Chuyển gen qua nách lá mầm ở đậu tương nhờ vi khuẩn A. tumefaciens - Lò Thị Mai Thu

Lò Thị Mai Thu và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 115(01): 3 - 12 3 CHUYỂN GEN QUA NÁCH LÁ MẦM Ở ĐẬU TƢƠNG NHỜ VI KHUẨN A. TUMEFACIENS Lò Thị Mai Thu1, Nguyễn Thu Hiền2, Chu Hoàng Hà3, Chu Hoàng Mậu4* 1Trường Đại học Tây Bắc, 2Trường Đại học Y Dược - ĐH Thái Nguyên, 3Viện Công nghệ Sinh học, 4Trường Đại học Sư phạm- ĐH Thái Nguyên TÓM TẮT Đậu tƣơng (Glycine max (L.) Merrill) là cây trồng ngắn ngày, có giá trị kinh tế và là cây trồng cải tạo đất. Đậu tƣơng thuộc nhóm cây chống chịu kém trƣớc tác động của các yếu tố bất lợi từ ngoại cảnh (hạn, mặn), dễ nhiễm các bệnh do virus và vi khuẩn. Nghiên cứu cải thiện khả năng chống chịu của cây đậu tƣơng bằng kỹ thuật chuyển gen đã trở thành chủ đề thú vị của các nhà khoa học Việt Nam. Trong bài báo này chúng tôi tổng kết các công trình nghiên cứu chuyển gen ở đậu tƣơng nhờ vi khuẩn A. tumefaciens qua nách lá mầm hạt chín, tổng kết các thành tựu đạt đƣợc trên thế giới và ở Việt Nam làm cơ sở lý thuyết cho việc nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật chuyển gen với mục đích nâng cao khả năng chống chịu các stress từ ngoại cảnh, tăng cƣờng sức đề kháng với nhân tố gây bệnh của cây đậu tƣơng Việt Nam. Từ khóa: A. tumefaciens, chống chịu, chuyển gen gián tiếp, Glycine max, nách lá mầm. MỞ ĐẦU* Đậu tƣơng (Glycine max (L.) Merrill) là cây trồng ngắn ngày, có giá trị kinh tế và là cây trồng cải tạo đất, có ý nghĩa bảo vệ môi trƣờng. Hiện nay, năng suất và sản lƣợng đậu tƣơng ở nƣớc ta còn thấp, chất lƣợng hạt chƣa cao là do mức độ ổn định của giống, khả năng chống chịu các điều kiện bất lợi từ ngoại cảnh nhƣ hạn hán, nóng, mặn.., khả năng kháng bệnh do côn trùng, vi khuẩn, virus còn rất thấp. Chính vì vậy, nghiên cứu cải thiện khả năng chống chịu của cây đậu tƣơng bằng kỹ thuật chuyển gen đã trở thành chủ đề thú vị của các nhà khoa học Việt Nam. Kỷ nguyên Genomics (Hệ gen học) đang đƣợc ứng dụng trên cây đậu tƣơng và ở nhiều cây trồng khác. Gần đây dữ liệu hệ gen học đƣợc phát triển dựa trên những thông tin về trình tự các gen trong hệ gen của cây đậu tƣơng [43] và một lƣợng lớn thông tin về giải mã hệ gen cây đậu tƣơng có thể tìm thấy ở Genbank (http//www.ncbi.nlm.nih.gov). Ngoài ra, nguồn thông tin khác cũng đƣợc phát triển, nhƣ dữ liệu EST (expressed sequence tag), thƣ viện cDNA, microarray [50]. Những * Tel: 0913 383289, Email: mauchdhtn@gmail.com nguồn thông tin này là cơ hội của việc ứng dụng các tiến bộ chọn giống đậu tƣơng bằng chỉ thị phân tử và kỹ thuật chuyển gen; là cơ sở của những hiểu biết về chức năng gen trên cơ sở tách dòng gen và phƣơng pháp di truyền ngƣợc. Trên cơ sở đó, nghiên cứu xây dựng một hệ thống chuyển gen ổn định và có hiệu quả ở cây đậu tƣơng là điều cần thiết đi tới thành công trong chiến lƣợc chọn giống đậu tƣơng bằng kỹ thuật chuyển gen. Hai nhóm phƣơng pháp đƣợc ứng dụng trong nghiên cứu chuyển gen ở thực vật là chuyển gen trực tiếp và chuyển gen gián tiếp. Trong đó phƣơng pháp chuyển gen trực tiếp bằng súng bắn gen và chuyển gen gián tiếp thông qua A. tumefaciens đã đƣợc ứng dụng phổ biến và thành công đối với cây đậu tƣơng [54]. Chuyển gen gián tiếp ở đậu tƣơng thông qua vi khuẩn Agrobacterium bao gồm: (i) Nghiên cứu thu thập thông tin về gen liên quan đến đặc tính, tính trạng quan tâm và phân lập gen; (ii) Thiết kế vector chuyển gen; (iii) Tạo vi khuẩn mang cấu trúc gen chuyển; (iv) Lây nhiễm vào mô hoặc tế bào thực vật; (v) Chọn lọc các thể biến nạp và tái sinh cây biến nạp; (vi) Phân tích cây chuyển gen. Lò Thị Mai Thu và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 115(01): 3 - 12 4 CHUYỂN GEN Ở ĐẬU TƢƠNG THÔNG QUA A. TUMEFACIENS Chuyển gen nhờ lây nhiễm A. tumefaciens qua nách lá mầm tổn thƣơng Kể từ khi giống đậu tƣơng đầu tiên đƣợc chuyển gen bằng phƣơng pháp gián tiếp thông qua A. tumefaciens lây nhiễm vào nách lá mầm tổn thƣơng trong nuôi cấy in vitro vào năm 1988 [16] đến nay phƣơng pháp chuyển gen này đang đƣợc sử dụng, nghiên cứu và ứng dụng khá phổ biến đối với cây đậu tƣơng và đạt đƣợc những thành tựu rất đáng khích lệ. Agrobacterium là loài vi khuẩn đất gram âm gây bệnh khối u ở thực vật và có khả năng lây nhiễm một cách tự nhiên giữa các loài thực vật khác nhau [12]. Agrobacterium có thể gây ra bệnh khối u (A. tumefaciens) và gây bệnh rễ tơ (A.rhizogenes) phổ biến trên nhiều loài thực vật [15]. A. tumefaciens chủ yếu lây nhiễm vào thực vật qua các vết thƣơng và do vậy có thể coi A. tumefaciens là một vector sinh học sử dụng để chuyển các gen mong muốn vào cây đậu tƣơng [2]. Ƣu điểm của phƣơng pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn A. tumefaciens là đơn giản, quen thuộc và yêu cầu tối thiểu về dụng cụ, dễ dàng chuyển một gen đơn lẻ vào cây chủ hoặc chỉ cần số bản copy thấp [19]. Chuyển gen thông qua A. tumefaciens ở đậu tƣơng trong môi trƣờng đồng nuôi cấy đƣợc tiến hành trên nách lá mầm [16] mà khởi nguồn phƣơng pháp này dựa vào kiểu gen đậu tƣơng mẫm cảm với A. tumefaciens và khả năng tái sinh cây từ nách lá mầm [38]. Nách lá mầm là phần nối giữa lá mầm và thân chứa các tế bào mầm có khả năng phát sinh chồi và tăng sinh trong môi trƣờng nuôi cấy chứa cytokinin (Hình 1). Mức độ hình thành chồi ở nách lá mầm phụ thuộc vào loại cây sử dụng chuyển gen. Nhìn chung gây tổn thƣơng nách lá mầm bằng các vết cắt và kim châm đòi hỏi phải có kỹ thuật và sự khéo léo để tạo ra đủ mô đích cho sự nhiễm khuẩn [58]. Tuy nhiên, nếu sử dụng bàn chải làm từ thép không gỉ để tạo các vết thƣơng ở nách lá mầm thì không yêu cầu nhiều về mặt kỹ thuật [54]. Những cây đậu tƣơng chuyển gen đầu tiên mang cấu trúc gen npII đã sử dụng kháng sinh kanamycin làm chất chọn lọc [16] và đến nay các dòng tế bào chuyển gen đã sử dụng các chất chọn lọc bởi sự kết hợp gen bar và glufosinate. Nồng độ chất chọn lọc có ảnh hƣởng lớn đối với tần suất chuyển gen [56], vì thế phƣơng pháp lựa chọn chất chọn lọc là khác nhau giữa các kiểu gen đậu tƣơng. Các giống có thời gian sinh trƣởng ngắn có thể sử dụng để phát triển các dòng đậu tƣơng chuyển gen. Paz và đtg (2006), Zeng và đtg (2004) cho rằng, hiệu suất chuyển gen có thể đạt từ 0,2% đến khoảng 10% và hiệu quả chuyển gen phụ thuộc vào kỹ thuật và kiểu gen đậu tƣơng [41], [56]. Ở Mỹ, cây đậu tƣơng chuyển gen chủ yếu đƣợc tạo ra từ phƣơng pháp chuyển gen nhờ A. tumefaciens qua nách lá mầm và các các giống đậu tƣơng chuyển gen đƣợc cung cấp bởi các cơ sở nghiên cứu do chính phủ quản lý, bao gồm Trung tâm Plant Transformation Facility thuộc Đại học Iowa State, Trung tâm Plant Transformation Core Facility thuộc Đại học Missouri. Điều này đã gợi ý sự cần thiết tổ chức quá trình nghiên cứu chuyển gen ở đậu tƣơng ở các quốc gia trên thế giới, trong đó có Việt Nam. Phân tích cây chuyển gen Kỹ thuật chuyển gen ở thực vật nói chung và chuyển gen ở cây đậu tƣơng nói riêng đƣợc hiểu đẩy đủ là: (i) gen ngoại lai (gen chuyển) phải đƣợc dung hợp vào hệ gen tế bào chủ; (ii) gen chuyển phải đƣợc biểu hiện ở tế bào chủ; (iii) gen chuyển phải đƣợc di truyền cho các thế hệ sau; (iv) trong mỗi thế hệ sản phẩm của gen chuyển phải đƣợc biểu hiện, và (v) sản phẩm của gen chuyển biểu hiện đƣợc chức năng sinh học. Chính vì vậy quá trình chọn lọc, phân tích cây chuyển gen trong mỗi thế hệ đƣợc thực hiện bằng hệ thống chọn lọc tế bào và mô chuyển gen, xác định sự có mặt của gen chuyển trong tế bào cây chủ, kiểm tra sự biểu hiện của gen chuyển thông qua xác định sản phẩm biểu hiện là mRNA và protein và phân tích sự biểu hiện chức năng sinh học của gen chuyển. Lò Thị Mai Thu và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 115(01): 3 - 12 5 Hình 1. Sơ đồ tái sinh và biến nạp gen ở đậu tương [36] A: Hạt đã khử trùng; B: Hạt nảy mầm trên môi trường nuôi cấy; C: Gây tổ thương nách lá mầm; D, E: Tạo đa chồi và kéo dài chồi; G: ra rễ; H: ra cây và trồng trong chậu ở nhà lưới Quá trình tạo cây chuyển gen đòi hỏi một phƣơng tiện hiệu quả để xác định và lựa chọn các tế bào và mô chuyển gen và không phụ thuộc vào hệ thống chuyển gen đƣợc sử dụng. Gen chỉ thị chọn lọc có thể sử dụng gen kháng kháng sinh hoặc kháng thuốc diệt cỏ sẽ cho phép chọn đƣợc các vật liệu biến đổi gen [1]. Kháng sinh hygromycin đã đƣợc sử dụng thành công nhƣ một nhân tố chọn lọc và trở thành kháng sinh tiêu chuẩn cho việc chọn lọc các mô chuyển gen ở đậu tƣơng, đặc biệt là các mô phát sinh phôi [17], [28] và các tế bào của nách lá mầm đậu tƣơng [39]. Điều này đã chứng minh hygromycin giúp loại bỏ những mô không mang gen chuyển và làm giảm thời gian nuôi cấy. Hiệu quả chuyển gen tối đa ở đậu tƣơng bằng cách sử dụng mức tối ƣu glufosinate trong việc lựa chọn phƣơng pháp tái sinh chồi từ nách lá mầm [56] và một hệ thống mới đƣợc phát triển để chọn lọc tế bào mô phân sinh biến đổi gen từ phôi trục sau khi đƣa vào một gen đột biến của cây Arabidopsis (csr1-2) để đạt đƣợc khả năng kháng thuốc diệt cỏ imidazolinone. Rao và đtg (2009) đã phát triển thành công một hệ thống chọn phôi soma bằng cách sử dụng gen E. coli dap A, mà sản phẩm của gen này có khả năng kháng glufosinate, glyphosate, S- (2 aminetyl)-L- cysteine và imidazolinones [55]. Hệ thống gen gus (gus, gusA và uidA) mã hóa cho protein β-glucuronidase lần đầu tiên đƣợc phân lập từ E. coli [24] và ngay sau khi phát hiện, nó nhanh chóng đƣợc phát triển thành hệ thống chỉ thị cho chuyển gen ở thực vật [23]. Ngày nay, việc sử dụng gus trong chuyển gen thực vật ngày càng đƣợc tiến hành rộng rãi, nhất là trong những thí nghiệm khảo sát quy trình chuyển gen vào một giống cây mới [29]. Trên nguyên tắc gen ngoại lai khi đƣợc biến nạp có thể tồn tại trong tế bào chủ ở ba trạng thái: (1) Tạm thời ở dạng DNA tự do; (2) Lâu dài dƣới dạng một thể plasmid độc lập và (3) ổn định nhƣ một đoạn DNA của hệ gen tế bào chủ và đƣợc nhân lên trong tế bào chủ. Phƣơng pháp sinh học phân tử đƣợc ứng dụng nhằm xác định sự có mặt, sự di truyền và sự biểu hiện của gen chuyển trong tế bào chủ. Có thể sử dụng PCR để phân tích cây chuyển gen, tuy nhiên lai Southern xác định số copy trong cây chuyển gen là phƣơng pháp tin cậy và thông dụng nhất. Gần đây, một kỹ thuật thƣờng sử dụng để hỗ trợ cho lai Southern trong việc phát hiện số copy trong cây chuyển gen là Quantitave real-time PCR (Q-PCR). Q-PCR có thể tiến hành với số lƣợng cây cần phân tích nhiều, do dễ thực hiện, tiết kiệm nguyên liệu chi phí và công sức [22]. Lò Thị Mai Thu và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 115(01): 3 - 12 6 Hình 2. Sơ đồ các bước tiến hành và phương pháp phân tích cây chuyển gen Biểu hiện gen trong sinh học phân tử là quá trình hoạt động của gen để tạo ra sản phẩm cuối cùng là protein. Quá trình biểu hiện gen đƣợc thể hiện qua hai giai đoạn: (1) Phiên mã từ DNA sang mRNA và (2) Dịch mã từ mRNA tổng hợp các phân tử protein thông qua bộ máy ribosome. Để xác định sự có mặt của sản phẩm phiên mã có thể sử dụng kỹ thuật RT-PCR, real-time PCR hoặc real-time RT-PCR, thực hiện lai Northern. Để đánh giá sự có mặt của protein do gen chuyển tạo ra có thể thực hiện một số kỹ thuật khác nhau nhƣ kỹ thuật lai Western, ELISA và các kỹ thuật phát hiện hoạt động của protein (hoặc enzyme). ĐỊNH HƢỚNG ỨNG DỤNG VÀ THÀNH TỰU NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN Ở ĐẬU TƢƠNG Tiếp cận kỹ thuật chuyển gen nhằm cải thiện thành phần hạt đậu tƣơng Cải thiện protein và amino acid Kỹ thuật chuyển gen là biện pháp tăng cƣờng hàm lƣợng, chất lƣợng protein và lipid trong hạt đậu tƣơng. Protein đậu tƣơng có hàm lƣợng dinh dƣỡng đƣợc xem tƣơng đƣơng với protein của thịt và trứng, ngoại trừ sự khác biệt về amino acid chứa lƣu huỳnh đặc biệt là methionine [14]. Vì vậy để tăng cƣờng các loại protein có hàm lƣợng methionine cao ở hạt đậu tƣơng, ngƣời ta đã chuyển gen mã hóa β-casein phân lập từ trâu, bò và zein phân lập từ ngô vào cây đậu tƣơng theo nguyên tắc thiết kế vector chuyển gen chứa promoters biểu hiện ở hạt [27]. Mặc dù chƣa có thông tin về hiện tƣợng tăng hàm lƣợng amino acid tự do chứa các gốc lƣu huỳnh trong hạt đậu tƣơng, nhƣng 3 amino acid quan trọng khác là lysine, tryptophan và threonine đã tăng đáng kể trong hạt đậu tƣơng bởi sự biểu hiện gen mã hóa các enzyme liên quan đến chuỗi phản ứng tổng hợp các amino acid này [42]. Cải thiện hàm lƣợng các loại amino acid trong hạt đậu tƣơng đƣợc xem là một cách tiếp cận đáng tin cậy để nâng cao chất lƣợng dinh dƣỡng ở hạt đậu tƣơng. Đậu tƣơng cũng đƣợc xem là một lò phản ứng sinh học sản xuất protein có hiệu quả nhất trong nền nông nghiệp phân tử thực vật. Các protein có hoạt tính dƣợc học nhƣ hormone sinh trƣởng ngƣời, nhân tố sinh tế bào sợi, và vaccine ăn đƣợc đã đƣợc tích lũy trong hạt của cây đậu tƣơng chuyển gen [10]. Mặc dù các loại protein có hoạt tính sinh học chiếm tới 3% so với tổng hàm lƣợng protein trong hạt, nhƣng các loại protein có hoạt tính dƣợc học gần nhƣ là con số không so với hàm lƣợng protein dự trữ trong hạt. Thay vào đó, một giải pháp khác là sử dụng các protein dự trữ chính trong hạt, -conglycinin và glycinin, nhƣ là một chất vận chuyển các peptid có hoạt tính sinh học [52]. Một peptid sáu vòng có hoạt tính sinh học, novo-kinin đã đƣợc ghép vào tiểu đơn vị α của -conglycinin ở 4 vị trí bằng cách thay thế amino acid, và các hạt đậu chuyển gen chứa các protein đã đƣợc thay đổi với sự biểu hiện các đặc tính mong muốn [52]. Cải thiện thành phần dầu Khoảng 75% lƣợng dầu thực vật trên thế giới là từ dầu dừa, hạt đậu tƣơng, hạt cải dầu và hạt hƣớng dƣơng. Dầu đậu tƣơng đƣợc sử dụng rộng rãi là dầu ăn, trong công nghiệp mực in, dầu nhờn và xăng sinh học. Với mục đích cải thiện hàm lƣợng dầu và thành phần Lò Thị Mai Thu và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 115(01): 3 - 12 7 dầu trong hạt đậu tƣơng ngƣời ta sử dụng kỹ thuật chuyển gen. Dầu đƣợc chứa trong hạt ở dạng triacylglycerol, gen mã hóa acyltransferase đã đƣợc chuyển vào đậu tƣơng để tăng cƣờng sinh tổng hợp triacylglycerol kết quả làm tăng tối đa 3,2% hàm lƣợng dầu trong hạt [55]. Đặc tính của dầu đƣợc quyết định bởi thành phần lipid. Các phƣơng pháp chuyển gen có thể cung cấp nhiều lựa chọn để làm thay đổi thành phần dầu trong hạt đậu tƣơng cho các mục đích sử dụng khác nhau. Dầu đậu tƣơng có các thành phần palmitic, stearic, oleic, linoleic và acids linoleic [60]. Hàm lƣợng cao của các axit béo không no trong dầu đậu tƣơng làm cho dầu không ổn định và có mùi khó chịu. Phƣơng pháp chuyển gen mang cấu trúc RNAi làm bất hoạt gen liên quan đến sự tổng hợp acid béo không no đã đƣợc ứng dụng để cải thiện đặc tính này ở cây đậu tƣơng [25]. Vitamin E bao gồm các dạng khác nhau nhƣ tocopherols và tocotrienols (dạng , , và ). Tất cả đều có khả năng chống oxy hoá lipit, trong đó mạnh nhất là -tocophetal [3] [20]. Vitamin E đƣợc dùng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm nhƣ chất chống oxy hoá, đồng thời cũng đƣợc dùng cho ngƣời và động vật để giúp phòng bệnh. Trong chế biến đậu tƣơng, tocophrd đƣợc chiết xuất cùng dầu. Thành phần của chúng chỉ chiếm 1,5% hàm lƣợng dầu đƣợc chiết xuất, nhƣng chúng có vai trò quan trọng đối với sự ổn định và không bị oxi hoá của dầu [18]. Tác động vào bƣớc chính để chuyển đổi -tocophenol sang -tocophenol làm tăng hàm lƣợng - tocophenol lên 95% của tocophenol toàn phần trong hạt đậu tƣơng chuyển gen [45]. Cải thiện một số thành phần khác Isoflavones là các thành phần quan trọng đƣợc tổng hợp trong cây họ đậu. Ngoài vai trò kiểm soát quá trình tƣơng tác giữa cây và vi sinh vật, chúng còn đƣợc biết đến nhƣ chất nội tiết phyloustogen và các chất hoạt tính sinh học khác liên quan đến sức khoẻ con ngƣời, nhƣ có hiệu quả chống ung thƣ, giảm nguy cơ bệnh mạch vành [59]. Saponins là một nhóm chất có cấu trúc đa dạng phân bố nhiều trong các loài thực vật. Dựa trên cơ sở cấu trúc hoá học ngƣời ta đã xác định saponins ở đậu tƣơng đƣợc phân bố trong bốn nhóm (A, B, E và DDMP) và chúng có tác dụng dƣợc học khác nhau nhƣ chống phù lipid, chống lại sự nhân lên của tế bào ung thƣ trực tràng. Theo Takagi và đtg (2011), gen mã hóa -amyrin synthase tham gia tổng hợp một loại chất trong quá trình sinh tổng hợp saponins của hạt đậu tƣơng chuyển gen đã bị ức chế bởi cơ chế RNAi [46]. Hạt đậu tƣơng chứa số lƣợng lớn các acid phytic và chúng sẽ giải phóng phosphor và myoinositol trong quá trình hạt nảy mầm. Cây đậu tƣơng chuyển gen có nồng độ phosphor tăng gấp 3 lần và phytate giảm 3 lần [4]. Tiếp cận kỹ thuật chuyển gen nhằm cải thiện tính kháng đối với các tác nhân hữu sinh và vô sinh Tăng cường khả năng kháng côn trùng và vi sinh vật Protein tinh thể có tác dụng diệt côn trùng (cry hoặc -endotoxin) là protein hoạt tính độc tố của Bacillus thuringiensis (Bt), một loại thuốc trừ sâu sinh học [48]. Biểu hiện của gen cry Bt ở đậu tƣơng đã đƣợc chứng minh là có hiệu quả cao trong việc kiểm soát côn trùng gây bệnh [44] và kháng lại các loại bƣớm đã đƣợc kiểm chứng trên thực địa [57]. Tuy nhiên, việc phát hiện côn trùng có thể thích ứng với protein cry Bt đã gây nên mối lo ngại về việc sử dụng lâu dài và liều lƣợng cao cry Bt [31]. Giải pháp cho vấn đề này là sự kết hợp gen cry Bt với gen mã hóa protein diệt côn trùng khác để chuyển vào cây đậu tƣơng [53]. Sản xuất đậu tƣơng trên thế giới đã đạt đƣợc những thành tựu đáng kể về năng suất và sản lƣợng, tuy nhiên ở nhiều vùng sản xuất đậu tƣơng còn có hạn chế về năng suất, chất lƣợng do các tác nhân gây bệnh, nhƣ sâu bệnh, vi khuẩn, virus [21]. Virus gây bệnh Lò Thị Mai Thu và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 115(01): 3 - 12 8 khảm (SMV) ở đậu tƣơng là loại bệnh gây thiệt hại lớn cho ngành sản xuất đậu tƣơng, côn trùng (rệp) là vector truyền SMV. Đã có một số nỗ lực lớn để cải thiện tính kháng SMV ở cây đậu tƣơng bằng kỹ thuật chuyển gen. Sự biểu hiện gen CP và vùng 3-UTR phân lập từ SMV đã làm tăng sức đề kháng SMV ở cây đậu tƣơng chuyển gen [13]. Ngoài ra khả năng kháng virus gây bệnh đốm quả và gây bệnh lùn ở cây đậu tƣơng cũng đƣợc chuyển vào cây đậu tƣơng [47]. Tăng cường khả năng chống chịu các điều kiện bất lợi của ngoại cảnh Hạn hán là yếu tố ngoại cảnh bất lợi làm giảm năng suất và sản lƣợng cây trồng. Cây đậu tƣơng chuyển gen mã hóa P5CR L-Δ1- pyrroline-5-carboxylate reductase xúc tác cho phản ứng tổng hợp polime, dƣới sự điều khiển của promotor sốc nhiệt đã làm tăng khả năng chịu hạn và chịu nóng cao hơn cây đối chứng [11]. Cũng hƣớng nghiên cứu này, Nguyễn Thúy Hƣờng và đtg (2011) đã tạo đƣợc cây đậu tƣơng chuyển gen chứa gen mã hóa enzyme P5CS [37]. Hơn nữa, sự biểu hiện của gen mã hóa chất môi giới phân tử liên quan đến tính chống chịu ở đậu tƣơng (soyBiPD) đã làm chậm quá trình lão hóa của các tế bào lá đậu tƣơng trong thời gian bị hạn [51]. Tăng cường khả năng kháng thuốc diệt cỏ Thành công nhất trong chuyển gen ở đậu tƣơng là tạo ra giống kháng thuốc diệt cỏ (N- phosphonomethyl-glycine; Roundup) [40]. Giống đậu tƣơng chuyển gen Rourdup Ready đƣợc thƣơng mại hóa từ năm 1996 và đƣợc trồng ở hầu hết các vùng trồng đậu tƣơng kể từ năm 2004 (ISAAA, http:/ /www.isaaa.org/). Gen EPSPS đã đƣợc chuyển vào đậu tƣơng làm tăng khả năng chịu glyphosate ở mức độ cao (glyphosate là chất ngăn chặn hoạt động của enzyme, xúc tác tổng hợp amino acid thơm) [40]. Ngoài ra, việc chuyển gen AHAS phân lập từ Arabidopsis, gen HPPD phân lập từ Pseudomonas fluorescens, gen PAT phân lập từ vi khuẩn đất đã tăng cƣờng khả năng chống chịu các chất imazapyr, isoxaflutole và phosphinothricin trong thuốc diệt cỏ [26]. ỨNG DỤNG KỸ THUẬT GEN TRONG NGHIÊN CỨU TẠO CÂY ĐẬU TƢƠNG BIẾN ĐỔI GEN Ở VIỆT NAM Nghiên cứu đặc điểm của gen liên quan đến tính chống chịu của cây đậu tƣơng Hai hƣớng tiếp cận nghiên cứu các gen liên quan đến tính chống chịu các yếu tố bất lợi của ngoại cảnh ở cây đậu tƣơng đƣợc quan tâm, đó là (1) các gen mà sản phẩm của nó liên quan trực tiếp đến tính chống chịu và (2) các gen mà sản phẩm là protein điều hòa, kích thích hoặc ức chế nhóm gen chống chịu. Các gen liên quan trực tiếp đến tính chịu hạn của cây đậu tƣơng đã đƣợc tách dòng và xác định trình tự nhƣ gen chaperonin, dehydrin, cystatin [5], [6], gen P5CS [7], [8], gen GmEXP1 [30],; Theo hƣớng nghiên cứu nhân tố DREB kích thích quá trình phiên mã của nhóm gen chống chịu đƣợc quan tâm và công bố bởi nghiên cứu gen DREB5 [9], DREB1 [32]. Những hiểu biết về đặc điểm của các gen liên quan đến đặc tính chống chịu của cây đậu tƣơng là cơ sở của việc ứng dụng kỹ thuật chuyển gen vào việc nâng cao khả năng chống chịu với các yếu tố ngoại cảnh bất lợi của cây đậu tƣơng Việt Nam. Nghiên cứu tạo cây đậu tƣơng chuyển gen Việc nghiên cứu chuyển nạp gen đƣợc Trần Thị Cúc Hòa (2009) tiến hành thử nghiệm trên 4 phƣơng pháp lây nhiễm khác nhau, trong đó tạo vết thƣơng tại mặt trong của nách lá mầm với dung dịch có chứa vi khuẩn đƣợc nuôi cấy ở nhiệt độ 210C là có hiệu quả, với tỷ lệ nạp chuyển gen đạt cao hơn [49]. Nguyễn Thị Thúy Hƣờng (2009) đã t quy trình tái sinh và chuyển gen thông qua nách lá mầm đậu tƣơng [36] và nhận xét rằng, giống đậu tƣơng DT84 là đối tƣợng phù hợp để tiến hành các thí nghiệm chuyển gen và kết quả ển đƣợc cấu trúc gen RD29A/P5CSm vào giống đậu tƣơng DT84, tạo đƣợc cây đậu tƣơng mang gen chuyển đột biến loại bỏ ức chế phản hồi trong mục đích tăng cƣơng tổng hợp prolin khi cây đậu tƣơng bị hạn [37]. Lò Thị Mai Thu và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 115(01): 3 - 12 9 Nguyễn Thu Hiền (2011) đã thành công tái ừ nách lá mầm hạ 2 giống đậu tƣơng đƣợ ố 30,5 mg/l + IAA 0,1 mg/l. Môi trƣờng tạo rễ thích hợp khi bổ sung IBA 0,1 mg/l. đậ gus, h ợc kiểm tra ở giai đoạn hạ 7,6% đối vớ 4,0 % với giống DT84 [35]. Kết quả đã tạo đƣợc 8 dòng cây đậu tƣơng ở thế hệ T1 mang cấu trúc vector biểu hiệ trong hạt SLHEP-HA1, dƣơng tính với phản ứng PCR [34] và ở thế hệ T2 đã thu đƣợc dòng đậu tƣơng H11 mang đoạn gen HA1op và biểu hiện thành công protein tái tổ hợp HA1 trong hạt của dòng đậu tƣơng này [33]. Đậu tƣơng là một trong số các cây trồng dễ bị nhiễm nhiều loại virus, nhƣ bệnh khảm (Soybean mosaic virus - SMV), bệnh khảm vàng hại đậu tƣơng (Soybean yellow mosaic virus - SYMV), hai loài virus này lan truyền do rệp làm môi giới. Hiện nay trong ngành sản xuất đậu tƣơng mới dừng ở biện pháp phòng mà chƣa có thuốc trị hai loài virus SMV và BYMV. Do vậy cách tiếp cận ứng dụng công nghệ gen nghiên cứu tạo ra giống đậu tƣơng kháng SMV và BYMV đƣợc chúng tôi quan tâm nghiên cứu. Hai hƣớng tiếp cận tạo cây đậu tƣơng chuyển gen kháng virus đƣợc quan tâm là (i) phân lập gen từ giống đậu tƣơng có khả năng kháng virus tốt nhất để chuyển vào giống đậu tƣơng có tính kháng kém và (ii) chuyển các gen có nguồn gốc từ chính loài virus gây bệnh theo nguyên lý của kỹ thuật RNA interference (RNAi). Dựa trên nguyên lý bất hoạt gen sau phiên mã chúng tôi đã thành công phân lập gen CP từ virus khảm SMV và nghiên cứu đặc điểm của gen CP của các potyvirus để xác định vùng bảo thủ phục vụ thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi trong chiến lƣợc tạo cây đậu tƣơng chuyển gen kháng virus. Lời cảm ơn: Công trình được hoàn thành có sự hỗ trợ kinh phí và thuộc nội dung của đề tài Khoa học-Công nghệ cấp Bộ Giáo dục & Đào tạo, mã số: B2013 - TN04 - 05 do GS.TS Chu Hoàng Mậu làm chủ nhiệm. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Brasileiro ACM and Aragao FJL (2001) Marker genes for in vitro selection of transgenic plants. Plant Biotech 3: 113–121. 2. Beijersbergen, A., A.D.Dulk-Ras, R.A.Schilperoort and P.J.J. Hooykaas (1992) Conjugative transfer by the virulence system of Agrobacterium tumefaciens. Science 256: 1324– 1327. 3. Bramley, P.M., I.Elmadfa, A.Kafatos, F.J.Kelly, Y.Manios, H.E. Roxborough, W. Schuch, P.J.A.Sheehy and K.-H. Wagner (2000) Vitamin E. J. Sci. Food Agric. 80: 913–938. 4. Chiera, J.M., J.J. Finer and E.A. Grabau (2004) Ectopic expression of a soybean phytase in developing seeds of Glycine max to improve phosphorus availability. Plant Mol. Biol. 56: 895– 904. 5. Chu Hoàng Mậu, Nguyễn Thị Thúy Hƣờng, Nguyễn Vũ Thanh Thanh, Chu Hoàng Hà (2011) Gen và Đặc tính chịu hạn của cây đậu tƣơng. Nxb Đại học Quốc gia Hà Nội. 6. Chu Hoang Mau, Nguyen Tuan Anh, Pham Thi Thanh Nhan, Đinh Thi Ngoc, Bui Thi Tuyet (2010). The characteristics of chaperonin gene isolated local soybean cultivars (Glycine max L. Merrill) grown in Tay Nguyen region, Viet Nam, CCEA 2010, 452-456 7. Nguyễn Thị Thúy Hƣờng, Chu Hoàng Mậu, Lê Văn Sơn, Nguyễn Hữu Cƣờng, Lê Trần Bình, Chu Hoàng Hà (2008) Đánh giá khả năng chịu hạn và phân lập gen P5CS của một số giống đậu tƣơng (Glycine max L.Merrili) Tạp chí công nghệ sinh học 6(4): 459-466. 8. Chu Hoang Mau, Nguyen Thuy Huong, Chu Hoang Lan, Nguyên Tuan Anh, Le Van Son, Chu Hoang Ha (2011) Characteristics of the gene encoding pyrroline-5-carboxylate synthase (P5CS) in Vietnam soybean cultivars (Glycine max L. Merrill). IACSIT Press, 319-323. 9. Chu Hoang Lan, Nguyen Tuan Anh, Nguyen Vu Thanh Thanh, Nguyen Hiep Hoa, Chu Hoang Mau (2010). Characterization of the GmDREB5 gene isolated from the soybean cultivar Xanh Tiendai, Vietnam. IEEE, 354-358. 10. Cunha, N.B., A.M.Murad, T.M. Cipriano, A.C.G. Araújo, F.J.L. Aragão, A.Leite, G.R.Vianna, T.R.McPhee, G.H.M.F.Souza, M.J. Waters et al. (2011) Expression of f unctional Lò Thị Mai Thu và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 115(01): 3 - 12 10 recombinant human growth hormone in transgenic soybean seeds. Transgenic Res. 20: 811–826. 11. DeRonde, J.A., R.N.Laurie, T.Caetano, M.M.Greyling and I.Kerepesi (2004a) Comparative study between transgenic and non- transgenic soybean lines proved transgenic lines to be more drought tolerant. Euphytica 138: 123–132. 12. DeCleene, M., and DeLey, J. (1976). The host range of crown gall. Bot. Rev. 42, 389–466. 13. Furutani, N., S.Hidaka, Y. Kosaka, Y. Shizukawa and S. Kanematsu (2006) coat protein gene-mediated resistance to soybean mosaic virus in transgenic soybean. Breed. Sci. 56: 119–124. 14. FAO/WHO (1990) Expert consultation on protein quality evaluation. Food and Agriculture Organization of the United Nations, Rome. Young, V.R. (1991) Soy protein in relat ion to human protein and amino acid nutrition. J. Am. Diet. Assoc. 91: 828–835. 15. Gelvin SB. (2010) Plant proteins involved in Agrobacterium-mediated genetic transformation. Annu Rev Phytopathol, 48:45–68. 16. Hinchee, M.A.W., D.V. Conner-Ward, C.A.Newell, R.E.McDonnell, S.J. Sato, C.S.Gasser, D.A.Fischhoff, D.B. Re, R.T. Fraley and R.B.Horsch (1988) Production of transgenic soybean plants using Agrobacterium-mediated DNA transfer. Nat. Biotechnol. 6: 915–922. 17. Homrich, MS.,Strohm, BW., Weber, RLM., and Zanettini , MHB., (2012) Soybean genetic transformation: A valuable tool for the functional study of genes and the production of agronomically improved plants. Genet Mol Biol. 35: 998–1010. 18. Hoppe, P.P. and G. Krennrich (2000) Bioav ailability and potency of natural-source and all- racemic α -tocopherol in the human: a dis-pute. Eur. J. Nutr. 39: 183–193. 19. Hansen, G. and M.S. Wright (1999) Recent advances in the transformation of plants. Trends Plant Sci. 4: 226–231. 20. Herbers, K. (2003) Vitamin production in transgenic plants. J. Plant Physiol. 160: 821–829. 21. Hartman, G.L., E.D.West and T.K. Herman (2011) Crops that feed the World 2. Soybean— worldwide production, use, and constraints caused by pathogens and pests. Food Sec. 3: 5–17. 22. James C (2007) Global status of commercialized biotech/GM crops. ISAAA Briefs 37, ISAAA. 23. Jefferson RA, Kavanagh TA, and Bevan MW (1987) GUS fusions: betaglucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants. Embo 6: 3901–3907. 24. Jefferson RA, Burgess SM, Hirsh D (1986) β- Glucuronidase from Escherichia coli as a gene- fusion marker. Proc Natl Acad Sci USA 83: 8447– 8451. 25. Kasai,M. and A.Kanazawa (2012) RNA silencing as a tool to uncover gene function and engineer novel traits in soybean. Breed. Sci. 61: 468–479. 26. Kita, Y., M.S. Hanafy, M. Deguchi, H.Hasegawa, T. Terakawa, K. Kitamura and M.Ishimoto (2009) Generation and characterization of herbicide-resistant soybean plants expressing novel phosphino-thricin N-acetyltransferase genes. Breed. Sci. 59: 245–251. 27. Li,Z., S.Meyer, J.S.Essig, Y. Liu, M.A.Schapaugh, S. Muthukrishnan, B.E. Hainline and H.N.Trick (2005) High-level expression of maize γ-zein protein in transgenic soybean (Glycine max). Mol. Breed. 16: 11–20. 28. Li, R., K. Yu, T.Hatanaka and D.F.Hildebrand (2010) Vernonia DGATs increase accumulation of epoxy fatty acids in oil. Plant Biotechnol. J. 8: 184–195. 29. Lopez S.J., Kumar R.R., Pius P.K., Muraleedharan N. (2004), ―Agrobacterium tumefaciens-mediated genetic transformation in Tea (Camellia sinensis [L.] O. Kuntze)‖. Plant molecular biology reporter 22: pp. 201-201. 30. Lò Thanh Sơn, Bùi Ngọc Bích, Nguyễn VũThanh Thanh, Chu Hoàng Mậu (2013) Đặc điểm của gen expansin phân lập từ giống đậu tƣơng địa phƣơng Việt Nam. Tạp chí Sinh học, 35(1): 99-104. 31. McCabe,D.E., W.F.Swain, B.J. Martinell and P.Christou (1988) Stable transformation of soybean (Glycine max) by particle acceleration. Nat. Biotechnol. 6: 923–926. 32. Nguyễn Vũ Thanh Thanh, Nguyễn Thu Hồng, Lê Văn Sơn, Chu Hoàng Mậu (2011) Đặc điểm của gen DREB1 phân lập từ giống đậu tƣơng địa phƣơng (Glycine max (L.) Merrill) Xanh lơ Ba bể (Bắc Kạn). Tạp chí Sinh học, 33(1): 74-79. 33. Nguyễn Thu Hiền, Nguyễn Thu Giang, Chu Hoàng Hà, Chu Hoàng Mậu (2013), ― Biểu hiện kháng nguyên của virus H5N1 trong thực vật‖, Tạp chí Y học Việt Nam, tập 411: tr 219-224. 34. Nguyễn Thu Hiền, Chu Hoàng Mậu, Lê văn Sơn, Chu Hoàng Hà (2012), ―Nghiên cứu tạo cây đậu tƣơng chuyển gen mang cấu trúc biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên bề mặt của virus H5N1 phục vụ sản xuất vaccine thực vật‖, Tạp chí khoa học công nghệ Đại học Thái Nguyên, 89(1):tr. 123-127. 35. Nguyễn Thu Hiền, Chu Hoàng Mậu, Chu Hoàng Hà, Lê văn Sơn (2011), ―Nghiên cứu khả Lò Thị Mai Thu và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 115(01): 3 - 12 11 năng tái sinh và biến nạp gen qua nách lá mầm của hai giống đậu tƣơng (Glycine max L.) ĐT12 và DT84 bằng Agrobacterium‖, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 8( 38): tr. 1305-1310. 36. Nguyễn Thị Thúy Hƣờng, Trần Thị Ngọc Diệp, Nguyễn Thu Hiền, Chu Hoàng Mậu, Lê Văn Sơn, Chu Hoàng Hà (2009) Phát triển hệ thống tái sinh in vitro ở cây đậu tƣơng (Glycine max L.Merrili) phục vụ chuyển gen. Tạp chí khoa học và công nghệ . Đại học Thái Nguyên 52(4): 82-88. 37. Nguyễn Thị Thúy Hƣờng (2011). Luận án tiến sĩ sinh học. Đại học Thái Nguyên. 38. Owens, L.D. and D.E. Cress (1985) Genotypic variability of soybean response to Agrobacterium strains harboring the Ti or Ri plasmids. Plant Physiol. 77: 87–94. 39. Olhoft P.M., Donovan C.M., Somers D.A. (2006), ―Soybean (Glycine max) transformation using mature cotyledonary node explants‖. Methods in molecular biology: Agrobacterium protocols, 2 nd ed. Humana Press Inc, Totowa, NJ: pp. 385-396. 40. Padgette, S.R., K.H.Kolacz, X.Delannay, D.Re, B.J.LaVallee, C.N. Tinius, K.Rhodes, Y.I.Otero, G.F. Barry, D.A. Eichholtz et al. (1995) Development, identification, and characterization of a glyphosate-tolerant soybean line. Crop Sci. 35: 1451–1461. 41. Paz, M.M., J.C. Martinez, A.B.Kalvig, T.M. Fonger and K. Wang (2006) Improved cotyledonary n ode method using an alternative explant derived from mature seed for efficient Agrobacterium-mediated soybean transformation. Plant Cell Rep. 25: 206–213. 42. Qi, Q., J.Huang, J.Crowley, L.Ruschke, B.S. Goldman, L.Wen and W.D.Rapp (2011) Metabolically engine ered soybean seed with en- hanced threonine levels: biochemical characterization and seed-specific expression of lysine-insensitive variants of aspartate kinases from the enteric bacterium Xenorhabdus bovienii. Plant Biotechnol. J. 9: 193–204. 43. Schmutz, J., S.B. Cannon, J.Schlueter, J. Ma, T.Mitros, W.Nelson, D.L. Hyten, Q.Song, J.J.Thelen, J.Cheng et al. (2010) Genome se- quence of the alaeopolyploid soybean. Nature 463: 178–183. 44. Stewart, C.N.J., M.J.Adang, J.N. All, H.R. Boerma, G. Cardineau, D. Tucker and W.A.Parrott (1996) Genetic transformation, recovery, and characterization of fertile soybean transg enic for a synthetic Bacillus thuringiensis cryIAc gene. Plant Physiol. 112: 121–129. 45.Tavva, V.S., Y.H.Kim, I.A. Kagan, R.D.Dinkins, K.H. Kim and G.B. Collins (2007) Increased α -tocopherol content in soybean seed overexpressing the Perilla frutescens γ - tocopherol methyltrans-ferase gene. Plant Cell Rep. 26: 61–70. 46. Takagi, K., K. Nishizawa, A. Hirose, A.Kita and M.Ishimoto (2011) Manipulation of saponin biosynthesis by RNA interference-mediated silencing of β-amyrin synthase gene expression in soy-bean. Plant Cell Rep. 30: 1835–1846. 47. Tougou,M., N.Yamagishi, N. Furutani, Y. Shizukawa, Y. Takahata and S. Hidaka (2007) Soybean dwarf virus -resistant transgenic soy- beans with the sense coat protei n gene. Plant Cell Rep. 26: 1967–1975. 48. Tabashnik, B.E. (1994) Evolution of resistance to Bacillus thuringiensis. Annu. Rev. Entomol. 39: 47–79. 49. Trần Thị Cúc Hòa (2007). Nghiên cứu khả năng đáp ứng chuyển nạp gen của các giống đậu tƣơng trồng ở Việt Nam. Tạp chí Nông nghiệp và phát triển nông thôn. 18: 11-16. 50. Umezawa,T., T.Sakurai, Y. Totoki, A.Toyoda, M. Seki, A.Ishiwata, K.Akiyama, A.Kurotani, T.Yoshida, K.Mochida et al. (2008) Sequencing and analysis of approximately 40000 soybean cDNA clones from a full-length-enriched cDNA library. DNA Res. 15: pp. 333–346. 51. Valente, M.A.S., J.A.Q.A.Faria, J.R.L. Soares- Ramos, P.A.B. Reis, G.L. Pinheiro, N.D. Piovesan, A.T.Morais, C.C.Menezes, M.A.O. Cano and L.G. Fietto et al. (2009) The ER luminal binding protein (BiP) mediates an increase in drought tolerance in soybean and delays drought-induced leaf senescence in soybean and tobacco. J. Exp. Bot. 60: 533–546. 52. Yamada,Y., K.Nishizawa, M. Yokoo, H.Zhao, K. Onishi, M.Teraishi, S. Utsumi, M.Ishimoto and M. Yoshikawa (2008) Anti-hypertensive activity of genetically modified soybean seeds accumulating novo-kinin. Peptides 29: 331–337. 53. Zhu, S., D.R.Walker, H.R.Boerma, J.All and W.A.Parrott (2008) Ef-fects of defoliating insect resistance QTLs and a cry1Ac transgene in soybean near-isogenic lines. Theor. Appl. Genet. 116: 455–463. 54. Yamada T., Takagi K., Ishimoto M., (2012) Recent advances in soybean transformation and their application to molecular breeding and genomic analysis. Breeding Science 61: 480–494. 55. Rao, S.S. and D. Hildebrand (2009) Changes in oil content of transgen-ic soybeans expressing the yeast SLC1 gene. Lipids 44: 945–951. 56. Zeng,P., D.A.Vadnais, Z. Zhang and J.C.Polacco (2004) Refined glu-fosinate selection in Agrobacterium-mediated transformation of Lò Thị Mai Thu và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 115(01): 3 - 12 12 soybean [Glycine max (L.) Merrill]. Plant Cell Rep. 22: 478–482. 57. Walker, D., H.R. Boerma, J. All and W.Parrott (2002) Combining cry1Ac with QTL alleles from PI 229358 to improve soybean resis-tance to lepidopteran pests. Mol. Breed. 9: 43–51. 58. Zhang, Z., A.Xing, P.Staswick and T.E. Clemente (1999) The use of glufosinate as a selective agent in Agrobacterium-mediated trans- formation of soybean. Plant Cell Tissue Organ Cult. 56: 37–46. 59. Setchell, K.D. (1998) Phytoestrogens: the biochemistry , physiology, and implications for human health of soy isoflavones. Am. J. Clin. Nutr. 68: 1333S–1346S 60. Yadav, N.S. (1996) Genetic modific ation of soybean oil quality. In : Verma, D.P.S. and R.C.Shoemaker (eds.) Soybean: Genetics, Molecular Biology and Biotechnology, Cab International, USA, 165–188. 61. http:/ /www.isaaa.org 62. http//www.ncbi.nih SUMMARY COTYLEDONARY NODE- AGROBACTERIUM –MEDIATED TRANSFORMATION Lo Thi Mai Thu 1 , Nguyen Thu Hien 2 , Chu Hoang Ha 3 , Chu Hoang Mau 4* 1 Taybac University, 2College of Medicine and Pharmacy - TNU, 3Institute of Biotechnology, 4 College of Education - TNU Soybean (Glycine max ( L. ) Merrill) is a short- day crop, have the economic value and nutritional value and is soil improvement crops. Soybean is plant group have tolerance resistant at low levels to the effects unfavorable factors from the external environment (drought and salinity) and susceptible to diseases caused by viruses and bacteria. Research to improve tolerance of soybean plants by gene transfer techniques have become interesting topic of Vietnam scientists. In this paper we presented summarize the studies on transgenic technique by cotyledonary node– Agrobacterium-mediated. Summed up the achievements of the world and in Vietnam as the theoretical basis for the research and application of gene transfer technique with the aim of improving the stress tolerance from external conditions, enhanced resistance to pathogenic factors in soybean cultivars in Vietnam. Keywods: A. tumefaciens, cotyledonary node, gene transfer, Glycine max, resistance Ngày nhận bài:18/11/2013; Ngày phản biện:12/12/2013; Ngày duyệt đăng: 07/02/2014 Phản biện khoa học: PGS.TS. Nguyễn Thị Tâm – Trường Đại học Sư phạm – ĐHTN * Tel: 0913 383289, Email: mauchdhtn@gmail.com