có khả năng sử dụng đường glucose, kết quả sinh ra axít và thường sinh hơi, oxidase âm tính, catalase dương tính, voges-proskauer (VP) và simmon citrate âm tính, lysine decarboxylase (LDC) dương tính, ornithine decarboxylase (ODC) dương tính, khử Nitrate. Tất cả các loài thuộc giống này đều có khả năng lên men đường maltose và D-mannose. Như vậy, với những đặc điểm sinh lý, sinh hóa đã thu được từ nghiên cứu của chúng tôi ở trên có thể khẳng định rằng chủng E. ictaluri bị đột biến gen aroA (E. ictaluri ARO) cũng cho các đặc điểm sinh lý, sinh hóa không khác gì so với chủng E. ictaluri “hoang dại” chưa đột biến (E. ictaluri WT). 3. Đặc điểm sinh trưởng chủng E. ictaluri bị đột biến gen aroA Kết quả theo dõi sinh trưởng chủng E. ictaluri ARO và E. ictaluri “hoang dại” chưa đột biến (E. ictaluri WT) trên môi trường BHIB trong 24 giờ được thể hiện ở hình 4. Hình 4. Kết quả khảo sát đường cong sinh trưởng chủng E. ictaluri đột biến gen aroA (aroA) và E. ictaluri hoang dại trên môi trường BHI Kết quả từ hình 4 cho thấy chủng vi khuẩn E. ictaluri bị đột biến gen aroA (E. ictaluri ARO) trong môi trường BHIB cho sinh trưởng tương tự như chủng vi khuẩn E. ictaluri chưa bị đột biến (E. ictaluri WT) sau 24 giờ nuôi cấy. Phân tích Anova single factor so sánh sự khác biệt về sinh trưởng của chủng E. ictaluri ARO so với chủng E. ictaluri WT trong cùng điều kiện nuôi cấy trên môi trường BHIB cho thấy không có sự khác biệt về sự sinh trưởng của hai chủng vi khuẩn này (p>0,05). IV. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1. Kết luận Vi khuẩn E. ictaluri bị đột biến gen aroA (E. ictaluri ARO) có hình dạng ổn định, kích thước thay đổi không đáng kể so với trước khi bị đột biến, có thể nuôi cấy và bảo quản được như chủng E. ictaluri “hoang dại” ban đầu chưa đột biến. Ngoài ra, đặc điểm sinh lý, sinh hóa theo khóa phân loại Bergey’s của vi khuẩn E. ictaluri bị đột biến gen aroA, cũng như khả năng sinh trưởng trên môi trường BHIB tương tự như chủng vi khuẩn E. ictaluri chưa bị đột biến (E. ictaluri WT) sau 24 giờ theo dõi ở nhiệt độ 280C. 2. Kiến nghị Có thể sử dụng chủng E. ictaluri bị đột biến gen aroA (E. ictaluri ARO) nuôi cấy, bảo quản và tăng sinh khối để làm nguyên liệu sản xuất vaccine nhược độc phòng bệnh gan thận mủ cá tra. Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 1/2015 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 145 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng việt 1. Từ Thanh Dung, Crumlish M., Nguyễn Thị Như Ngọc, Nguyễn Quốc Thịnh, Đặng Thị Mai Thy, 2004. Xác định vi khuẩn gây bệnh trắng gan trên cá tra (Pangasius hypophthalmus). Tạp chí Khoa học - Đại học Cần Thơ: 137-142. 2. Võ Văn Nha, 2010. Nghiên cứu tạo chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri dùng làm vaccine phòng bệnh gan thận mủ cá tra bằng kỹ thuật đột biến gen. Báo cáo kết quả thực hiện đề tài cấp Nhà nước năm 2010, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản III. 3. Võ Văn Nha, 2013. Nghiên cứu tạo chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri dùng làm vaccine phòng bệnh gan thận mủ cá tra bằng kỹ thuật đột biến gen, Báo cáo tổng hợp kết quả khoa học công nghệ đề tài cấp Nhà nước. Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản III. Tiếng Anh 4. Barrow G. I., and Feltham R. K. A., 1993. Cowan and Steel’s manual for the indentifi cation of medical bacteria, 3rd ed., Cambridge University Press, Cambridge, p. 262. 5. Holt J.G., Krieg N.R., Sneath P.H.A., Staley J.T. & Williams S.T., 1994. Bergey’s Manual of deteminative Bacteriology, Ninth Editor, Williams and Wilkins, USA. 6. Thune R.L., Hawke J.P., Fernandez D.H., Lawrence M.L., and Moore M.M., 1997. Immunization with bacterial antigens: edwardsiellosis, In: Fish Vaccinology, Gudding R., Lillehaug A., Midtlyng P.J. and Brown P.J., eds. Dev. Biol. Stand., Karger, Basel, Switzerland, (90): 125-134. 7. Thune R. L., D. H. Fernandez, and J. R. Battista, 1999. An aroA mutant of Edwardsiella ictaluri is safe and effi cacious as a live, attenuated vaccine, Journal of Aquatic Animal Health, 11(4): 358-372.