Công nghệ di truyền - Thư viện DNA bộ gene (DNA genomic library)

Thư viện DNA bộ gene (DNA genomic library) DNA genomic library là gì? • Tập hợp tất cả các đoạn DNA của bộ gene sinh vật. • Các đoạn DNA được tạo dòng trong các vector • Sử dụng nhằm phân lập một đoạn DNA hoặc xác định vị trí của đoạn DNA trên bộ gene Thực hiện (phage hoặc cosmid) RE Siêu âm ----------- B1. Cắt bộ gene bằng RE • Sử dụng các RE có trình tự nhận biết gồm 4 nu • Cắt từng phần để thu được lượng lớn gene nguyên vẹn. • Sử dụng DNA tách từ các loại mô khác nhau • Cắt vector với cùng RE để tạo đầu cố kết • Có thể sử dụng 2 RE để tránh tự kết nối. B2. Tạo dòng • Plasmid: hạn chế đối với đoạn DNA kích thước lớn, hiệu suất biến nạp tương đối thấp. • Phage : phổ biến nhất, mang DNA ~ 20 kb • Cosmid: mang đoạn DNA ~ 40 – 50 kb • BAC : hữu hiệu nhất – Mang đoạn DNA lớn 100 – 300 kb – Ít hình thành thể khảm – Hiệu quả trong tạo dòng và thu hồi DNA – Duy trì sự ổn định của DNA gắn trong vector • YAC : nhận đoạn DNA lớn, khó thao tác. B3. Chuyển nạp vào tế bào chủ • Hóa biến nạp • Điện biến nạp • Đóng gói DNA tái tổ hợp (phage  hoặc cosmid) và cho xâm nhiễm tế bào vi khuẩn cDNA library Tại sao cần xây dựng thư viện cDNA ? Tách chiết, tinh sạch và phân tích RNA 1) Tách chiết RNA tổng số - Nguyên lý: tách rời RNA ra khỏi hỗn hợp DNA , protein, - Kiểm soát ribonuclease (RNase) = chất ức chế 2) Tách chiết mRNA - Đuôi poly A - Tách bằng sắc ký ái lực oligo dT - Thu nhận bằng ly tâm Tổng hợp cDNA theo pp RNaseH Tổng hợp cDNA self priming Tổng hợp cDNA đuôi trùng hợp Tạo dòng cDNA = hệ thống dG:dC Tạo dòng cDNA bằng 1 linker Tạo dòng cDNA bằng 2 linker Tạo dòng cDNA bằng adapter HindIII Tạo dòng cDNA bằng primer-adapter Sàng lọc dòng DNA bằng lai nucleic acid – Mẫu dò tương đồng (100 %, đã biết trình tự) – Mẫu dò tương đồng từng phần (từ loài kế cận đã biết trình tự DNA quan tâm) – Mẫu dò tổng hợp nhân tạo (từ trình tự protein đã biết) Mẫu dò nhân tạo từ trình tự protein đã biết Sàng lọc dòng DNA bằng lai nucleic acid VD: Southern blotting Phóng xạ tự ghi Digoxygenin dUTP Sàng lọc dòng DNA bằng lai nucleic acid VD: Southern blotting Sàng lọc dòng DNA bằng lai nucleic acid Lai tại chỗ (In situ hybridization) Tạo probe a) Đánh dấu ở đuôi bằng đồng vị phóng xạ Tạo probe b) Dịch chuyển điểm đứt (Nick translation) Tạo probe c) Tổng hợp đoạn bổ sung Sàng lọc dòng DNA bằng thử miễn dịch (immunochemical screening) Sàng lọc dòng DNA bằng thử hoạt tính protein lipase Trioleoylglycerol + thuốc nhuộm huỳnh quang chitinase chitin Dòng DNA có đúng là dòng mong muốn? 1. Open reading frame. 2. Dự đoán trình tự và chức năng 3. Đánh giá chức năng của sản phẩm DNA 4. Xem xét sự biểu hiện của DNA ở các loại mô khác nhau 5. Đột biến và đánh giá chức năng