Cơ chế di truyền

Chương II: CƠ SỞ VẬT CHẤT VÀ CƠ CHẾ DI TRUYỀN Ở CẤP ĐỘ PHÂN TỬ *** I. ACID NUCLEIC LÀ VẬT CHẤT DI TRUYỀN Ở CẤP ĐỘ PHÂN TỬ 1. Tiêu chuẩn của VCDT VCDT phải có đủ 3 tính chất: 1/ Mang thông tin DT đặc trưng cho loài Phương thức mã hóa dựa trên nguyên tắc: số lượng, thành phần, trình tự sắp xếp của các nucletotide trên gen cấu trúc sẽ quy định số lượng, thành phần, trình tự sắp xếp của các aa trên chuỗi polypeptide tương ứng. Các gen trong hệ gen không hoạt động đồng loạt và liên tục. Đó là cơ chế điều hòa biểu hiện gen. 2/ Có khả năng tái bản: VCDT phải có khả năng hình thành các bản sao, chứa đầy đủ thông tin DT Prokaryote: phân bào trực phân Eukaryote: phân bào gián phân: phân chia nguyên nhiễm (nguyên phân) và phân chia giảm nhiễm (giảm phân). Akaryote: nhân lên hàng loạt trong TB ký chủ, 5 gđ trong chu trình gây độc: hấp phụ, xâm nhập, tổng hợp (bao hàm sự tái bản VCDT cho thế hệ sau), lắp ráp, phóng thích. 3/ Có khả năng biến đổi 2. Chứng minh acid nucleic là VC mang TTDT a/ Hiện thương Biến nạp (transformation) Griffith dùng 2 chủng vi khuẩn (khác nhau về hình dạng khuẩn lạc và độc tính): Chủng S (mooth): độc, khuẩn lạc nhẵn, láng (vỏ nhày= polysaccharide) Chủng R (rough), không độc, khuẩn lạc sần, không vỏ nhày. Lần lượt tiêm các trường hợp sau vào chuột, ta thu được kết quả: 1. Tiêm R Sống 2. Tiêm S sống Chết 3. Tiêm S chết Sống 4. Tiêm s chết và R sống Chết * Nhận xét: Ở TH 4, những mảnh vỡ TB từ chủng S bị đun sôi đã biến đổi các VK R sống trở thành các VK S sống. Hiện tượng này gọi là Biến nạp. Bản thân các polysaccharide không gây biến nạp TB R. Vỏ nhày chỉ là 1 biểu hiện kiểu hình của độc tính. DNA chính là yêu tố xác định đặc tính vỏ polysaccharide, từ đó xác định đặc tính gây bệnh. b/ Thí nghiệm của Hershey - Chase 32P đánh dấu DNA của 1 nhóm phage T2. 35S đánh dấu protein của 1 nhóm phage T2 khác. Dùng 2 nhóm phage này cho nhiễm riêng rẽ vào E. coli với số lượng virus lớn. Sau đó, dùng lực khuấy để tách vỏ virus, sử dụng pp ly tâm để tách riêng vỏ virus với TB VK rồi phân tích phóng xạ. * Kết quả: Nhóm phage đánh dấu = 32P: trong TB VK có chứa chất phóng xạà chứng tỏ: DNA của phage đã vào trong VK Nhóm phage đánh dấu = 35S: chất phóng xạ nằm trong phần vỏ virus còn lại. è Protein vỏ của phage không xâm nhập TB VK mà chỉ có DNA của phage được nạp vào. Phân tử DNA này giúp sinh sản ra thế hệ phage mới. Như vậy, DNA chính là vật liệu DT của phage. c/ RNA cũng là VCDT Cấu tạo chính của phần lớn virus ký sinh thực vật gồm: vỏ bằng protein và phần lõi RNA. VD: virus khảm thuốc lá TMV, HRV,… xâm nhập vào TB lá khiến diệp lục tố bị phân hủy, gây ra những đốm màu trên lá. * Thí nghiệm: Dùng RNA của HRV kết hợp với protein của TMV tạo ra virus ghép, cấy vào trong cây thuốc lá lành thấy cây bị nhiễm bệnh với triệu chứng bệnh của HRV è RNA chính là CSVT của sự DT, còn protein chỉ đóng vai trò vỏ bọc hỗ trợ. II. THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ CẤU TRÚC CỦA ACID NUCLEIC 1. Thành phần hóa học của acid nucleic a/ Nucleic – đơn phân của acid nucleic * Bazo Các bazo của DNA và RNA có cấu trúc dị vòng thơm. Các purin có cấu trúc 2 vòng: adenine (A) và guanine (G). Các pyrimidine có cấu trúc 1 vòng: cytosine (C), thymine (T) và uracil (U) Trong RNA, T thay = U. Thymine = 5-methyluracil * Nucleoside Trong các acid nucleic, nucleoside được tạo thành bởi: bazo (purin ở N9, pyrimidine ở N1) liên kết hóa trị với đường pentose ở vị trí C1. Ở RNA, đường pentose là ribose. Ở DNA là 2’-deoxyribose. Liên kết giữa bazo và đường gọi là liên kết glycosyl (hay glycosid). * Nucleotide Một nucleotide: một nucleoside cùng với 1 hay nhiều nhóm photphate nối ở vị trí 3’, 5’ hoặc 2’ ( 2’ chỉ có ở đường ribose). * Liên kết phosphodiester Mỗi photphate liên kết hóa trị với một pentose ở vị trí 5’ và một pentose kế tiếp ở vị trí 3’ tạo thành liên kết 3’,5’-phosphodiester. Ở pH trung tính, mỗi phosphate đều chức điện tích âmè acid nucleic là nhưng polymer mang điện tích âm. * Trình tự DNA/RNA (SGK/20) 2. Cấu trúc không gian của acid nucleic (SGK/20-24) III. TÁI BẢN DNA 1. Các nguyên tắc và đặc điểm chung của tái bản DNA a/ Sự tái bản DNA theo cơ chế bán bảo tồn Trong chuỗi xoắn kép DNA, 2 mạch đơn liên kết với nhau bằng 1 quan hệ bổ sung. Trong quá trình tái bản, nếu 2 mạch đơn tách rời nhau và mỗi mạch đơn được dùng làm khuôn để tổng hợp nên một mạch mới theo nguyên tắc bổ sung thì kết quả là: từ 1 phân tử DNA ban đầu đã tạo được 2 phân tử mới giống hệt nhau. Vì trong mỗi phân tử DNA con đều mang một mạch cũ và một mạch mới nên kiểu tái bản này được gọi là bán bảo tồn * Thí nghiệm chứng minh cơ chế bán bảo tồn (E. coli) Nuôi E. coli trong môi trường có nguồn N15, TB sử dụng N15 để tổng hợp DNA cho đến khi DNA của VK đều mang đồng vị nặng N14. Cách khoảng thời gian đều đặn tương ứng với mỗi đợt phân bào, lấy các TB đem chiết tách DNA. Bằng pp ly tâm trong gradient tỉ trọng CsCl, các loại DNA nặng, nhẹ và lai được tách ra, kết quả phân tích phù hợp với kiểu tái bản bán bảo tồn. b/ Cơ chế phân tử của quá trình tái bản DNA (THUỘC) Các liên kết H ổn định cấu trúc xoắn và liên kết 2 mạch đơn với nhau phải được phá vỡ để tách rời 2 mạch. Phải có đoạn mồi (primer) (đoạn DNA/RNA ngắn) bắt cặp bổ sung với mạch khuôn để tạo đầu 3’OH tự do. Nguyên liệu tổng hợp DNA là các desoxynucleosid 5’-triphosphate (dNTPs):dATP, dGTP, dCTP, dTTP. Mạch khuôn luôn được đọc theo chiều 3’-5’ trong khi mạch mới được tổng hợp theo chiều 5’-3’. Mỗi nucleotide mới được gắn vào đầu 3’OH của mạch đang kéo dài = liên kết CHT. Mỗi bước được thực hiện một cách nhanh chóng , chính xác dưới sự điều khiển của enzyme đặc hiệu. c/ Đơn vị tái bản, điểm khởi đầu và điểm kết thúc tái bản Mỗi đoạn DNA được tái bản như một đơn vị riêng lẻ được gọi là một đơn vị tái bản. Các DNA vòng, kích thước nhỏ chỉ gồm một đơn vị tái bản duy nhất. Sự tái bản khởi đầu từ một điểm được gọi là điểm khởi đầu sao chép và lan ra theo 2 hướng, hình thành 2 chạc ba tái bản cho đến khi gặp nhau tại điểm kết thúc. Điểm khởi đầu tái bản có khuynh hướng giàu A-T để dễ dàng khởi đầu tách rời 2 mạch đơn. Ở Eukaryote, mỗi phân tử DNA bao gồm nhiều đơn vị tái bản. d/ Sự tổng hợp mạch mới của DNA xảy ra liên tục trên một mạch và gián đoạn trên mạch kia Cơ chế tái bản DNA chỉ cho phép sự tổng hợp theo hướng 5’-3’, vì thế trên 2 mạch khuôn có hướng ngược nhau, sự tổng hợp mạch mới không diễn tiến giống nhau. Từ điểm khởi đầu tái bản, trên mạch khuôn 3’-5’ sự tổng hợp mạch mới diễn ra một cách liên tục theo chiều 5’-3’ cùng chiêu với hướng tháo xoắn. Mạch này được gọi là mạch tới. Trong khi đó trên mạch khuôn 5’-3’, sự tổng hợp mạch mới cũng diễn ra theo hướng 5’-3’ nhưng ngược với hướng tháo xoắn. Do đó, sự tổng hợp mạch mới không xảy ra liên tục mà dưới dạng những đoạn ngắn gọi là đoạn Okazaki (1000-2000 bp ở proka, 100-200 ở euka). Mạch này được gọi là mạch chậm. Trên thực tế, sự tổng hợp 2 mạch theo cùng hướng vì mạch khuôn chậm được uốn vòng để quay 180o tại chạc ba tái bản, cùng hướng với mạch khuôn tới. e/ Mồi RNA Mạch tới và tất cả những đoạn Okazaki của mạch chậm chỉ có thể được tổng hợp = cách kéo dài một mồi đã bắt cặp sẵn trên mạch khuôn. Mồi là một đoạn RNA ngắn, dược tổng hợp bởi 1 phức hợp protein gọi là primosome, primome gồm nhiều protein và 1 enzyme primase. Các mồi RNA sau đó bị phân hủy bởi Rnase và được thay = trình tự DNA nhờ DNA polymerase. Enzyme ligase sẽ nối các đoạn DNA lại với nhau. 2. Tái bản DNA prokaryote Để theo dõi tái bản DNA, người ta dùng thymidine H3 phóng xạ. Quá trình tái bản xuất phát từ điểm khởi đầu và lan ra 2 phía. Khi quan sát DNA vòng tròn đang tái bản, ta thấy dạng DNA “hình con mắt”. 2 chạc ba tái bản lan dần, cuối cùng tạo thành 2 phân tử DNA lai, trong đó có 1 mạch mang dấu phóng xạ T-H3. Có trường hợp, sự tái bản chỉ xảy ra về 1 phía. Giai đoạn Diễn biến Enzyme Khởi đầu 1. Tháo xoắn phân tử DNA - Enzyme topoisomerase tháo xoắn phân tử DNA. - Enzyme topoisomerase loại I tháo dạng siêu xoắn, gắn vào phân tử DNA và cắt 1 trong 2 mạch. - Sau khi giải phóng 1 phân tử DNA đã được tháo xoắn , các enzyme này sẽ nối lại chỗ đứt. - Enzyme topoisomerase loại II tháo các nút nảy sinh do các biến đổi cấu trúc của chuỗi xoăn kép = cách cắt đứt cả 2 mạch DNA. - topoisomerase (có 2 loại I và II). - topoisomerase loại I. Enzyme loại I được biết rõ nhất là protein w của E. coli. - topoisomerase loại II. Enzyme loại II được biết rõ nhất là gyrase của E. coli. 2. Tách rời 2 mạch khuôn tại điểm khởi đầu tái bản - Ở E. coli chứa 4 vị trí gắn với protein khởi đầu có tên là Dna A, mỗi vị trí có kích thước là 9 bp. - Sự tổng hợp các protein khởi đầu gắn liền với tốc độ tăng trưởng vì thế việc khởi đầu tái bản DNA cũng gắn liền với tốc đô tăng trưởng. Ở tốc độ tăng trưởng cao, các NST của VK có thể bắt đầu lần tái bản thứ 2 trước khi lần tái bản thứ nhất kết thúc tại 2 điểm khởi đầu mới. Vì thế, mỗi TB con nhận được 1 NST đang được tái bản 1 phần. - DNA OriC quấn quanh 1 phức hợp protein Dna A gồm 30-40 phân tử, mỗi phân tử gắn với 1 ATP, thúc đẩy sự tách rời 2 mạch tại 3 trình tự lặp 13 bp giàu A-T nằm gân đó, cho phép protein Dna B gắn vào. - Các mạch tách rời sẽ được ổn định dưới dạng mạch đơn nhở các protein SSB . Mạch khuôn được sử dụng đến đâu thì các protein SSB được giải phóng khỏi khuôn đến đó. - protein Dna A. - protein Dna B. Dna B là 1 DNA helicase nằm trong phức hợp primose. Các helicase phá vỡ liên kết H giữa các bazo nhờ NL thủy phân ATP. - protein SSB gắn lên khắp phần mạch đơn làm cho 2 mạch không kết hợp trở lại được. Kéo dài 1. Tổng hợp mồi RNA - Các DNA polymerase chỉ có thể tổng hợp DNA bằng cách kéo dài 1 mồi RNA đã bắt cặp sẵn trên khuôn. Mồi này được tổng hợp nhờ enzyme primase trong phức hợp primose. - DNA polymerase. - primase. 2. Sự tổng hợp mạch mới diễn ra theo kiểu bán gián đoạn , kéo dải mồi RNA - DNA polymerase III bắt đầu tái bản trên mỗi mạch khuôn bằng cách gắn vào mạch (nhờ Đơn vị b) và lắp các nucleotide bổ sung vào vị trí tương ứng, kéo dài đoạn mồi RNA đã bắt cặp sẵn trên khuôn từ đầu 3’OH tự do của mồi (nhờ Đơn vị a). - Các DNA polymerase có tính đặc hiệu cao, chỉ thêm nucleotide vào đầu 3’OH của mạch đang tổng hợp. - Trên đường di chuyển để tổng hợp mạch mới, nếu gặp chỗ nucleotide vừa lắp sai vị trí, DNA polymerase III sử dụng hoạt tính exonuclease 3’-5’ cắt lùi lại để bỏ nucleotide sai và lắp cái đúng vào rồi tiếp tục tái bản (đơn vị e). - Quá trình tái bản ở E. coli diễn ra với tốc độ nhanh, có thể đến 50.000 nucleotide/ phút - DNA polymerase III là 1 phức hợp dimer. Mỗi phần gồm nhiều đơn vị gắn với nhau, chịu trách nhiệm tổng hợp 1 mạch đơn DNA nhằm đảm bảo cho tốc độ tổng hợp của cả 2 mạch = nhau. + Đơn vị a có hoạt tính polymerase thực sự. + Đơn vị e có chức năng đọc sửa nhờ hoạt tính exonuclease 3’-5’. + Đơn vị b giúp gắn polymerase vào DNA. - Đây là nhân tố duy trì quy định độ dài của DNA được tổng hợp ở mạch tới khác với mạch chậm. - Exonuclease là hoạt tính enzyme cắt DNA từ đầu mút một mạch. 3. Hoàn chỉnh sợi mới tổng hợp - Trên mạch chậm, sau khi mỗi đoạn DNA được kéo dài, mồi RNA được dời đi nhờ hoạt tính exonuclease 5’-3’ của DNA polymerase I và bị enzyme Rnase H phân hủy. - Các chỗ trống mà mồi để lại được thay bằng trình tự DNA 1 cách chính xác nhờ kêt hợp hoạt tính polymerase 5’-3’với hoạt tính exonuclease 3’5’ của DNA polymerase I . - Enzyme ligase sẽ nối tất cả các đoạn DNA trên mạch mới tổng hợp lại với nhau. - DNA polymerase I. - Rnase H. - ligase. Giai đoạn kết thúc tái bản và phân chi TB - 2 chạc ba tái bản sẽ gặp nhau ở khoảng 1800 đối diện với OriC. Quanh vùng kết thúc này có vài điểm làm dừng lại sự tái bản bằng cách gắn với 1 sản phẩm của gen tus, đó là 1 nhân tố kìm hãm hoạt động helicase của Dna B. - Khi sự tái bản hoàn tất, 2 phân tử DNA vòng vẫn dính vào nhau. - Một topoisomerase loại II có tên là topoisomerase IV sẽ tách rời chúng để sau đó 2 NST con sẽ được phân phối vào 2 TB con. - gen tus: là 1 nhân tố kìm hãm hoạt động helicase của Dna B. - topoisomerase IV. IV. PHIÊN MÃ 1. Những nguyên tắc và đặc điểm chung của quá trình phiên mã (THUỘC) Quá trình chuyển thông tin di truyền từ DNA sang RNA được gọi là sự phiên mã. RNA được tổng hợp nhờ tác dụng của hệ enzyme RNA polymerase. Sự phiên mã được thực hiện theo các nguyên tắc sau: Vùng DNA chứa gen cần phiên mã phải mở xoắn cục bộ và chỉ 1 trong 2 mạch của phân tử DNA được dùng làm khuôn tổng hợp RNA. Nguyên liệu cho sự tổng hợp là 4 loại ribonucleosid 5’ triphosphate: ATP, GTP, CTP và UTP. Phản ứng trùng hợp RNA diễn ra theo nguyên tắc bổ sung. Sợi RNA được kéo dài theo chiều 5’-3’, ngược với chiều của mạch khuôn. Sự sinh tổng hợp RNA không cần đến mồi. Sản phẩm phiên mã là các RNA sợi đơn. Sự khởi đầu và kết thúc phiên mã phụ thuộc vào các trình tự DNA chuyên biệt nằm ở trước và nằm sau vùng mã hóa. Ở mức độ từng gen riêng biệt, RNA polymerase quyết định việc chọn mạch khuôn bằng cách gắn với phân tử DNA tại một trình tự đặc biệt trên mạch khuôn gọi là promoter. Như vậy, trên phân tử DNA xoắn kép, cả 2 mạch đều có khả năng được chọn làm mạch khuôn cho sự phiên mã, tùy từng gen. 2. Sự phiên mã ở prokaryote a/ RNA polymerase của prokaryote Ở prokaryote, RNA polymerase có cấu trúc bậc 4 rất phức tạp, gồm nhiều đơn vị nối với nhau bởi các liên kết yếu. Một holoenzyme RNA polymeraee của E. coli gồm 2 hợp phần: Nhân tố s Enzyme lõi 2 đơn vị a 1 đơn vị b 1 đơn vị b’ 1 đơn vị w Nhân tố s: Là một hợp phần tách biệt với enzyme lõi Với cấu trúc đặc trưng, nhân tố s giúp cho enzyme lõi nhận biết và gắn đúng với promoter để khởi đầu phiên mã tại vị trí chính xác. Nhiều thí nghiệm cho thấy, nếu thiếu nhân tố s, enzyme lõi sẽ khởi đầu phiên mã một cách tùy tiện tại những vị trí không đặc hiệu. Khi sự phiên mã tiến hành được khoảng 8-9 nt thì nhân tố s được giải phóng khỏi enzyme lõi. Enzyme lõi: đóng vai trò chủ chốt trong việc heo dài phiên mã. Trong đó: Đơn vị a: liên quan đến việc gắn với promoter. Đơn vị b: chịu trách nhiệm khởi đầu và kéo dài phiên mã. Đơn vị b’:liên quan đến việc gắn với khuôn DNA. b/ Các trình tự khởi đầu và kết thúc phiên mã ở prokaryote Đó là những trình tự đặc biệt nằm trên DNA, báo hiệu cho sự khởi đầu và kết thúc phiên mã. Các trình tự được dẫn dưới đây là của sợi đối khuôn (sợi ý nghĩa) 5’-3’ có trình tự giống như trình tự bản mã phiên, chỉ thay đổi T với U. Trình tự khởi đầu Tín hiệu khởi đầu phiên mã là vùng promoter có chứa 2 vị trí đặc hiệu, cho phép RNA polymerase nhận biết, bám vào và khởi đầu phiên mã. Kích thước promoter khoảng trên 40 bp, trong đó có 2 trình tự 6 bp được bảo tồn, quyết định chức năng khởi đầu. Trình tự -35 (trình tự nhận biết) nằm cách điểm khởi đầu phiên mã khoảng 35 nt về trước, thường có trình tự 5’TTGACA3’. Trình tự thứ hai nằm ở vị trí -10 (hộp “TATA” hay “hộp Pribnow”), có trình tự 5’TATAAT3’hoặc tương tự. Điểm khởi đầu phiên , có vị trí +1, hầu như luôn là 1 purine , G phổ biến hơn A. Trình tự kết thúc Tín hiệu kết thúc phiên mã trên DNA là 1 đoạn trình tự đặc biệt nằm sau gen cấu trúc, bao gồm 2 trình tự đối xứng bổ sung giàu GC và 1 loạt 6 cặp AT. Ngay khi được hình thành trên RNA, 2 trình tự đối xứng bổ xung có khả năng tự bắt cặp. hình thành cấu trúc “kẹp tóc”, đình chỉ hoạt động phiên mã. Vùng giàu A-T gồm 6T trên mạch đối khuôn sẽ phiên mã thành 6U nằm ở vùng đuôi RNA. Với một số gen, ngoài trình tự kết thúc, đòi hỏi sự có mặt của 1 protein gọi là nhân tố r. Nhân tố r gồm 6 tiểu đơn vị, gắn với những vị trí đặc hiệu trên sợi đơn RNA. Nhân tố r gắn với một đoạn khoảng 72 nt trên RNA, thủy phân ATP và di chuyển dọc RNA, hướng về phía phức hợp phiên mã. Chức năng của nhân tố r: tách rời enzyme và sợi RNA ra khỏi khuôn DNA. 3. Các giai đoạn của quá trinh phiên mã ơ prokaryote Giai đoạn Diễn biến Enzyme Khởi đầu (tháo xoắn, tách mạch) - Nhân tố s kết hợp với enzyme lõi, giúp cho RNA polymerase nhận biết và gắn vào promoter để khởi đầu phiên mã. + Enzyme nhận biết và gắn lỏng lẻo vào trình tự -35, hình thành “phức hợp đóng”. + Sự gắn kết này trở nên chặc chẽ hơn,”phức hợp đóng” chuyển thành “phức hợp mở”. Một vùng DNA kích thước 17 bp, bắt đầu từ trình tự -10 sẽ được enzyme tháo xoắn và phơi ra sợi đơn DNA dưới dạng tự do để làm khuôn cho sự tổng hợp RNA. - RNA polymerase. Kéo dài - Sau khi RNA polymerase tiến hành phiên mã được 8-9 nt thì nhân tố s tách khỏi phức hợp để có thể tham gia vào một quá trình phiên mã khác. - Sự tách rời nhân tố s là cần thiết cho gđ kéo dài vì sự có mặt của nó sẽ gắn chặt phức hợp enzyme vào promoter khiến enzyme không thể trượt dài theo khuôn DNA để tiến hành sinh tổng hợp. - RNA polymerase lõi tạo thành 1 phức hợp mới gồm 3 hợp phần là polymerase-DNA-RNA mới tổng hợp. - Trong quá trình sinh tổng hợp, RNA polymerase di chuyển và tháo xoắn phân tử DNA 1 cách liên tục trên 1chiều dài khoảng 17 bp, đồng thời tiên hành phản ứng trùng hợp để kéo dài sợi RNA dọc theo sợi khuôn 3’-5’. - Sợi RNA được tổng hợp đến đâu sẽ được tách dần khỏi mạch khuôn DNA đến đó, trừ 1 đoạn khoảng 12 nt bắt đầu từ điểm tăng trưởng vẫn liên kết với DNA. Vùng DNA đã được phiên mã sẽ được RNA polymerase xoắn trở lại sau đó. - RNA polymerase. Kết thúc - Khi quá trình phiên mã diễn ra qua vùng giàu GC và AT thì ngừng lại. - Cấu trúc “kẹp tóc” của RNA với phần thân giàu GC bắt cặp ổn địnhlà tín hiệu dừng của enzyme polymerase. - Theo sau cấu trúc này là 1 trình tự khoảng 6U bắt cặp với các A mạch khuôn 1 cách yếu hơn tạo thuận lợi cho sự giải phóng RNA khỏi phức hợp. - Mạch khuôn DNA trở nên tự do, tái bắt cặp với mạch DNA còn lại và enzyme lõi được tách khỏi DNA. - Với 1 số gen, cần phải có nhân tố s, gần đây, người ta còn cho răng, protein nusA cũng là 1 nhân tố tham gia vào gđ kết thúc. - RNA polymerase. - Nhân tố s. - protein nusA 4. Sơ lược về sửa đổi sau phiên mã * Quá trình trưởng thành của các tiền mRNA Sản phẩm phiên mã của các gen cấu trúc chỉ là những bản sao sơ cấp (tiền mRNA) chưa hoàn chỉnh. Trước khi được chuyển ra TBC để tham gia giải mã, các tiền mRNA phải trải qua 1 quá trình biến đổi ngay trong nhân để trở thành các mRNA hoạt động: quá trình trưởng thành của RNA. Quá trình trưởng thành của tiền mARN Giai đoạn Diễn biến Enzyme Gắn mũ chụp - Ngay sau khi bắt đầu phiên mã, 1 guanin có gắn nhóm methyl ở N7 được gắn vào đầu 5’ của mARN nhờ lk 5’-5’triphosphate. - Những mARN không được gắn “mũ chụp” sẽ bị phân hủy. Gắn đuôi polyA (phản ứng cắt và nối đuôi poly) - Ngay sau khi được phiên mã, các mARN bị endonuclease cắt bỏ 1 đoạn. - Vị trí cắt nằm cách trình tự AAUAAA khoảng 20 nt về phía đầu 3’. - Enzyme polyA polymerase gắn 1 số Adenin nhất định vào đầu 3’ của RNA. - 1 pro lk với polyA PABP sẽ gắn vào đuôi polyA, có vai trò trong sự ổn định các mARN và khởi đầu dịch mã. Pro này cần thiết cho sự sống còn và sinht rưởng của TB. - endonuclease - polyA polymerase Quá trình ghép nối (loại intron nối exon) - Quá trình ghép nối được thực hiện dưới tác dụng của các soliceosome: là phức hợp giữa các snARN vá 1 số pro chuyên biệt trong nhân snRNP được đặt tên từ Ú đến U6. - Quá trình ghép nối diễn ra như sau: + mARN được cắt ngay giữa điểm nối exon 1 và đầu 5’ của intron. + 1 lk 5’-3’ được hình thành, tạo ra cấu rúc dạng “nút thòng lọng” của intron. + Điểm nối giữa exon 2 và đầu 3’ của intron bị cắt rời, intron bị loại ra và các exon và exon 2 được nối lại với nhau. V. MÃ DI TRUYỀN VÀ SỰ DỊCH MÃ 1. Mã di truyền a/ Lược sử khám phá mã DT (SGK/55-56) b/ Đặc tính của mã DT Mã DT là mã bộ ba, không gối lên nhau và được đọc 1 cách liên tục, không ngắt quãng. Mã DT có tính thoái hóa nghĩa là nhiều codon cùng xác định 1 aa, trừ ngoại lệ: AUG mã hóa cho Met và UGG mã hóa cho Trp. Mã DT có tính phổ biến, nghĩa là thống nhất cho hầu như toàn bộ sinh giới. 2. Dịch mã a/ Khái quát về dịch mã (SGK/58-59) Tính linh hoạt trong sự bắt cặp giữa anticodon- codon tARN mở đầu Vị trí gắn ribosome Polysome Các giai đoạn chính trong quá trình dịch mã Hoạt hóa acid amine Quá trình hoạt hóa aa được thực hiện nhờ sự xúc tác của các enzyme đặc hiệu, đó là các aminoacyl-tARN synthetase. Có 20 loại aminoacyl-tARN synthetase tương ứng với 20 loại aa. Các enzyme này có khả năng nhận biết aa đặc hiệu và tARN tương ứng Quá trình gắn aa vào tARN là 1 quá trình tiêu tốn NL và trải qua 2 bước: Enzyme nhận biết và gắn với 1 aa đặc hiệu: Enzyme + aa+ ATP à enzyme~aa~AMP + P-P aa được chuyển từ phức hợp enzyme-aa sang tARN tương ứng enzyme~aa~AMP + tARN à tARN~aa + enzyme + AMP Tổng hợp chuỗi polypeptide: 3 gđ chính Khởi đầu: Sự lắp ráp của 1 ribosome trên 1 phân tử mARN Kéo dài: Sự lặp lại của những chu kỳ gắn thêm aa vào chuỗi polypepetide Kết thúc: sự giải phóng 1 chuỗi polypeptide b/ Cơ chế tổng hợp protein ở prokaryote Giai đoạn Diễn biến Enzyme Khởi đầu - Mục đích của bước khởi đầu là lắp ráp 1 ribomse hoàn chỉnh vào 1 phân tử mARN ở 1 vị trí mở đầu đúng. Thành phần tham gia gồm: các tiểu phần lớn và bé của ribosome, mARN, phức hợp aminoacyl-tARN mở đầu, 3 nhân tố khởi đầu (IF) và GTP. - Diễn biến: + IF1và IF3 gắn vào tiểu phần bé 30S, giúp ngăn cản sự gắn tiểu phần lớn vào tiểu phần bé, tạo ra ribosome bất hoạt ko tạo phức với mARN. + IF2 tạo phức với GTP rồi gắn vào tiểu phần bé, hỗ trợ cho sự gắn vào của phức hợp aminoacyl-tARN mở đầu. + Tiểu phần bé gắn kết với mARN thông qua trình tự Shine-Dalgarno. + tARN gắn vào phức hợp nhờ sự bắt cặp bổ sung của anticodon và codon mở đầu AUG trên mARN. IF3 được giải phóng. Lúc này, có được phức hợp khởi đầu 30S. + tiểu phần lớn 50S gắn vào, thay chỗ của IF1 và IF2. GTP được thủy phân để cung cấp NL cho bước này. Phức hợp được hình thành vào cuối gđ khởi đầu được gọi là phức hợp khởi đầu 70S. * Lưu ý: aminocyl-tARN mở đầu ngay từ đầu đã được gắn vào phức hợp khởi đầu 70S tại vị trí P của ribosome. Lúc này, vị trí A còn bỏ trống. Kéo dài - Gđ kéo dài có sự tham gia của 3 nhân tố kéo dài (EF), tất cả đều gắn với GTP hoặc GDP. - Diễn biến: + Phân phối aminocyl-tARN: EF-Tu cần thiết cho sự phân phối các aminocyl-tARN đến vị trí A và NL tiêu tốn cho bước này đến từ sự thủy phân GTP. Phức hợp EF-Tu.GDP đc tái tạo thành EF-Tu.GTP nhờ EF-Ts. EF-Ts thay chỗ cho GDP, và nó đc thay bởi GTP. Phức hợp EF-Tu.GTP gắn với 1 aminocyl-tARN khác để phân phối nó đến ribosome. + Hình thành liên kết peptide: Khi cả 2 vị trí A và P đều chiếm cứ và 2 aa trở nên gần nhau, hoạt tính peptidyl transferase của tiểu phần 50S xúc tác dự hình thành lk peptide giữa chúng mà không cần tiêu tốn NL ATP đc tích lũy trong amiocyl-tARN. + Chuyển dịch: Phức hợp EF-G và GTP đến gắn vào ribosome và tARN hết NL rời khỏi vị trí P. Phức hợp peptidyl-tARN chuyển từ A sang P và ribosome dịch chuyển 1 codon trên mARN (tốn NL). GDP và EF-G đc giải phóng sau đó sẽ đc tái sử dụng. 1coson mới đang hiện diện ở vị trí A trống.. Chu kỳ 3 bước nói trên lặp đi lặp lại cho tới khi codon kết thúc xh ở vị trí A. - peptidyl transferase Kết thúc - Ko có tARN nào nhận diện codon kết thúc. - Thay vào đó, những nhân tố pro đc gọi là nhân tố giải phóng (RF) hay nhân tố kết thúc (TF) tương tác với coson này và giải phóng chuỗi polypeptide mới đc hoàn thành. - RF1 nhận diện các codon UAA và UAG; RF2 nhận diện UAA và UGA; RF3 giúp RF1 và RF2 thực hiện phản ứng. - Các nhân tố giải phóng khiến cho hoạt tính peptidyl transferase chuyễn chuỗi polypeptide đến nước thay vì aminocyl-tARN, vì thế 1 phân tử pro đc giải phóng. - Để dời chỗ tARN hết NL ra khỏi vị trí P và gải phóng mARN, EF-G cùng với nhân tố giải phóng ribosome đc y/c cho sự tách rời hoàn toàn 2 tiểu phần. IF3 có thể gắn vào tiểu phần bé để ngăn chặn hình thành ribosome 70S bất hoạt. VI. ĐIỀU HÒA BIỂU HIỆN GEN Trong tế bào, không phải loại protein nào cũng được tổng hợp với số lượng ngang nhau. Một số protein cần được tổng hợp với số lượng lớn, số khác chỉ cần một ít phân tử. Một số gen hoạt động thường xuyên cung cấp sản phẩm liên tục, số khác chỉ biểu hiện ở những gia đoạn nhất định của chu trình sống và chỉ có những gen chỉ hoạt động trong điều kiện môi trường không bình thường. Sự điều hòa biểu hiện gen của prokaryoke: Mục đích của sự điều hòa biểu hiện gen là nhằm điều chỉnh hệ enzyme cho phù hợp với các tác nhân dinh dưỡng và lý hóa của môi trường nhằm đáp ứng nhu cầu tăng trưởng và sinh sản của tế bào. Sự điều hòa ở đây rất linh động và có tính thuận nghịch. Một enzyme có thể được sản xuất, ngừng sản xuất rồi lại tái sản xuất theo điều kiện của môi trường. Ở tế bào prokaryote do không có màng nhân nên sự phiên mã và dịch mã xảy ra đồng thời. mARN vừa được phiên mã có thể tiếp xúc ngay với bộ máy dịch mã để làm khuôn cho sự tổng hợp protein. Do vậy, sự điều hoà biểu hiện gen chủ yếu được tiến hành ở gia đoạn phiên mã. 1.1 Mô hình operon về sự điều hoà hoạt động của gen ở mức phiên mã: 1.1.1 Cấu trúc của operon: Operon là đơn vị phiên mã. Cấu trúc của operon gồm một nhóm gen cấu trúc, operator và promoter tổ hợp lại tạo thành. Mỗi operon gắn với một gen điều hoà và chịu sự kiểm soát của gen này. Nhóm gen cấu trúc (structural ganes): Đảm nhận việc mã hoá các phân tử protein- enzyme. Các gen này thường xếp liền nhau. Điểm điều hành (operator): Là đoạn DNA nằm trước đoạn gen cấu trúc, phụ trách đóng mở gen cấu trúc. Promoter: Là đoạn DNA nằm trước operator, nơi gắn ARN polymerase bị ngăn cản không di chuyển dọc theo mạch khuôn DNA được, do đó quá trình tổng hợp RNA và protein tương ứng không xảy ra. Gene điều hoà (regulator): Chịu trách nhiệm tổng hợp protein điều hoà (regulatory protein). Protein điều hoà có thể đóng vai trò là protein ức chế (repressor protein) hoặc protein hoạt hoá (activator protein). 1.1.2 Sơ lược các kiểu kiểm soát phiên mã: Kiểm soát âm (negative control) Kiểm soát dương (positive control) - Protein điều hoà đóng vai trò là protein ức chế, sự gắn protein ức chế lên operator ngăn cản sự phiên mã của các gen cấu trúc trong cùng một operon - Protein điều hoà đóng vai trò là protein hoạt hoá, chúng có thể gắn vào điểm khởi đầu nằm bên trong promoter hay điểm tăng cường hoặc những trình tự nằm xa operon à kích thích sự phiêm mã các gen cấu trúc. - Protein ức chế có 2 trung tâm: + Một để gắn vào operator + Một dành cho chất cảm ứng hoặc chất ức chế còn gọi là chất đồng ức chế - Protein hoạt hoá có 2 trung tâm: + Một để gắn vào điểm khởi đầu hoặc điểm tăng cường + Một dành cho chất cảm ứng hoặc chất ức chế - Chất cảm ứng khi gắn vào protein ức chế làm thay đổi cấu hình protein ức chế, khiến protein ức chế rời khỏi operator, gen được phiêm mã. Đây gọi là kiểm soát âm, cảm ứng - Chất cảm ứng khi gắn vào protein hoạt hoá làm tạo thuận tiện cho sự phiêm mã. Đây gọi là kiểm soát dương, cảm ứng - Chất đồng ức chế khi gắn vào protein ức chế làm thay đổi cáu hình protein ức chế, khiến protein ức chế gắn vào operator, gen không được phiên mã. Đây gọi là kiểm soát âm ức chế - Chất ức chế khi gắn vào protein hoạt hoá làm kiềm hãm sự phiên mã. Đây gọi là kiểm soát dương, ức chế Đến nay chưa có ví dụ riêng về một operon hoạt động theo kiểu kiểm soát dương tính. Riêng Lac operon, ngoài kiểu điều hoà cảm ứng âm tính còn chịu sự điều hoà cảm ứng dương tính do dự tương tác giữa protein điều hoà thuộc phức hợp cAMP-CAP với vùng khởi động dẫn đến sự tăng cường phiêm mãmà chủ yếu là điều chỉnh tốc độ khởi đầu phiên mã. Các cơ chế điều hoà cảm ứng âm tính và ức chế âm tính: 1.2.1 Cơ chế điều hoà cảm ứng âm tính (điều hoà thoái dưỡng) Trong thoái dưỡng (dị hoá), các chất hữu cơ được biến đổi thành các thành phần đơn giản hơn. Cơ chế điều hoà ở đây là: Sự có mặt của cơ chất (tín hiệu điều hoà) sẽ dẫn tới sự tổng hợp các enzyme xúc tác quá trình thoái dưỡng Ví dụ điển hình cho trường hợp này là operon lactose ở E. coli 1.2.1.1 Cấu trúc của operon lactose Nhóm gen cấu trúc của lac operon gồm: Gen Z: mã hoá cho enzyme b-galatosidase có 2 tác dụng: thuỷ phân lactose thành glucose và galactose và biến đổi lactose thành allolactose. Gen Y: mã hoá cho enzyme b-galactosidepermease cần cho sự vận chuyển lactose vào trong tế bào. Gen A: mã hoá cho emzyme thiogalacoside acetyltransferase có chức năng chưa rõ. 1.2.1.2 Cơ chế điều hoà: Tìn hiệu điều hoà: đường lactose. Mức độ: điều hoà phiên mã. Khi không có lactose, gen điều hoà tổng hợp protein ức chế gắn vào operator. Điều này ngăn cản ARN polymerase gắn vào promoter cho nên sự phiên mã các gen cấu trúc của operon lactose không xảy ra. Khi chỉ có lactose là nguồn carbonhydrat duy nhất trong môi trường, lactose đóng vai trò chất cảm ứng gắn vào protein ức chế, làm thay đổi cấu hình không gian của protein ức chế. Sự thay đổi cấu hình này khiến cho protein ức chế không còn ái lực với operator nữa. Operator được giải phóng cho phép ARN polymerase gắn vào promoter, sự phiên mã và tổng hợp các enzyme chuyển hoá lactose xảy ra. 1.2.2 Cơ chế điều hoà ức chế âm tính (đều hoà biến dưỡng) Quá trình biến dưỡng (đồng hoá) là quá trình tyổng hợp nên các chất cần thiết cho tế bào từ các thành phần đơn giản hơn. Cơ chế điều hoà ở đây là: sự có mặt của tín hiệu điều hoà sẽ gấy ra sự ức chế quá trình sinh tổng hợp chính nó. Sự điều hoà kiểu này gọi là điều hoà ngược do sản phẩm cuối cùng có mối liên hệ ngược (feed back).\ A B C D (a) (b) (c) Ví dụ điển hình cho trường hợp này là operon trytophan ở E. coli 1.2.2.1 Cấu trúc của operon trytophan: Nhóm gen cấu trúc của lac operon gồm 5 gen cấu trúc A, B, C, D và E) mã hoá cho 5 enzyme xúc tác cho quá trinh tổng hợp trytophan từ tiền chất acid chorismic. 1.2.2.2 Cơ chế điều hoà: Tín hiệu điều hoà: trytophan (Trp). Mức độ: điều hoà phiên mã. Protein ức chế do gen điều hoà tổng hợp có hai trung tâm: Một trung tâm có ái lực với chất đồng ức chế Trp Một trung tâm có ái lực với operator Trong môi trường không có Trp, protein ức chế bất hoạt không gắn lên operator. Điều này cho phép ARN polymarase gắn lên promoter và phiên mã các gen cấu trúc thành các mARN. Các mARN này sau đó dịch mã thành các enzyme tổng hợp Trp Trong môi trường có Trp, protein ức chế gắn với chất đồng ức chế Trp trở thành phức hợp ức chế gắn với chất đồng ức chế có hoạt tính có khả năng gắn với operator. Điều này ngăn cản ARN polymerase gắn lên promoter cho nên sự phiên mã và dịch mã các gen cấu trúc thành enzyme tổng hợp Trp không xảy ra.