Cơ quan đích của Gill-Associated virus (GAV) cảm nhiễm ở tôm chân trắng (Litopenaeus vannamei boone, 1931) - Nguyễn Thị Thùy Giang

Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 1/2014 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 13 CƠ QUAN ĐÍ CH CỦ A GILL-ASSOCIATED VIRUS (GAV) CẢ M NHIỄ M Ở TÔM CHÂN TRẮ NG (Litopenaeus vannamei Boone, 1931) TARGET ORGANS OF GILL-ASSOCIATED VIRUS (GAV) INFECTED IN WHITELEG SHRIMP (Litopenaeus vannamei Boone, 1931) Nguyễn Thị Thùy Giang1 Ngày nhận bài: 11/10/2013; Ngày phản biện thông qua: 08/11/2013; Ngày duyệt đăng: 10/3/2014 TÓM TẮT Tôm chân trắng (Litopenaeus vannamei, Boone, 1931) nhập vào Trường Đại học Ghent (Vương quốc Bỉ) từ Thái Lan. Đây là đàn tôm không bị nhiễm các loại tác nhân gây bệnh đặc biệt (SPF), được ương nuôi trong hệ thống nước tuần hoàn ở điệu kiện môi trường có nhiệt độ 28 ± 10C, pH: 7,8-8,1 và độ mặn 35 ppt. Khi tôm này đạt kích cỡ 15-20g/con đã được cảm nhiễm chủng virus GAV (YHV type 2) bằng phương pháp tiêm cơ. Chủng virus này đã được phân lập từ tôm sú (Penaeus monodon) nuôi ở Úc. Sau 7 ngày cảm nhiễm, tôm thí nghiệm không bị chết, nhưng 20% số tôm này đã thể hiện một số dấu hiệu bất thường như: đường ruột rỗng do bỏ ăn, màu sắc cơ thể nhợt nhạt, đặc biệt là phần đầu ngực, cá biệt vỏ tôm bị mềm. Bằng phương pháp hóa mô miễn dịch, 3 loại mô đích của GAV ở tôm chân trắng đã được xác định là mô liên kết, biểu mô và mô tim. Đã có hàng loạt các cơ quan đích của GAV ở loài tôm chân trắng cũng đã được phát hiện như: mang, gan tụy, cơ quan lympho, cơ quan tạo máu, dạ dày, ruột tịt, tuyến sinh dục, hạch thần kinh, tuyến anten và phần phụ. Từ khóa: Gill-associated virus, tôm chân trắ ng, cơ quan đí ch, virus bệ nh đầ u và ng nhó m 2 ABSTRACT White leg shrimp (Litopenaeus vannamei) was imported into Ghent university (Belgium) from Thailand, the shrimp was free from some specì ic pathogens (Specifi c pathogen free - SPF), reared in a recirculating water system at the environmental conditions such as temperature 28 ± 100C, pH: 7.8 to 8.1 and 35 ppt salinity. When the shrimp reached 15-20 g/individual, they was infected a GAV strain (YHV type 2), isolated from black tiger shrimp (Penaeus monodon) cultured in Australia, by intranmuscular injection administration. After 7 days, no experimental shrimp died, but 20% of the GAV infected shrimp showed some abnormal signs such as anorexia, empty gut, soft shell. By immunohistochemistry method, 3 types of target tissues của GAV in Litopenaeus vannamei have been identifi ed as connective, epithelial and cardiac tissue. In addition, a series of GAV target organs in the infected shrimp were also found, such as gills, hepatopancreas, lymphoid organ, hematopoietic organ, stomach, intestine, gonad, ganglion, antennae and appendages. Keywords: Gill-associated virus, GAV, Yellow head virus type 2, whiteleg shrimp, pathogenesis 1 ThS. Nguyễn Thị Thùy Giang: Viện Nuôi trồng thủy sản – Trường Đại học Nha Trang THOÂNG BAÙO KHOA HOÏC I. ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh đầu vàng (YHD) do yellow head virus (YHV) gây ra ở tôm sú (Penaeus monodon) đã được phát hiện lần đầu tiên tại Thái Lan năm 1991, sau đó lan ra các quốc gia khác như: Trung Quốc, Philipine, Indonessia, Srilanka và Đài Loan gây ra những thiệt hại lớn cho ngành công nghiệp nuôi tôm của châu Á (OIE, 2009). Đến năm 2008, có ít nhất 6 type của YHV đã được xác định, trong đó chỉ có YHV type 1 và YHV type 2 đã được biết gây bệnh và chế t ở tôm he. YHV type 1 chính là tác nhân gây ra bệnh đầu vàng (YHD) ở tôm sú (P. monodon) ở Thái Lan, tôm bệnh có dấu hiệu chính là phần đầu ngực của tôm chuyển màu vàng, gan và mang cũng có mầu vàng và tỷ lệ chết cao (Lightner, 1996; Wijegoonawamdane et al., 2008). Năm 1996, YHV type 2 đã được thông báo gây ra bệnh ở giai đoạn ấ u niên và trưởng thành của tôm sú nuôi trong các trang trại nuôi của Úc, gây ra tỷ lệ chết tới 100% (Spann et al., 1997). Bệnh này có các dấu hiệu khác với bệnh YHD đã được thông báo ở châu Á như: có màu đỏ ở phần đầu ngực và đuôi, mang tôm bệnh chuyển sang màu vàng, nâu Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 1/2014 14 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG hoặc đỏ. Do vậy, virus YHV type 2 còn có tên là Gill-associated virus (GAV). Gần đây, GAV đã được phá t hiệ n vớ i tỷ lệ cao (100%) trong quần đàn tôm sú nuôi tại Úc (Cowley et al., 2004, 2009 và Walker et al., 2001) và được cho rằng GAV cù ng với các virus khác như IHHNV và MoV có liên quan đế n hội chứng chết giữa vụ nuôi (Mid-crop mortality syndrome - MCMS) ở tôm sú (Oanh et al., 2011). Loài tôm chân trắng (L. vannamei) đã được di nhập từ Nam Mỹ vào nuôi rộng rãi ở nhiều quốc gia trên thế giới, đặc biệt là châu Á, góp phần làm tăng đáng kể sản lượng tôm nuôi của thế giới. Nghiên cứu này là một nội dung trong dự án nghiên cứu khả năng gây bệnh của GAV (YHV type 2) ở loài tôm chân trắng (L.vannamei) trong điều kiện thí nghiệm. II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Địa điểm nghiên cứu - Phòng Virus học của Khoa Thú y, Trường Đại học Ghent (Vương quốc Bỉ). - Phòng Thực nghiệm ướt của Khoa Thú y, Trường Đại học Ghent (Vương quốc Bỉ). 2. Vật liệu 2.1. Tôm chân trắng khỏe dùng cho thí nghiệm Hậu ấu trùng (postlavae) của dòng tôm chân trắng Litopenaeus vannamei không bị nhiễm các loại virus nguy hiểm như: WSSV, TS IHHN, IMN và YHV, được nhập về Trường Ghent (Vương quốc Bỉ) từ Thái Lan, được ương nuôi trong hệ thống nước tuần hoàn ở điệu kiện môi trường có nhiệt độ 28 ± 10C, pH: 7,8-8,1 và độ mặn 35 ppt. 2.2. Chủng virus GAV (YHV type 2) Một chủng GAV (hay còn gọi là YHV type 2) được cung cấp bởi Viện Nông nghiệp Nhiệt đới (CSIRO) của Úc, chủng virus này đã được phần lập từ tôm sú (Penaeus monodon) nuôi bị nhiễm GAV tại quốc gia này- AUS-96-Ref strain of GAV. 2.3. Tạo nguồn virus dùng cho thí nghiệm (virus stock) Chủng virus GAV nhận được từ Úc được pha loãng 10 lần trong phosphate buffer saline (PBS) để tạo nên PBS-GAV gốc. 50 µl PBS-GAV gốc được tiêm vào cơ của mỗi cá thể tôm chân trắng (15-20 g/con với n = 25 con). Tôm đã tiêm dịch virus được nuôi trong điều kiện nhiệt độ 27 ± 10C, độ mặn 35 ppt, để virus có thể nhân bản trong cơ thể của tôm. Sau thời gian 5 ngày, những con tôm chân trắng đã bị nhiễm GAV được thu và bảo quản ở nhiệt độ đông sâu (-700C). Khi cần, xả đông tôm ở nhiệt độ phòng, dùng phanh và kéo vô trùng cắt bỏ giáp đầu ngực của tôm. Mô của tôm được nghiền đồng nhất bằng máy nghiền đồng thể, trong PBS đã pha loãng 10 lần, tỷ lệ giữa mô tôm và PBS pha loãng là 1/10. Hỗn hợp này được ly tâm bằng máy ly tâm lạnh (ở 400C, 5500 vòng /phút, trong 20 phút). Phần dịch nổi sau ly tâm được lọc qua màng 0,45 µm (có hỗ trợ bởi máy hút chân không). Dịch dưới lọc chính là virus stock, được giữ trong một cốc vô trùng và bảo quản ở nhiệt độ đông sâu -7000C cho đến khi thí nghiệm được triển khai. 2.4. Kháng thể đơn dòng (Mab) để xác định kháng nguyên của YHV trong kỹ thuật hóa mô miễ n dịch Mab Y19 là kháng thể đơn dòng kháng lại 20 kDa nucleoprotein p20 của YHCV (Sithigorngul et al, 2002) đã được cung cấp từ Phòng Sinh vật học, Khoa Khoa học, thuộc Đại học Srinakharinwirot, Bangkok, Thái Lan. 2.5. Các mẫu tôm chân trắng đã dương tính với GAV Các mẫu tôm này được thu trực tiếp từ các thí nghiệm cảm nhiễm GAV vào tôm khỏe. Sau cảm nhiễm, tôm chân trắng đã không bộc lộ những dấu hiệu đặc thù của bệnh đầu vàng (YHD), nên 100% số tôm ở bể thí nghiệm và bể đối chứng đã được thu để làm mẫu vật cho các nghiên cứu xác định mô đích và cơ quan đích của GAV ở tôm chân trắng. 2.6. Khá ng thể thứ cấ p Biotinylated sheep anti-mouse IgG antibody (RPN1001 Amersham Biosciences, UK) Đượ c sử dụ ng như khá ng thể thứ cấ p trong phương phá p mô hó a miễ n dị ch. Khá ng thể chiế t xuấ t từ cừ u đượ c gắ n Biotin nà y sẽ tạ o nên phả n ứ ng đặ c hiệ u vớ i Immunoglobulin củ a khá ng thể sơ cấ p Mab Y19. Khá ng thể nà y tiế p tụ c sẽ đượ c nhậ n biế t bở i phứ c hợ p chứ a enzyme Streptavidine biotinylated horseradish peroxidase complex (RPN1051 Amersham Biosciences, UK) theo mố i gắ n kế t Biotin - strepavidine trong bướ c tiế p theo củ a phương phá p mô hó a miễ n dị ch. 3. Thiết kế thí nghiệm Tôm chân trắng (L.vannamei) có kích cỡ 15-20 g/con, thuộc dòng tôm không bị nhiễm các loại virus đặc thù (SPF), được dùng cho thí nghiệm cảm nhiễm virus với mục đích xác định các loại mô đích và cơ quan đích của GAV ở loài tôm chân trắng. Dịch virus stock (chứa GAV trong PBS - làm từ tôm chân trắng bị nhiễm GAV ở điều kiện thí nghiệm như đã mô tả ở mục 2.2.) được lấy ra khỏi tủ đông, pha loãng với PBS theo tỷ lệ 1:3 (có pH = 7,4). Dịch virus này được tiêm vào cơ bụng của 30 con tôm khỏe với liều 50 µl/con tôm và 10 con tôm khỏe khác ở nghiệm thức đối chứng được tiêm dung dịch PBS vào cơ với liều 50 µl/con tôm. Sau cảm nhiễm, tôm thí nghiệm và đối chứng được nuôi dưỡng tách biệt trong hai bể kính có thể tích 100 lít với nước biển nhân tạo có độ mặn 35 ppt và nhiệt độ nước 27 ± 10C, sục khí liên tục ngày đêm. Quan sát các biến đổi bệnh lý của tôm thí nghiệm trong 7 ngày sau cảm nhiễm. Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 1/2014 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 15 Đến ngày thứ 7, tôm ở bể thí nghiệm và bể đối chứng được thu, được cố định bằng cách tiêm 2 ml dung dịch Davidson vào phần đầu ngực và phần bụng của mỗi con tôm, sau đó cố định mẫu tôm này trong dung dịch Davidson với tỷ lệ về thể tích là 1:10. Sau 48h các mẫu này được chuyển sang cồn ethanol 50% để bảo quản cho đến khi được đưa vào phân tích tiếp theo bằng phương pháp hóa mô miễn dịch. 4. Phương pháp phân tích mẫu tôm Phương pháp hóa mô miễn dịch (Immunohistochemistry - IHC) Phương pháp hóa mô miễn dịch (IHC) được giới thiệu bởi Sithrigorngul et al (2000) và Escobedo-Bonilla et al (2007) được sử dụng trong nghiên cứu này để xác định các loại mô đích và cơ quan đích của GAV khi virus này cảm nhiễm vào tôm chân trắng bằng phương pháp tiêm cơ. Các bước thực hiện được mô tả như sau: - Các tiêu bản đã được gắn với các lát cắt của mô tôm được bảo quản ở 550C, trong 30 phút. - Tiếp theo các tiêu bản này được làm mất parafi n và no nước bằng cách đặt các lam mẫu trong xilen và cồn ethanol có nồng độ giảm dần: 100%, 95%, 70% và 50%, trong 5 phút cho mỗi bước thực hiện. Sau đó các lam mẫu được rửa trong dung dịch đệm Tris - có muối ăn (NaCL), trong 5 phút. - Ủ các lam mẫu này trong dung dịch gồm: 1% sodium azide và 0,02% hydrogen peroxidase trong dung địch đệm Tris có pH = 7,4. - Tiếp tục các lam mẫu này được ủ với kháng thể sơ cấp Y19 với độ pha loãng 1/200, ở nhiệt độ 370C, trong thời gian 1 giờ, sau đó các lam mẫu được rửa trong dung dịch Tris-có muối (NaCl). - Tiếp tục các slides mẫu được ủ tiếp kháng thể thứ cấ p, biotinylated sheep antimouse IgG antibody, trong 1 giờ ở nhiệt độ 370C. - Các lam mẫu lại được rửa một lần nữa với đệm Tris-NaCl trước khi ủ với dung dịch streptavidine biotinyllated horseradish peroxidase (RPN1051, Amersham Biosciences - Anh) ở độ pha loãng 1/200, trong 30 phút ở nhiệt độ phòng. - Phát triển màu cho các mẫu mô được làm với 0,01% của 3, 3’- diaminobenzidine - DAB (D8001 Sigma-Aldrich, Đức) trong đệm Tris không có NaCl, trong 10 - 15 phút. - Các lam mẫu được nhuộm với hematoxylin, sau đó rửa, làm mất nước trong cồn ethanol, làm trong mẫu trong xilen và đậy mẫu bằng lamel với keo dán kính. - Quan sát các lam mẫu này dưới kính hiển vi quang học. Các vùng mô dương tính với GAV (YHV type 2) thể hiện có màu nâu, khác biệt với các vùng mô âm tính có màu xanh đen của hematoxylin. III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 1. Dấu hiệu bệnh ở tôm chân trắng khi bị nhiễm GAV Như đã trình bày ở mục 2.3 (trang 2), tôm chân trắng cỡ 15 - 20 g/con được cảm nhiễm dịch virus stock bằng phương pháp tiêm cơ với liều 50 µl/con. Bả y ngày sau cảm nhiễm, có khoảng 20% những con tôm chân trắng bị nhiễm GAV trong thí nghiệm này đã bộc lộ một số dấu hiệu khác với tôm ở nghiệm thức đối chứng như: bỏ ăn nên đường ruột rỗng, vỏ mềm, cơ thể có mầu nhợt nhạt, đặc biệt ở phần ở giáp đầu ngực (hình 1). Tuy nhiên, tất cả những con tôm chân trắng thí nghiệ m bị cảm nhiễm GAV đều còn sống và không bộc lộ các dấu hiệu đặc trưng của bệnh đầu vàng (YHD) do virus YHV type 1 ở tôm sú (P. monodon) như thông báo của nhiều tác giả (Wijegoonawamdane et al., 2008; Lightner et al., 1996), và cũng không xuất hiện các dấu hiệu như tôm sú ở Úc bị nhiễm GAV theo thông báo của Spann et al. (1997). Hình 1. Một số dấu hiệu bộc lộ ở tôm chân trắng khi bị nhiễm GAV (YHV type 2) a. Tôm bị nhiễm GAV (ở trên) có ruột rỗng do bỏ ăn so với tôm ở nhóm đối chứng (ở dưới) b. Tôm nhiễm GAV (ở trên) có cơ thể nhợt nhạt, đặc biệt ở phần đầu ngực so với tôm ở nhóm đối chứng (ở dưới) 2. Xác định các loại mô đích của GAV ở tôm chân trắng Bằng phương pháp hóa mô miễn dịch, đã xác định được rằng, tôm chân trắng bị nhiễm GAV (YHV type 2) đã thể hiện bệnh lý không đặc thù củ a tôm sú bị nhiễm loại virus này như: phầ n giá p đầ u ngự c có mà u và ng hay cơ thể có mà u hồ ng đỏ . Tuy nhiên, sự cảm nhiễm và sao chép của virus này trong tế bào đã được phát hiện thấy ở 3 loại mô cơ bản của tôm: mô liên kết, biểu mô và mô tim (hình 2). Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 1/2014 16 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG Hình 2. Các loại mô đích của GAV khi cảm nhiễm vào tôm chân trắng bằng cách tiêm cơ Biểu mô (a & b); mô liên kết (c & d); mô tim (e) (Chú thích: các vùng mô có màu nâu thể hiện nhiễm GAV; Độ phóng đại 200-400x) 3. Xác định các cơ quan đích của GAV ở tôm chân trắng Ở mục III.2 đã xác định được 3 loại mô cơ bản ở tôm chân trắng là mô đích của GAV, nên hàng loạt các cơ quan nội tạng khác nhau của loài tôm này đã được xác định là cơ quan đích của virus này (hình 3). Dưới kính hiển vi quang học, sắc tố màu nâu - thể hiện sự tồn tại kháng nguyên của GAV- được quan sát thấy rõ ràng ở nhiều nội quan khác nhau của tôm bị cả m nhiễ m, là căn cứ để xác định cơ quan đích của GAV (YHV type 2) ở tôm chân trắng (hình 3). Phả n ứ ng dương tí nh vớ i GAV đượ c tì m thấ y ở cơ quan lympho ở 100% tôm bị cả m nhiễ m virus. Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 1/2014 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 17 Hình 3. Cá c cơ quan đích của GAV ở tôm chân trắng bị cả m nhiễ m Ruột tịt (a, b); Cơ quan tạo máu (c, d); Cơ quan lympho (e, f); Hạch thần kinh (g, h); Thành của mạch máu (i, k); Mang (l, m); Cơ quan sinh dục (n, o); Gan tụy (p, q ) và dạ dày (r, s); Tuyến angten (t, u); Tim (v, w) và Biểu mô của phụ bộ (x, y) (Chú thích: Virus nhiễm thể hiện ở các vùng mô có màu nâu; mẫu mô được nhuộm IHC; độ phóng đại 200x và 400x) 4. Thảo luận Như đã trình bày ở trên, khi cảm nhiễm virus GAV (YHV type 2) vào cơ thể tôm chân trắng (L.vannamei) bằng phương pháp tiêm cơ, sau 7 ngày cảm nhiễm, tôm thí nghiệm không có hiện tượng chết và các dấu hiệu bệnh bộc lộ không thật sự rõ ràng như đã được thông báo ở tôm sú (P. monodon) khi nhiễm GAV (Spann et al., 1997), hay tôm sú nhiễm chủng YHV type 1 (Lightner, 1996, Flegel, 2005). Kế t quả củ a thí nghiệ m nà y hoà n toà n khá c vớ i nhữ ng bá o cá o đã đượ c thông bá o trướ c đây, ví dụ như Tang et al (2002) thông bá o rằ ng GAV có khả năng gây bệ nh và chế t cho tôm chân trắ ng (1-2g) vớ i tỷ lệ chế t gầ n 70% sau 14 ngà y thí nghiệ m. Tuy nhiên, bằng phương pháp hóa mô miễn dịch (IHC) đã chứng tỏ rằng, GAV (YHV type 2) đã cảm nhiễm và sao chép trong tế bào của 3 loại mô cơ bản ở tôm chân trắng khi bị cảm nhiễm virus này là: Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 1/2014 18 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG mô liên kết, mô biể u bì và mô tim. Đó là lý do làm một loạt các cơ quan khác nhau của tôm chân trắng đã trở thành cơ quan đích của GAV như: mang, gan tụy, cơ quan lympho, tim, dạ dày, ruột tịt, tuyến sinh dục, cơ quan tạo máu, thành mạch máu, hạch thân kinh, tuyến angten, phụ bộ đều thể hiện nhiễm GAV ở các mức độ nặng, nhẹ khác nhau. Kết quả nghiên cứu này cũng thể hiện rằng, sau 7 ngày bị cảm nhiễm GAV bằng phương pháp tiêm cơ, chỉ có 20% tôm chân trắng thí nghiệm có dấu hiệu bệnh như đã mô tả ở mục 3.1, 80% tôm còn lại đã không thể hiện dấu hiệu gì bất thường mặc dù GAV vẫn xâm nhiễm vào tế bào của nhiều cơ quan khác nhau ở những con tôm này. Kế t quả nà y đã thể hiện rằng, tôm chân trắng có khả năng chịu đựng với virus GAV cao hơn so với tôm sú (P. monodon), vì theo Spann et al. (1997) đã thông báo rằng, khi GAV cảm nhiễm vào tôm sú nuôi trong các trang trại của Úc đã gây ra tỷ lệ chết tới 100% quần đàn tôm. Kế t quả nà y cũ ng cho thấ y rắ ng GAV hay YHV type 2 có tí nh độ c lự c yế u hơn so vớ i YHV type 1 khi cả m nhiễ m trên tôm chân trắ ng. Vì khi cả m nhiễ m vớ i YHV type 1, 100% tôm chân trắ ng chế t sau 5 ngà y tiêm (Anantasomboom et al, 2008), thậ m chí vớ i liề u tiêm đã pha loã ng 10-10 lầ n (Sittidilokratna et al, 2009). IV. KẾT LUẬN Sau 7 ngày tôm chân trắng (L. vannamei) bị cảm nhiễm GAV (hay còn gọi là YHV type 2) bằng phương pháp tiêm cơ, đã không phát hiện tôm nhiễm virus bị chết, nhưng có 20% tôm trong bể thí nghiệm bộc lộ một số dấu hiệu bất thường như: ruột rỗng do bỏ ăn, cơ thể có màu sắc nhợt nhạt, đặc biệt là phần đầu ngực, một vài con bị mềm vỏ. Có 3 loại mô cơ bản ở tôm chân trắng đã được xác định là mô đích của GAV là: mô tim, mô liên kết và biểu mô. Có nhiều cơ quan trong cơ thể tôm chân trắng là cơ quan đích của GAV như: mang, gan tụy, cơ quan lympho, dạ dày, cơ quan tạo máu, ruột tịt, tuyến sinh dục, anten, các phụ bộ, hạch thân kinh, tim và thành của mạch máu. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Anantasomboon, G., Poonkhum, R., Sittidilokratna, N., Flegel, T. W., and Withyachumnarnkul, B., 2008. Low Viral Loads and Lymphoid Organ Spheroids Are Associated with Yellow Head Virus (Yhv) Tolerance in Whiteleg Shrimp Penaeus Vannamei. Developmental & amp; Comparative Immunology, 32: 613-626. 2. Cowley, J. A., Cadogan, L. C , Wongteerasupaya, C , Hodgson, R. A. J. , Boonsaeng, V. and P. J. Walke, 2004. Multiplex RT-nested PCR differentiation of gill-associated virus (Australia) from yellow head virus (Thailand) of Penaeus monodon. Journal of Virological Methods, 117: 49-59. 3. Cowley, J. A, Coman, G. J., Salmon, M. L, Young, N. D, Rajendran, K. V, Wilson, K. J and N. P. Preston, 2009. In situ stress testing to identify Australian black tiger prawns (Penaeus monodon) free of gill-associated virus and Mourilyan virus. Australian Veterinary Journal, 87: 244-248. 4. Escobedo-Bonilla C.M., Wille M., Alday-Sanz V., Sorgeloos P., Pensaert M.B. & Nauwynck H.J., 2007. Pathogenesis of a Thai strain of white spot syndrome virus (WSSV) in SPF Litopenaeus vannamei. Diseases of Aquatic Organisms 74: 85–94. 5. Lightner, D.V., 1996. A handbook of shrimp pathology and diagnostic procedures for diseases of cultured Penaeid shrimp. Baton Rouge, Louisiana, USA. The World Aquaculture Society 6. OIE, 2009. Yellow Head Disease-YHD. Manual of Diagnostic tests for Aquatic animals. OIE, Paris: 152-165. 7. Oanh, D. T. H., van Hulten, M. C. W., Cowley, J. A., and Walker, P. J., 2011. Pathogenicity of Gill-Associated Virus and Mourilyan Virus During Mixed Infections of Black Tiger Shrimp (Penaeus Monodon). Journal of General Virology, 92: 893-901. 8. Spann, K. M., Cowley, J. A., Walker, P. J., and Lester, R. J. G., 1997. A Yellow-Head Like Virus from Penaeus Monodon Cultured in Australia. Diseases of Aquatic Organisms, 31: 169-179. 9. Sithigorngul, P., P. Chauychuwong, W. Sithigorngul, S. Longyant, P Chaivisuthangkura, P. Menasveta, 2000. Development of a Monoclonal Antibody Specifi c to Yellow Head Virus (YHV) from Penaeus Monodon. Diseases of Aquatic Organisms, 42: 27-34. 10. Sittidilokratna N, Chotwiwatthanakun C, Wijegoonawardane PK, Unajak S, Boonnad A, Wangnai W, Jitrapakdee S, Cowley JA, Walker PJ, 2009. A virulent isolate of yellow head nidovirus contains a deformed envelope glycoprotein gp116. Virology. 2009 Feb 5; 384 (1):192-200. 11. Walker, P.J., Cowley, J.A., Spann, K.M., Hodgson, R.A.J., Hall, M.R., Withyachumnarnkul, B., 2001. Yellow head complex viruses: transmission cycles and topographical distribution in the Asia-Pacifi c region. In: Browdy, C.L., Jory, D.E. (Eds.). The New Wave, Proceedings of the Special Session on Sustainable Shrimp Farming. The World Aquaculture Society, Baton Rouge, Louisiana: 227– 237. 12. Wijegoonawardane, P.K, Cowley, J.A, Phan, T., Hodgson, R.A, Nielsen, L, Kiatpathomchai, W, Walker, P.J., 2008. Genetic Diversity in the Yellow Head Nidovirus Complex. Virology, 380: 213-225.