Đặc điểm phân loại chủng xạ khuẩn HTL7.8 có khả năng kháng nấm gây bệnh trên chè tại Thái Nguyên - Đỗ Thị Tuyến

Đỗ Thị Tuyến và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 107(07): 97 - 102 97 ĐẶC ĐIỂM PHÂN LOẠI CHỦNG XẠ KHUẨN HT17.8 CÓ KHẢ NĂNG KHÁNG NẤM GÂY BỆNH TRÊN CHÈ TẠI THÁI NGUYÊN Đỗ Thị Tuyến*, Vi Thị Đoan Chính Trường Đại học Khoa học – ĐH Thái Nguyên TÓM TẮT Nấm ký sinh gây bệnh trên chè gây thiệt hại nặng nề cho ngành công nghiệp sản xuất chè ở Thái Nguyên. Trong bài báo này, chúng tôi trình bày kết quả nghiên cứu đặc điểm sinh học, phân loại và khả năng kháng nấm mốc gây bệnh trên chè của chủng xạ khuẩn HT17.8 được phân lập tại Thái Nguyên. Chủng HT17.8 sinh chất kháng sinh có hoạt phổ rộng, có khả năng kháng vi khuẩn Gram dương (Bacillus subtilis), vi khuẩn Gram âm (Escherichia coli), nấm mốc (Fusarium oxysporum, Fusarium solani) và 4 chủng nấm gây bệnh trên chè: N1, Đ1, PL3, TB4. Chủng HT17.8 có cuống sinh bào tử dạng xoắn, bề mặt bào tử nhẵn, có khả năng sinh trưởng được ở nồng độ muối tối đa 9%, nhiệt độ thích hợp cho sinh trưởng trong khoảng 250 - 350C, pH thích hợp trong khoảng 6 – 8, có khả năng sinh các enzyme ngoại bào amylase, protease, cellulase. Trên cơ sở các đặc điểm hình thái, nuôi cấy, sinh lý sinh hóa và trình tự gen 16S rRNA, chủng HT17.8 được định tên là Streptomyces sp. HT17.8. Trình tự gen 16S rRNA của chủng HT17.8 được đăng ký trên ngân hàng gen với mã số JQ012795. Chủng Streptomyces sp. HT17.8 sinh trưởng tốt và cho hoạt tính kháng sinh mạnh nhất trên môi trường Gause 2. Từ khóa: chất kháng sinh, kháng nấm, hoạt tính kháng sinh, xạ khuẩn, gen 16S rRNA ĐẶT VẤN ĐỀ1 Hàng năm, trên thế giới các vi nấm gây bệnh thực vật đã gây thiệt hại nghiêm trọng cho mùa màng. Thêm vào đó, việc sử dụng thuốc hóa học để trừ nấm thường gây ảnh hưởng nghiêm trọng tới sức khỏe con người, làm mất cân bằng sinh thái và gây ô nhiễm môi trường. Vì vậy, đấu tranh sinh học chống bệnh ở thực vật đã được Hội nghị tư vấn khu vực châu Á – Thái Bình Dương của FAO năm 1992 khẳng định là nền tảng của Chương trình quản lý thống nhất các bệnh dịch. Trong đó, việc sử dụng một hay nhiều loại vi sinh vật để kiềm chế bệnh ở thực vật được quan tâm hàng đầu [3]. Ở Việt Nam đã có nhiều công trình khoa học nghiên cứu và ứng dụng các biện pháp đấu tranh sinh học trong bảo vệ thực vật. Bùi Thị Việt Hà (2006) đã phân lập và định tên được chủng 3 chủng xạ khuẩn Streptomyces antimycoticus T41, Streptomyces diastatochromogenes D42, Streptomyces hygroscopicus TC 54 có khả năng kháng nấm Fusarium oxysporum gây bệnh thối cổ rễ ở cà * Tel: 0974056143; Email: tuyendodhkh@gmail.com chua, đậu Hà Lan, chuối và đã bước đầu ứng dụng chế phẩm sản xuất từ 3 chủng xạ khuẩn này thu được kết quả khả quan [3]. Trong bài báo này, chúng tôi trình bày các kết quả nghiên cứu đặc điểm sinh học, phân loại chủng xạ khuẩn HT17.8 có khả năng sinh chất kháng sinh (CKS) kháng nấm gây bệnh trên chè phân lập từ mẫu đất ở Thái Nguyên, Việt Nam nhằm làm cơ sở cho việc nghiên cứu ứng dụng. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên liệu - Chủng nghiên cứu: chủng xạ khuẩn HT17.8 có hoạt tính kháng sinh (HTKS) cao được lưu giữ tại Phòng thí nghiệm Sinh học, trường Đại học Khoa học. - Chủng kiểm định: Escherichia coli VTCC- B-883, Bacillus subtilis VTCC-B-888, Fusarium oxysporum VTCCF-1301, Aspergillus niger VTCCF-001, Fusarium solani VTCCF-1302 do Viện Bảo tàng giống chuẩn vi sinh vật cung cấp; 4 chủng nấm mốc gây bệnh trên chè, bao gồm: chủng Đ1 - gây bệnh đốm đen, chủng N2 – gây bệnh đốm nâu, chủng TB4 – gây bệnh khô búp, chủng Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Đỗ Thị Tuyến và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 107(07): 97 - 102 98 PL3 – gây bệnh phồng rộp lá chè. Các chủng này nhận được từ Phòng thí nghiệm Sinh học, Trường Đại học Khoa học. - Các môi trường: Môi trường Gause 1 nuôi cấy xạ khuẩn, môi trường Czapek nuôi cấy nấm mốc, các môi trường nuôi cấy cho phân loại: ISP 1, ISP 2, ISP 3, ISP 4, ISP 5, ISP 6, ISP 9, 79, Glycerin - nitrat, hữu cơ – agar Phương pháp nghiên cứu - Xác định hoạt tính kháng sinh: Sử dụng phương pháp khuếch tán trên thạch [2]. - Nghiên cứu đặc điểm sinh học và phân loại: Đặc điểm hình thái, nuôi cấy, sinh lý và sinh hóa: theo mô tả trong khóa phân loại của Shirling và Gottlieb [7]. Xác định trình tự gen 16S rRNA: Tách chiết DNA tổng số theo kit của hãng QIAamp DNA Mini Kit. Gen 16S rRNA được thu nhận bằng phản ứng nhân bản gen (PCR) với cặp mồi có trình tự: 341F : 5’- CCT ACG GGA GGC AGC AG -3’ 907R : 5’- CCG TCA ATT CCT TRA GTT T -3’ Sản phẩm PCR sau khi tinh sạch được xác định trình tự trên thiết bị đọc trình tự tự động ABI PRISM® 3100 Avant Geneetic Analyzer. Trình tự nucleotide được xử lý bằng phần mềm ABI PRISM 3100 Avant Data Collection v 1.0 và DNA Sequencing Analysis, so sánh với trình tự gen 16S rRNA của các sinh vật prokaryote đã được công bố trên ngân hàng gen thế giới bằng chương trình BLAST. - Nghiên cứu môi trường lên men thích hợp cho sinh tổng hợp chất kháng sinh [1]. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Khả năng kháng nấm mốc gây bệnh trên chè của chủng xạ khuẩn HT17.8 Chủng xạ khuẩn HT17.8 được phân lập từ đất Thái Nguyên, có hoạt phổ rộng, đặc biệt có hoạt tính kháng nấm mốc gây bệnh chè nên được lựa chọn để nghiên cứu phân loại. Kết quả xác định khả năng kháng với các chủng vi sinh vật kiểm định của chủng HT17.8 thể hiện trên bảng 1 và hình 1. Kết quả bảng 1 cho thấy chủng HT17.8 sinh chất kháng sinh hoạt phổ rộng, có khả năng kháng với cả vi khuẩn Gram dương, Gram âm, nấm mốc và 4 chủng nấm gây bệnh trên chè. Đặc biệt, chủng HT17.8 kháng mạnh với chủng nấm Đ1 - được phân lập từ những lá chè non bị các bệnh đốm đen. Đây là bệnh gặp rất phổ biến trên các vùng trồng chè ở nước ta, trong đó có các vùng chè ở Thái Nguyên. Khi chè bị dịch hại này thì không những ảnh hưởng đến năng suất mà chất lượng chè cũng bị ảnh hưởng. Với hướng nghiên cứu tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm cao, có khả năng ứng dụng vào thực tiễn, chúng tôi tiến hành lựa chọn chủng HT17.8 để tiếp tục nghiên cứu các đặc điểm phân loại và khả năng sinh tổng hợp CKS của chủng này. Bảng 1. Khả năng kháng các vi sinh vật kiểm định của chủng HT17.8 Ký hiệu chủng Hoạt tính kháng sinh (D - d, ± m, mm) E.coli VTCC-B- 883 B. subtilis VTCC-B- 888 F. solani VTCCF- 1302 F. oxysporum VTCCF-1301 Đ1 N2 PL3 TB4 HT 17.8 10,2±0,1 10,2±0,2 19,3±1,4 20,1±1,1 23,1 ± 0,5 10,2 ± 1,2 10,3 ± 0,1 4 ± 1,5 Hình 1. Khả năng kháng nấm mốc của chủng xạ khuẩn HT17.8 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Đỗ Thị Tuyến và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 107(07): 97 - 102 99 Phân loại chủng xạ khuẩn Đặc điểm sinh học của chủng HT17.8 - Đặc điểm hình thái: Chủng xạ khuẩn được nuôi trên môi trường Gause 1 sau 5 – 7 ngày, quan sát dưới kính hiển vi quang học và kính hiển vi điện tử quét nhận thấy: Cuống sinh bào tử của chủng HT17.8 có dạng xoắn (S), bề mặt bào tử nhẵn (Sm) (Hình 2). - Đặc điểm nuôi cấy: Chủng HT17.8 sinh trưởng tốt trên các môi trường Gause 1, Gause 2, ISP 1, ISP 2, ISP 3, ISP 6, 79, hữu cơ-agar, mọc kém trên môi trường ISP4, ISP 5 và Glycerin - nitrat. Khuẩn ty khí sinh và khuẩn ty cơ chất có màu sắc đa dạng, không tạo sắc tố melanin trên môi trường ISP 6. - Đặc điểm sinh lý, sinh hóa: Chủng HT17.8 sinh trưởng tốt trên các nguồn đường lactose, manitol, inositol, xylose, và sinh trưởng kém trên môi trường chứa các nguồn đường raffinose, maltose rhamnose, arabinose; có khả năng sinh trưởng được ở nồng độ muối tối đa là 9%, nhiệt độ thích hợp cho sinh trưởng trong khoảng 250 - 350C, pH thích hợp từ 6 – 8, có khả năng sinh các enzyme ngoại bào amylase, protease, cellulase. Kết quả so sánh các đặc điểm hình thái và nuôi cấy của chủng HT17.8 và chủng Streptomyces carpaticus Maximova et Terekhova sp. nov. được thể hiện ở bảng 2. Hình 2. Hình thái khuẩn lạc, cuống sinh bào tử và bề mặt bào tử chủng HT17.8 Bảng 2. So sánh một số đặc điểm phân loại chủng HT17.8 với loài chuẩn Streptomyces carpaticus Maximova et Terekhova sp. nov. Môi trường Đặc điểm phân loại Chủng HT17.8 Loài chuẩn Streptomyces carpaticus Maximova et Terekhova sp. nov. Gause1 KTKS Xám Xám KTCC Nâu Nâu CSBT Xoắn (S) Xoắn (S) Bề mặt bào tử Nhẵn (Sm) Nhẵn (Sm) Sắc tố tan Nâu ánh vàng Nâu ánh vàng nhạt Glycerin- nitrat KTKS Trắng Xám – Nâu KTCC Trắng Nâu đến đen Sắc tố tan Không màu Nâu đến nâu đậm ISP 4 KTKS Trắng Xám nhạt KTCC Trắng Không màu Sắc tố tan Không màu Không màu Gause 2 và 79 KTKS Vàng Nâu nhạt KTCC Vàng Nâu xanh Sắc tố tan Vàng chanh Nâu đậm đỏ Gause 1 Hình thành kháng sinh CKS chống nấm, vi khuẩn G(+) và G(-) - Chủng tiêu biểu HT17.8 Streptomyces carpaticus NRRL B-16359T Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Đỗ Thị Tuyến và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 107(07): 97 - 102 100 Qua so sánh với mô tả của Gause và cộng sự (1983), cùng với những mô tả theo Chương trình xạ khuẩn quốc tế (ISP) về đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của các chủng xạ khuẩn, chủng HT17.8 có nhiều đặc điểm tương đồng với loài Streptomyces carpaticus Maximova et Terekhova sp. nov. (theo Catalogue Odobren, 1980) [4], [8]. Để có thêm căn cứ phân loại, chúng tôi tiến hành xác định trình tự gen 16S rRNA của chủng HT17.8 và so sánh với trình tự gen 16S của các loài đã biết trên Genebank. Phân tích trình tự gen 16S rRNA DNA tổng số của chủng HT17.8 được tách chiết theo Kit của hãng QIAamp DNA Mini có cải tiến. Sử dụng DNA tổng số làm khuôn, cặp mồi đặc hiệu (341F, 907R), sản phẩm PCR thu được là một băng DNA duy nhất có kích thước khoảng 550 bp đúng theo tính toán lý thuyết (hình 3). Hình 3. Sản phẩm nhân gen mã hóa 16S rRNA của chủng HT17.8 M: Marker 1kb 1: Sản phẩm PCR của chủng HT17.8 Một phần đoạn gen mã hóa 16S rRNA của chủng HT17.8 được giải trình tự trực tiếp từ sản phẩm PCR với cặp mồi cặp mồi (341F, 907R) trên máy đọc trình tự tự động. Kết quả so sánh trình tự một phần gen 16S rRNA của chủng HT17.8 với các trình tự gen trong GenBank cho thấy: Trình tự một phần đoạn gen 16S rRNA của chủng HT17.8 có độ tương đồng 97% so với trình tự gen tương ứng của chủng Streptomyces carpaticus NRRL B-16359T (có mã số DQ442494). Với độ tương đồng thấp hơn 98,6% có thể sơ bộ khẳng định chủng HT17.8 không thuộc loài Streptomyces carpaticus [9]. Tuy nhiên, khi phân tích các đặc điểm phân loại truyền thống, chủng HT17.8 lại có nhiều đặc điểm giống với chủng Streptomyces carpaticus Maximova et Terekhova sp. nov mặc dù vẫn có một vài sai khác về đặc điểm nuôi cấy và khả năng hình thành chất kháng sinh như đã chỉ ra ở bảng 2. Sự giống nhau này rất có thể đó là những biến dị tự nhiên xuất hiện khi xạ khuẩn phát triển trong các môi trường khác nhau. Tính biến dị cao là một trong các đặc điểm của xạ khuẩn nên phần lớn các đặc điểm hình thái, sinh lý – sinh hóa cũng như các đặc điểm nuôi cấy thường không ổn định, dễ bị thay đổi và có giá trị thấp về mặt phân loại. Điều này cho thấy, để phân loại chính xác một chủng, không chỉ dựa vào các đặc điểm sinh lý, sinh hóa mà cần phải dựa vào một số chỉ tiêu khác nữa, trong đó có việc phân tích trình tự của đoạn gen 16S rRNA. Như vậy, dựa vào tất cả các đặc điểm về hình thái, sinh lý – sinh hóa và trình tự đoạn gen 16S rRNA nhận thấy chủng HT17.8 có thể là một loài mới thuộc chi Streptomyces. Tuy nhiên, để khẳng định chắc chắn được điều này cần phải có những nghiên cứu sâu hơn. Từ những kết quả trên, chúng tôi tạm thời đặt tên chủng HT17.8 là Streptomyces sp. HT17.8. Trình tự gen 16S rRNA của chủng này được đăng ký trên ngân hàng gen thế giới với mã số là JQ012795. Lựa chọn môi trường nuôi cấy thích hợp cho sinh tổng hợp chất kháng sinh của chủng xạ khuẩn Streptomyces sp. HT17.8 Theo kết quả nghiên cứu về xạ khuẩn sinh chất kháng sinh đã công bố, xạ khuẩn thường sinh tổng hợp chất kháng sinh mạnh trên một số môi trường cơ bản như: Gause 1, Gause 2, A-4, A-4H, ISP 4 và 79 [1], [3]. Từ các môi trường cơ bản này, có thể lựa chọn môi trường thích hợp cho sinh tổng hợp CKS chủng xạ khuẩn HT17.8. Quá trình lên men được tiến hành trong bình nón dung tích 250 ml chứa 25 ml môi trường, trên máy lắc tròn có tốc độ 220 vòng/phút, ở 28 – 300C. Sau 7 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Đỗ Thị Tuyến và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 107(07): 97 - 102 101 ngày thu dịch lên men và xác định hoạt tính kháng sinh theo phương pháp đục lỗ thạch với vi sinh vật kiểm định là chủng nấm Đ1 gây bệnh đốm đen trên chè. Kết quả xác định hoạt tính kháng nấm của chủng xạ khuẩn HT17.8 được thể hiện trên hình 4. Hình 4. HTKS của chủng HT17.8 trên các môi trường lên men Kết quả trên hình 4 cho thấy chủng Streptomyces sp. HT17.8 khi lên men trên môi trường Gause 2 sinh trưởng tốt (sinh khối đạt 4,58mg/ml) và hoạt tính kháng nấm mạnh nhất (kích thước vòng vô khuẩn đạt 30mm). Vì vậy, chúng tôi lựa chọn môi trường Gause 2 để sử dụng cho các nghiên cứu ứng dụng tiếp theo. Tuy nhiên, để nâng cao khả năng ứng dụng của chủng HT17.8 cần phải tiếp tục nghiên cứu cải tiến, tối ưu hóa môi trường và các điều kiện nuôi cấy để chủng sinh trưởng và cho hoạt tính kháng sinh cao hơn. KẾT LUẬN 1. Chủng HT17.8 có hoạt phổ rộng, đặc biệt có khả năng kháng mạnh với các chủng nấm gây bệnh trên chè. 2. Dựa vào các đặc điểm hình thái, nuôi cấy, sinh lý sinh hóa kết hợp với trình tự gen 16S rRNA, chủng HT17.8 được định tên là Streptomyces sp. HT17.8. Trình tự gen 16S rRNA của chủng này được đăng ký trên ngân hàng gen thế giới với mã số là JQ012795. 3. Khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp chất kháng sinh của chủng Streptomyces sp. HT17.8 cao nhất trên môi trường Gause 2. TÀI LIỆU THAM KHẢO [1]. Vi Thị Đoan Chính (2011), Tuyển chọn và nghiên cứu xạ khuẩn có khả năng đối kháng với một số chủng vi khuẩn gây nhiễm trùng bệnh viện, Báo cáo tổng kết đề tài khoa học và công nghệ cấp Bộ, Mã số B2009 - TN07 – 02. [2]. Nguyễn Lân Dũng, Phạm Thị Trân Châu, Nguyễn Thanh Hiền, Lê Đình Lương, Đoàn Xuân Mượu, Phạm Văn Ty (1978), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, Tập III, Nxb KH&CN, Hà Nội. [3]. Bùi Thị Việt Hà (2006), Nghiên cứu xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh thực vật ở Việt Nam, Luận án tiến sĩ sinh học, Hà Nội. [4]. Gause G. F., Terekhova L. P., Preobrazhenskaya T. P., Sveshnikova M. A., Maximova T. S. (1983), “A guide for the determination of actinomycetes”, Genera Streptomyces, Streptoverticillium, and Chaina, USA. [5]. Keswanit J., Whitman W. B. (2001), “Relationship of 16S rRNA sequence similarity to DNA hybridzation in prokaryotes”, International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 51, 667 - 678. [6]. Lane D. J. (1991). 16S-23S rRNA sequencing. In Nucleic Acid Techniques in Bacterial Systematics, pp. 125–175. Edited by E. Stackebrandt & M. Goodfellow. Chichester: Wiley. [7]. Shirling E. B., Gottlieb D. (1996), “Methods for characterization of streptomyces species”, International Journal of Systematic Bacteriology, 16 (3). [8]. Waksman S. A. (1961), “The Actinomycetes: Classification, identification and descriptions of genera and species”, The Williams & Wilkins Co., Baltimore, 2, USA. [9]. Whitman W. B., Keswanit J. (2001), “Relationship of 16S rRNA sequence similarity to DNA hybridzation in prokaryotes”, International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 51, 667 - 678. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Đỗ Thị Tuyến và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 107(07): 97 - 102 102 SUMMARY TAXONOMIC CHARACTERISTICS OF ACTINOMYCETES STRAINS HAVING THE ANTIBIOTIC ABILITY AGAINST PATHOGENIC FUNGI ATTACKING TEA IN THAI NGUYEN Do Thi Tuyen*, Vi Thi Doan Chinh College of Sciences – TNU The pathogenic fungi attacking tea cause heavy losses to the tea industry in Thai Nguyen. Among actinomycetes strains studied, the strains HT17.8 which showed the highest activity against all four strains of pathogenic fungi attacking tea (N1, Đ1, PL3, TB4) was chosen for this study. This new strain is capable of producing antimicrobial agents, which active in vitro against Gram positive bacteria (Bacillus subtilis) and Gram negative bacteria (Escherichia coli), fungi (Fusarium oxysporum, Fusarium solani). Obtained results indicated the strain HT17.8 has spiral spore chains, smooth spore surface. Well growth was recorded at a temperature range of 25 to 350C and at pH range of 6 to 8, tolerated 9% NaCl. The strain HT17.8 showed moderate activity some enzymes as amylase, protease, cellulase. On the basis of morphological, culture, biochemical and physiological characteristics and the sequence analysis of 16S rRNA gene, the strain HT17.8 was identified as Streptomyces sp. HT17.8. This sequence was submitted on Genbank with number accession JQ012795. Optimal culture conditions for the growth and antibiotic production of the strain Streptomyces sp. HT17.8 were determined on A - 4H medium. Key words: antibiotic, antifungal, antibiotic activity, actinomycetes, 16S rRNA gene Ngày nhận bài: 09/4/2013; Ngày phản biện:15/4/2013; Ngày duyệt đăng: 10/9/2013 Phản biện khoa học: TS. Hoàng Thị Thu Yến - Trường Đại học Khoa học – ĐH Thái Nguyên * Tel: 0974 056 143. Email: tuyendodhkh@gmail.com Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên