Chuẩn đoán bệnh truyền nhiễm

các môi trường đặc thích hợp. Các môi trường thạch thường, thạch máu thường được sử dụng cho nhiều loại vi khuẩn. Tuy vậy, đối với nhiều vi khuẩn mầm bệnh có thể sử dụng trực tiếp môi trường phân biệt (như các môi trường Endo, Istrati, EMB,... cho một số trực khuẩn đường ruột, môi trường muối - kiềm cho các Vibrio, môi trường Lowenstein với trực khuẩn lao,...). Với vi khuẩn hiếu khí, bằng que cấy vô trùng lấy một lượng nhỏ bệnh phẩm phết lên một vị trí trên bề mặt môi trường nuôi cấy khởi đầu rồi cũng bằng que cấy đó, hoặc một que cấy vô trùng khác, từ vị trí vết bôi vạch lên bề mặt môi trường đó đường gấp khúc không chồng lên nhau và càng dài càng tốt. Sau khi ủ ở điều kiện thích hợp từ môi trường đó, đặc biệt ở những vùng cuối cùng của đường vạch có mật độ vi khuẩn thấp, ta có thể thu được những khuẩn lạc riêng rẽ có những dấu hiệu đặc trưng đối với vi khuẩn mầm bệnh cần đồng định. Chọn một số khuẩn lạc đại diện để nuôi cấy tiếp trên môi trường đặc mới để có lứa cấy thuần khiết dưới dạng những khuẩn lạc riêng rẽ hoặc canh khuẩn lỏng. Chú ý rằng trên môi trường tuyển lựa có thể có những tế bào vi khuẩn khác loại không thể hình thành khuẩn lạc nhưng vẫn sống và có thể phát triển trên môi trường khác và, vì vậy, cần tránh để que cấy chạm vào bề mặt môi trường một cách không cần thiết. Để đồng định cần vận dụng các thử nghiệm thích hợp như nghiên cứu hình thái, tính chất bắt màu Gram,... các tính trạng sinh lý (phát triển trên môi trường nghèo hoặc có chứa một số chất nhất định ở một nồng độ nhất định như muối mật, mật, NaCl, KCN,...), các tính trạng sinh hóa (chuyển hóa các chất như lên men đường có sinh hơi hoặc không sinh hơi, hình thành axit hữu cơ, acetoin,... sản sinh ureaza, sinh indol,...), tính gây bệnh đối với động vật, với phôi gà và lứa cấy tế bào (vero,...), thành phần protein tế bào, cấu trúc kháng nguyên,... 3.2. Virut Việc nuôi cấy phân lập virut đòi hỏi phải có môi trường tế bào sống như động vật thí nghiệm, lứa cấy tế bào tổ chức, trứng gà đang phát dục (phôi gà) với một số xử lý đối với bệnh phẩm. Bệnh phẩm được nghiền nhỏ, pha với nước sinh lý cho có đủ độ loãng nhất định, thêm chất kháng sinh (thường là penicillin và streptomycin) để diệt vi khuẩn. Để loại bỏ vi khuẩn, có thể lọc bệnh phẩm đã nghiền (thường với cát vô trùng để tăng khả năng giải phóng virion) qua lọc vi khuẩn (đường kính lỗ khổng <0,22 μm) rồi cấy vào môi trường lứa cấy tế bào một lớp, phôi gà hoặc động vật thí nghiệm. Với động vật thí nghiệm cần theo dõi thường xuyên các triệu chứng lâm sàng, sau đó mổ kiểm tra bệnh tích, dựa trên các triệu chứng và bệnh tích điển hình mà khẳng định sự phát triển của virut. Nếu không có biểu hiện lâm sàng và bệnh tích, cần thực hiện phản ứng huyết thanh học để phát hiện và trắc định kháng thể, so sánh hai kết quả hàm lượng (hiệu giá) kháng thể trước và sau quá trình theo dõi vật sau tiêm truyền có thể khẳng định về sự phát triển của virut trong cơ thể động vật. Ở lứa cấy tế bào, nhiều loại virut gây hiệu quả bệnh lý tế bào (CPE) hay bệnh tích tế bào. Dựa vào CPE đặc trưng ta có thể xác nhận được sự phát triển của virut phát triển trong lứa cấy tế bào tổ chức. Nếu không biểu hiện CPE có thể kiểm tra sự hiện diện của kháng nguyên bằng phản ứng huyết thanh học. III. Chẩn đoán huyết thanh - miễn dịch học 1. Phương pháp huyết thanh học Phương pháp huyết thanh học giúp ta phát hiện kháng nguyên hoặc kháng thể trên cơ sở phát hiện sự hình thành tổ hợp kháng nguyên - kháng thể khi trộn một thành phần đã biết (kháng nguyên hoặc kháng thể) với một dịch nghi có chứa yếu tố kia (kháng thể hoặc kháng nguyên). Phát hiện kháng nguyên trong bệnh phẩm chứng tỏ con vật bị cảm nhiễm mầm bệnh có kháng nguyên tương ứng. Tuy nhiên, phản ứng phát hiện kháng nguyên thường có độ nhạy thấp và khó có được bệnh phẩm thích hợp đặc biệt khi động vật còn sống. Vì vậy, người ta thường vận dụng phản ứng phát hiện kháng thể. Phản ứng này có nhược điểm là khó giải thích kết quả phản ứng. Kết quả dương tính thường nói rằng trong quá khứ cơ thể động vật đã tiếp xúc với kháng nguyên tương ứng vừa có thể do cảm nhiễm tự nhiên, vừa có thể do đã được tiêm phòng. Bên cạnh đó, cảm nhiễm tự nhiên cũng có thể là thui, mầm bệnh chỉ kích thích miễn dịch nhưng sau đó không tồn tại trong cơ thể. Như vậy, ngay cả khi đã loại trừ trường hợp đáp ứng miễn dịch do vacxin thì nếu giết hủy loại thải những con vật kháng thể dương tính thì vẫn có thể là lạm sát. Tuy nhiên, trong trường hợp bệnh tiến triển nếu lấy máu kiểm tra kháng thể hai lần mà thấy có sự gia tăng lượng kháng thể chứng tỏ bệnh do mầm bệnh tương ứng đang tiến triển. Về mặt kỹ thuật mặc dù nguyên tắc của phản ứng kháng nguyên - kháng thể là đơn giản, nhưng tổ hợp kháng nguyên - kháng thể được hình thành thường khó phát hiện nếu không có những thủ thuật thích hợp. Chính vì vậy, xuất hiện những phương pháp phân tích khác nhau. Có thể nói, mỗi phương pháp là một thủ thuật phát hiện tổ hợp kháng nguyên - kháng thể. Ngoài ra, các phản ứng định lượng (thường bán định lượng) như xác định hiệu giá kháng thể có ý nghĩa quan trọng trong đánh giá đáp ứng miễn dịch tập đoàn. 1.1. Phản ứng kết tủa Phản ứng kết tủa là phản ứng huyết thanh học để phát hiện kháng nguyên khi có kháng thể biết trước và để phát hiện kháng thể khi có kháng nguyên biết trước thông qua việc phát hiện sự kết hợp kháng nguyên với kháng thể đặc hiệu, trong đó kháng nguyên là chất tan. Do kháng nguyên là chất tan nên phản ứng dù xảy ra cũng có thể không được nhận biết bởi vì tổ hợp kháng nguyên kháng thể sau khi hình thành có thể hòa lẫn (xáo trộn) cùng với dung dịch do tác động của dòng đối lưu. Để khắc phục, phản ứng này được thực hiện trong điều kiện giảm thiểu dòng đối lưu của dung dịch. Có thể thực hiện phản ứng kết tủa trong ống nghiệm nhỏ và trong keo (gel) agar (hoặc agarose). Với ống nghiệm nhỏ người ta cho kháng nguyên (dịch chiết từ bệnh phẩm, phải trong suốt) vào ống sau đó bằng ống hút (pipet) có đầu nhỏ lấy một lượng tương đương kháng huyết thanh (kháng thể), đưa đầu ống pipet vào sâu tận đáy ống nghiệm rồi nhả từ từ cho kháng huyết thanh đội dần lớp kháng nguyên lên. Kết quả ta có hai lớp dịch trong ống. Để yên ở nhiệt độ phòng, sau một thời gian (vài chục phút) nếu có phản ứng xảy ra ta sẽ thấy một vòng kết tủa màu trắng gần giữa hai lớp dịch (thường thấp hơn ranh giới giữa hai lớp dịch một chút). Kỹ thuật này thường dùng phát hiện kháng nguyên giáp mô vi khuẩn nhiệt thán (phản ứng Ascoli). Phản ứng kết tủa khuyếch tán trong thạch có một số biến thể: khuyếch tán một chiều, khuyếch tán hai chiều. Kỹ thuật khuyếch tán một chiều ít được sử dụng do phải tiêu tốn lượng lớn yếu tố phản ứng (kháng huyết thanh hoặc kháng nguyên). Người ta pha thạch (agar hoặc agarose) vào dung dịch sinh lý NaCl 0,8 - 0,85% (pH 7,2) ở nồng độ thạch khoảng 1% (0,8 - 2,0% agar, phụ thuộc vào chất lượng thạch, có thể kiểm tra bằng thực nghiệm), đun tan chảy đều rồi ủ duy trì ở 50 °C. Ở nhiệt độ này thạch ở trạng thái lỏng, có thể cho vào đó một lượng kháng nguyên (hoặc kháng thể), trộn đều rồi đổ thành bản thạch trên phiến kính (hoặc trong đĩa Petri), đục lỗ, mỗi lỗ cho một loại mẫu cần xét nghiệm. Nhỏ vào đó một lượng kháng thể (hoặc kháng nguyên). Ủ vào buồng ẩm ở nhiệt độ phòng hoặc 4 °C. Sau một thời gian nếu có phản ứng xảy ra ta sẽ thấy vòng kết tủa trắng xuất hiện quanh lỗ tương ứng. Phản ứng kết tủa khuyếch tán hai chiều được thực hiện một cách đơn giản nhất với hai lỗ nhỏ được đục trong khối thạch agarose, một lỗ chứa kháng nguyên còn lỗ kia chứa kháng thể. Ủ trong buồng giữ ẩm một số ngày và theo dõi hàng ngày, nếu phản ứng xảy ra ta sẽ thấy đường kết tủa trắng xuất hiện giữa hai lỗ (ở vùng có tỷ lệ hóa trị kháng thể và hóa trị kháng nguyên xấp xỉ 1). Tuy nhiên, phản ứng này thường có độ nhạy rất thấp do đó cần vận dụng phương pháp cải tiến như dưới đây. Trên một phiến thạch cần đục 7 lỗ (đường kính khoảng 3 mm, một lỗ ở tâm và sáu lỗ ở xung quanh (biên), đều cách lỗ tâm và cách nhau khoảng 3 - 3,5 mm. Như vậy ba lỗ liền kề nhau luôn tạo một tam giác đều. Nếu để phát hiện kháng nguyên thì nhỏ vào lỗ tâm một lượng kháng huyết thanh chuẩn (kháng thể) rồi nhỏ vào hai lỗ biên đối diện nhau một lượng kháng nguyên chuẩn. Còn bốn lỗ biên còn lại dùng để chứa các mẫu kháng nguyên cần kiểm. Ủ vào buồng ẩm, kiểm tra kết quả hàng ngày. Nếu các lỗ kiểm đều không chứa kháng nguyên tương ứng thì giữa kháng nguyên chuẩn và kháng thể chuẩn phải xuất hiện đường tủa chuẩn thẳng kéo dài từ phía một lỗ cần kiểm sang phía một lỗ cần kiểm đối diện. Nếu có kháng nguyên ở lỗ cần kiểm nào đó thì đường kết tủa chuẩn sẽ uốn cong trước lỗ đó và hướng về phía lỗ tâm. Trong trường hợp kháng nguyên ở lỗ cần kiểm có nồng độ cao, đường kết tủa trắng sẽ xuất hiện giữa lỗ đó với lỗ tâm và cùng với đường kết tủa chuẩn tạo thành một đường cong liên tục. Sự giao cắt của hai đường tủa (chuẩn và kiểm) chứng tỏ thành phần kháng thể trong kháng huyết thanh chuẩn là đa giá còn kháng nguyên kiểm, ít nhất là, có thành phần không cùng nhóm với kháng nguyên chuẩn. Để phát hiện kháng thể thì cho kháng nguyên chuẩn vào lỗ tâm, một cặp lỗ đối diện chứa kháng huyết thanh chuẩn, bốn lỗ còn lại chứa huyết thanh cần kiểm. Kết quả biểu hiện dưới dạng các đường kết tủa tương tự trường hợp trên. 1.2. Phản ứng ngưng kết Phản ứng ngưng kết là phản ứng huyết thanh học để phát hiện kháng nguyên khi có kháng thể biết trước và để phát hiện kháng thể khi có kháng nguyên biết trước thông qua việc phát hiện sự kết hợp kháng nguyên với kháng thể đặc hiệu, trong đó kháng nguyên là hữu hình (tế bào vi khuẩn, hạt nhỏ, tế bào hồng cầu,...). Nếu để phát hiện kháng thể, kháng nguyên là tế bào vi khuẩn có thể được nhuộm màu (bằng crystal violet, rose bengal), khi đó có thể thực hiện phản ứng ngưng kết nhanh với huyết thanh, với máu nguyên hoặc với sữa nguyên. Phản ứng ngưng kết nhanh với máu nguyên được thực hiện bằng cách trộn một giọt máu nguyên vừa lấy từ động vật bằng một vòng (khuyên cấy vi khuẩn) trộn với một giọt nhỏ dịch kháng nguyên đã được nhuộm màu đặt sẵn trên một phiến kính. Kết quả dương tính biểu hiện dưới dạng các hạt trong giọt co cụm lại làm cho dịch còn lại trở nên trong. Nếu không phản ứng (âm tính) các tế bào vi khuẩn nhuộm màu vẫn phân bố đều trong giọt làm dịch tiếp tục đục đều. Phản ứng này dùng để phát hiện nhanh tình hình nhiễm Salmonella gallinarum-pullorum (hay Salmonella Gallinarum-Pullorum gây bệnh bạch lị gà con và thương hàn gà trưởng thành) trong đàn gia cầm và một số bệnh nhiễm khuẩn khác. Phản ứng ngưng kết nhanh với sữa nguyên được thực hiện để phát hiện bò cái, cừu cái mang mầm bệnh sẩy thai truyền nhiễm và một số bệnh nhiễm khuẩn khác. Cho một ít sữa tươi mới vào ống nghiệm rồi cho kháng nguyên vi khuẩn đã nhuộm vào lắc trộn đều. Nếu phản ứng dương tính, các tế bào vi khuẩn sẽ co cụm lại với nhau và bám vào lớp kem nổi lên bề mặt sữa với màu thuốc nhuộm vi khuẩn kháng nguyên. Ngược lại các tế bào vi khuẩn có màu phân bố đều trong sữa khi phản ứng âm tính. Phản ứng ngưng kết nhanh cho kết quả nhanh nhưng độ nhạy thấp và không thể định lượng để so sánh hàm lượng kháng thể như phản ứng chậm trong ống nghiệm. Cho vào mỗi ống của một dãy ống nghiệm 1 phần (hoặc 4 phần, hoặc 9 phần) nước sinh lý rồi cho vào ống nghiệm thứ nhất (đầu dãy) 1 phần huyết thanh, trộn rồi chuyển sang ống nghiệm tiếp theo bằng lượng huyết thanh đã đưa vào (1 phần) và cứ tiếp tục trộn và chuyển như vậy cho đến hết dãy thì vứt bỏ bằng lượng đó. Ta có dãy huyết thanh pha loãng 2 lần (hoặc 5 lần, hoặc 10 lần). Cho vào tất cả các ống nghiệm một lượng ổn định kháng nguyên (vi khuẩn đã biết), trộn đều rồi để yên ở nhiệt độ phòng, kiểm tra phản ứng sau khoảng 10 - 30 phút. Phản ứng dương tính thể hiện ở dạng các tế bào vi khuẩn ở ống tương ứng ngưng tụ lại làm đục cả ống nghiệm, trong khi ở các ống âm tính vi khuẩn (kháng nguyên) chìm xuống đáy ống làm dịch trở nên trong. Ngưng kết thấy rõ ở những ống nghiệm có nồng độ kháng nguyên và kháng thể gần bằng nhau, vì vậy ở những ống có nồng độ kháng thể cao (đầu dãy) có thể không thấy ngưng kết. Nhờ phản ứng này ta có thể xác định được hiệu giá kháng thể trong huyết thanh bị kiểm. Hiệu giá kháng thể là độ pha loãng lớn nhất của huyết thanh (hoặc nhũ thanh,...) còn cho phản ứng dương tính. Phản ứng ngưng kết có thể thực hiện theo chiều khác để phát hiện kháng nguyên đặc hiệu tức là xác định typ/dạng huyết thanh học của vi khuẩn hoặc vi sinh vật khác. Khi đó thường phải có bộ kháng huyết thanh đa giá (xác định nhóm) và đơn giá (xác định typ). Trong thực tế các virut được coi là kháng nguyên hòa tan và không thể thực hiện phản ứng ngưng kết. Tuy vậy, bằng cách gắn kết virut lên hồng cầu người ta có thể tạo được kháng nguyên hữu hình đặc hiệu virut có tính ngưng kết hoàn hảo với kháng thể và được áp dụng trong một biến thể của phản ứng huyết thanh học, phản ứng ngưng kết hồng cầu gián tiếp phát hiện và bán định lượng kháng thể. Đồng thời, kháng nguyên này cũng còn được sử dụng trong phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu gián tiếp phát hiện kháng nguyên bằng cách lấy kháng huyết thanh chuẩn cho tiếp xúc trước với bệnh phẩm chứa kháng nguyên nghi rồi đo lại hàm lượng (hiệu giá) kháng thể bằng phản ứng ngưng kết hồng cầu gián tiếp. Sự sụt giảm hiệu giá kháng thể trong kháng huyết thanh chuẩn chứng tỏ có kháng nguyên đặc hiệu trung hòa kháng thể đó. 1.3. Phản ứng cố định bổ thể Phản ứng cố định bổ thể (CFR) hay còn gọi là phản ứng kết hợp bổ thể là phản ứng huyết thanh học phát hiện tổ hợp kháng nguyên - kháng thể thông qua vận dụng thuộc tính gây dung giải tế bào, kể cả tế bào hồng cầu, của hệ thống bổ thể (các enzym trong huyết tương động vật có vai trò trong miễn dịch không đặc hiệu) một khi hệ thống này được hoạt hóa nhờ kháng thể khi kháng thể hình thành tổ hợp kháng nguyên - kháng thể. Phản ứng này gồm hai hệ thống: 1) hệ thống phản ứng chính và 2) hệ thống phản ứng hiển thị (hệ thống phụ, hay hệ thống dung huyết). Bổ thể là một hệ thống gồm 9 protein (C1 đến C9) hòa tan trong huyết tương ở trạng thái vô hoạt và có thể được hoạt hóa theo phản ứng dây chuyền từ C1 đến C9 một khi C1 được hoạt hóa (con đường cổ điển) hoặc C3 được hoạt hóa (con đường nhánh). Yếu tố C1 được hoạt hóa nhờ phần Fc của kháng thể khi kháng thể kết hợp với kháng nguyên (Fc từ trạng thái vô hoạt sang trạng thái hoạt động của một enzym). Khi tổ hợp bổ thể được hoạt hóa một số yếu tố sản phẩm của bổ thể được hình thành và gắn kết lên cấu trúc màng tế bào chất làm hình thành tổ hợp tấn công màng (MAC - membrane attacking complex) là những lỗ khổng bất thường trên màng tế bào chất qua đó tế bào chất bị thoát ra ngoài (dung bào) (bên cạnh các phản ứng quá mẫn, viêm và hoạt hóa thực bào,...). Tuy nhiên, các bổ thể là những protein mẫn cảm với nhiệt. Đun ở 56 - 58 °C nhanh chóng làm biến tính bổ thể, trong khi nếu đun ở nhiệt độ này sau 30 phút kháng thể vẫn giữ nguyên hoạt tính. Ở hệ thống phản ứng chính người ta trộn kháng nguyên chuẩn (1 ml) với huyết thanh (1 ml) cần kiểm đã được đun nóng vô hoạt bổ thể rồi thêm vào đó một lượng ở nồng độ làm việc của bổ thể là huyết thanh chuột lang tươi mới. Sau khi ủ 15 phút ở 37 °C thì cho thêm vào đó một lượng nhất định (1 ml) hỗn hợp hệ thống phụ pha sẵn. Lại ủ như trên, sau 15 phút kiểm tra kết quả. Phản ứng chính dương tính thể hiện dưới dạng hồng cầu chìm xuống đáy ống nghiệm (phản ứng phụ âm tính). Ngược lại, phản ứng chính âm tính thể hiện dưới dạng dịch trong ống nghiệm có màu đỏ của hemoglobin (phản ứng phụ dương tính). Nồng độ làm việc của bổ thể được xác định trước (vào đầu ngày làm việc) nhờ dãy ống pha loãng dần huyết thanh chuột lang trong nước sinh lý (1 ml mỗi ống) rồi cho vào tất cả các ống trong dãy một lượng (1 ml) hỗn hợp hệ thống phụ pha sẵn. Trong hệ thống phụ này có kháng nguyên là huyền dịch 6% tế bào hồng cầu cừu trộn đều với kháng thể là kháng huyết thanh thỏ tối miễn dịch (mẫn hóa) với hồng cầu cừu gọi là hemolysin. Sau khi ủ 15 phút ở 37 °C, trong ống nghiệm có đủ bổ thể sẽ thấy dung huyết (dịch đỏ đều) còn các ống có nồng độ bổ thể quá thấp sẽ không xuất hiện dung huyết (hồng cầu chìm xuống đáy ống, dịch trên trong). Nồng độ làm việc của bổ thể là ở ống có độ pha loãng lớn nhất còn cho phản ứng dung huyết. Pha huyết thanh chuột lang tươi mới ở nồng độ này ta sẽ có dung dịch bổ thể ở nồng độ làm việc. Lượng làm việc của bổ thể được giữ ổn định (1 ml) trong quá trình thực hiện phản ứng. 1.4. Phản ứng HI (ngăn trở ngưng kết hồng cầu) Nhiều virut có thuộc tính ngưng kết hồng cầu. Chúng có thụ thể tương ứng với thụ thể có trên bề mặt hồng cầu, do đó kết nối các hồng cầu liền kề lại với nhau thành mạng đa chiều không chìm xuống đáy tự nhiên nhờ tỷ trọng của hồng cầu cao hơn tỷ trọng dung dịch sinh lý. Phản ứng ngưng kết hồng cầu của virut giúp ta phát hiện được sự hiện diện cũng như bán định lượng virut tương ứng. Đồng thời, người ta còn lợi dụng đặc tính này của virut để xác định sự hiện diện cũng như hiệu giá kháng thể đặc hiệu trong huyết thanh cần kiểm dưới dạng phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI: hemagglutination inhibition reaction). Trước tiên người ta phải thực hiện phản ứng ngưng kết hồng cầu để xác định hiệu giá của virut chuẩn rồi trên cơ sở đó pha dịch virut làm việc với hiệu giá 4 đơn vị ngưng kết (4 HA). Phản ứng này được thực hiện trên khay nhựa vi chuẩn độ (Microtitration plate) 96 lỗ (mỗi lỗ chứa khoảng 0,4 ml) đáy U hoặc V. Cho vào mỗi lỗ 50 μl nước sinh lý NaCl rồi cho vào lỗ thứ nhất 50 μl virut, trộn và chuyển sang lỗ thứ hai, rồi tiếp tục trộn chuyển như vậy đến hết lỗ thứ 10 thì vứt bỏ 50 μl. Hai lỗ 11 và 12 dùng làm đối chứng âm tính chỉ chứa nước sinh lý để xác định thời điểm đọc kết quả tốt nhất. Cho 50 μl huyền dịch hồng cầu thích hợp (0,5% hoặc 1%, khối lượng tươi trên thể tích, luôn ở trạng thái khuấy đều). Trộn đều rồi để yên ở nhiệt độ phòng 15 đến 60 phút, đọc kết quả khi hai lỗ 11 và 12 có hồng cầu chìm xuống tâm đáy lỗ hoàn toàn. Hồng cầu ngưng kết tạo mạng đa chiều không chìm xuống tâm đáy lỗ khay mà dàn trải đều khắp lỗ hoặc nếu chìm chúng cũng tỏa rộng và thường tạo một lớp nhăn nheo khắp mặt đáy lỗ. Hiệu giá kháng thể là độ pha loãng lớn nhất còn cho kết quả dương tính. Nồng độ virut làm việc phải chứa 4 HA chính là nồng độ của virut ở độ pha loãng cách đó hai lỗ khay (22=4). Pha virut gốc để có nồng độ này rồi kiểm tra lại với phản ứng trong 4 lỗ khay có nồng độ 2 HA, 1 HA, 1/2 HA và 1/4 HA. Nếu dịch virut bị nhạt (tức ít nhất có một trong hai lỗ nửa bên trái không ngưng kết) thì pha thêm virut cho đủ sao cho hai lỗ đầu có ngưng kết rõ còn hai lỗ sau không thấy ngưng kết. Ngược lại nếu virut quá đặc (có ít nhất ba lỗ ngưng kết) thì pha thêm nước sinh lý để vừa đủ tạo ngưng kết ở hai lỗ. Phản ứng HI cũng được tiến hành trên khay nhựa vi chuẩn độ 96 lỗ, mỗi dãy lỗ khay cho một phản ứng. Đầu tiên pha huyết thanh theo cấp số 2. Cho vào mỗi lỗ 50 μl nước sinh lý NaCl rồi cho vào lỗ thứ nhất 50 μl huyết thanh kiểm, trộn và chuyển sang lỗ thứ hai, rồi tiếp tục trộn chuyển như vậy đến hết lỗ thứ 10 thì vứt bỏ 50 μl. Cho vào mỗi lỗ từ lỗ 1 đến lỗ 11 (đối chứng âm) 50 μl dịch virut làm việc 4 HA, trộn đều và ủ 5 - 10 phút ở nhiệt độ phòng. Sau đó cho vào tất cả các lỗ (lỗ 1 đến 12) 50 μl huyền dịch hồng cầu đã dùng để xác định hiệu giá HA. Hai lỗ 11 và 12, như vậy, dùng làm đối chứng âm tính (chứa chỉ virut và hồng cầu) và dương tính (chứa chỉ nước sinh lý và hồng cầu). Để ở nhiệt độ phòng và đọc kết quả sau 15 đến 60 phút phụ thuộc vào kết quả chìm hồng cầu ở lỗ thứ 12 (đối chứng HI dương tính: hồng cầu phải chìm hoàn toàn xuống tâm đáy lỗ khay). Hiệu giá kháng thể là độ pha loãng cao nhất của huyết thanh mà ở đó còn thấy ngăn trở được ngưng kết (hồng cầu chìm xuống đáy lỗ). 1.5. Các phương pháp kháng thể đánh dấu Các phương pháp kháng thể đánh dấu gồm phương pháp miễn dịch huỳnh quang, miễn dịch phóng xạ, miễn dịch enzym và miễn dịch ferritin. Phương pháp cuối cùng áp dụng với kính hiển vi điện tử để kiểm tra cấu trúc phân tử trên bề mặt tế bào hoặc tổ chức nhờ mật độ điện tử cao của ferritin, không phổ biến trong chẩn đoán. Bản chất các phương pháp này là sử dụng các kháng thể (thường là kháng thể đơn dòng) được gắn kết (đánh dấu) với một chất phát huỳnh quang (kháng thể đánh dấu huỳnh quang), hoặc chất phóng xạ (kháng thể đánh dấu phóng xạ), hoặc một enzym chuyển hóa làm cơ chất không màu phát màu (kháng thể đánh dấu enzym). Chúng còn được gọi chung là conjugat (conjugate). Ta có conjugat trực tiếp nếu đó là kháng thể đặc hiệu epitop của mầm bệnh hay đối tượng cần nghiên cứu, hoặc là conjugat gián tiếp nếu đó là kháng thể đặc hiệu gamma-globulin của loài động vật cần nghiên cứu. Phản ứng miễn dịch huỳnh quang trực tiếp bắt đầu bằng việc cố định kháng nguyên cần kiểm lên phiến kính hiển vi (thường bằng aceton lạnh), sau đó phủ conjugat trực tiếp 30 phút trong buồng ẩm. Rửa bằng nước rồi soi kính hiển vi huỳnh quang (trong tối) với bức xạ kích thích thích hợp với thuốc nhuộm huỳnh quang gắn conjugat, nếu thấy tiêu bản phát màu huỳnh quang đặc hiệu là kết quả dương tính. Phản ứng miễn dịch huỳnh quang gián tiếp bắt đầu bằng việc cố định kháng nguyên chuẩn nếu để phát hiện kháng thể (hoặc kháng nguyên cần kiểm) lên phiến kính hiển vi, sau đó phủ huyết thanh cần kiểm (hoặc kháng huyết thanh chuẩn), cho tiếp xúc 30 phút ở trong buồng ẩm, rửa bằng nước rồi lại phủ bằng conjugat huỳnh quang gián tiếp chống gamma-globullin loài cho huyết thanh lần phủ trước. Sau 30 phút tiếp xúc lại rửa, để khô và hiển vi huỳnh quang. Kết quả dương tính tương tự phương pháp miễn dịch huỳnh quang trực tiếp. Tuy nhiên, phương pháp gián tiếp có độ nhạy cao hơn và tiện hơn do có thể nghiên cứu kháng nguyên lẫn nghiên cứu kháng thể. Phản ứng miễn dịch phóng xạ sử dụng conjugat phóng xạ. Tiến trình cũng bắt đầu bằng việc cố định (trên phiến kính hoặc trên màng), phủ và rửa tương tự phản ứng miễn dịch huỳnh quang. Tuy nhiên, kết quả phản ứng được đọc nhờ ép bản phản ứng lên một phim X-quang, để khoảng 30 - 60 phút thì rửa hiển thị phim. Vệt đen trên phim tương ứng vị trí tiêu bản cho phép kết luận kết quả dương tính. Cũng có thể đọc kết quả nhờ ống đo phóng xạ (scintillation counter) bằng cách cho tiêu bản tiếp xúc với đầu dò đọc của thiết bị. Phản ứng miễn dịch enzym gồm nhiều biến thể, sử dụng khay nhựa polystyren để hấp phụ protein (ELISA) hoặc cố định protein lên màng nitrocelluloza hay nylon (immunoanalysis, hay Western analysis). Các biến thể này đều có thể sử dụng conjugat trực tiếp lẫn conjugat gián tiếp. Phản ứng trực tiếp chỉ phát hiện được kháng nguyên trong khi phản ứng gián tiếp phát hiện được cả kháng nguyên (nếu có kháng thể đặc hiệu) và kháng thể (nếu có kháng nguyên đặc hiệu). Phương pháp ELISA trực tiếp bắt đầu từ việc cố định (hấp phụ) protein kháng nguyên cần kiểm lên đáy và thành của lỗ khay chuyên dụng (khay ELISA) nhờ phản ứng kiềm của môi trường trong một đêm. Sau khi rửa khay bằng dung dịch PBS (3 lần, có pha Tween 20 ở mức 0,5%), khay được phủ bổ sung bằng dung dịch protein huyết thanh bê hoặc albumin trứng (blocking), rửa lại rồi cho conjugat trực tiếp tiếp xúc kháng nguyên trong khoảng 1 giờ, rửa rồi cho dung dịch cơ chất của enzym vào lỗ. Nếu phản ứng kháng nguyên - kháng thể dương tính, cơ chất enzym sẽ chuyển từ không màu sang có màu và có thể đo được bằng quang phổ kế. Phản ứng chuyển màu có thể dừng bằng dung dịch NaOH hoặc H2SO4. Enzym có thể là phosphataza kiềm hoặc peroxidaza. Cơ chất enzym có thể là tetramethyl benzidin hoặc axit 5-aminosalicylic đối với enzym peroxidaza. Các chất này đều phải pha mới và pha thêm H2O2 3% trước khi dùng hiển thị phản ứng. Phương pháp ELISA trực tiếp còn có thể thực hiện dưới dạng phản ứng sandwich ("bánh mỳ kẹp thịt"), khi đó lỗ khay được gắn sẵn kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên cần kiểm để tăng hiệu quả gắn kết kháng nguyên với lỗ khay. Đầu tiên cho kháng nguyên tiếp xúc với kháng thể gắn trong lỗ khay khoảng 30 phút rồi rửa các lỗ khay. Tiếp theo sau là phủ lỗ khay bằng conjugat đặc hiệu và các bước rửa và hiển thị như đã mô tả ở trên. Trong lỗ khay cho phản ứng dương tính như vậy có ba lớp, một lớp kháng nguyên giữa hai lớp kháng thể, nên phương pháp được gọi là "bánh mỳ kẹp thịt". Phương pháp ELISA gián tiếp sử dụng conjugat gián tiếp, tức là kháng thể đặc hiệu với gamma-globulin loài cung cấp kháng huyết thanh đặc hiệu (trong phát hiện kháng nguyên) hoặc huyết thanh cần kiểm (trong phát hiện kháng thể) được đánh dấu enzym. Tương tự phương pháp ELISA trực tiếp, trong phương pháp ELISA gián tiếp để phát hiện kháng nguyên ban đầu người ta cố định dịch bệnh phẩm hay kháng nguyên (hấp phụ trong dịch pH cao, thường qua đêm) vào lỗ khay, rửa rồi phủ bổ sung (blocking) bằng dịch protein (không kháng thể, ở nhiệt độ thấp). Sau đó phủ kháng nguyên bằng kháng huyết thanh đặc hiệu mầm bệnh, rửa rồi lại phủ bằng dịch conjugat gián tiếp. Sau khi rửa kỹ, phủ lỗ khay bằng cơ chất enzym thích hợp. Phản ứng màu giúp ta xác định sự hiện diện của kháng nguyên đặc hiệu. Để phát hiện kháng thể bằng phương pháp ELISA gián tiếp, cần cố định kháng nguyên đặc hiệu vào lỗ khay, hấp phụ bổ sung bằng protein không kháng thể, sau khi rửa người ta cho huyết thanh cần kiểm vào cho tiếp xúc với kháng nguyên. Sau bước rửa, cho dịch conjugat gián tiếp, lại rửa kỹ rồi cho cơ chất enzym thích hợp để hiển thị. Phản ứng phát màu của cơ chất giúp ta xác nhận sự hiện diện của kháng thể đặc hiệu trong huyết thanh cần kiểm. 1.6. Phương pháp điện di miễn dịch Đây là phương pháp kiểm tra sự hiện diện kháng thể đặc hiệu virut có bề mặt tích điện âm mạnh và virut tích điện âm mạnh. Nếu cho kháng nguyên và huyết thanh cần kiểm được điện di song song trong một bản keo (gel) agarose hoặc agar thì nếu trong huyết thanh có kháng thể đặc hiệu sẽ xuất hiện vết kết tủa ở dải giữa hai làn điện di. Phương pháp này thường để kiểm tra bệnh cảm nhiễm virut Aleutian ở chồn mink. 2. Chẩn đoán bằng phản ứng quá mẫn muộn Phản ứng quá mẫn muộn để phát hiện miễn dịch tế bào ở trong cơ thể và vận dụng với một số bệnh thú y hình thành miễn dịch tế bào như bệnh lao, bệnh tỵ thư, bệnh Johne (á lao) và bệnh sẩy thai truyền nhiễm. Lấy dịch chiết từ lứa cấy tế bào vi khuẩn nuôi cấy lâu ngày ta được "dị ứng nguyên quá mẫn muộn", với bệnh lao gọi là tubercullin, với bệnh sẩy thai truyền nhiễm là brucellin, với bệnh tỵ thư là mallein và với bệnh Johne là johnin. Ngoài ra phản ứng này còn thực hiện với bệnh sán lá gan, sán nang (Echinococcus), bệnh cảm nhiễm Toxoplasma, bệnh cảm nhiễm nấm Histoplasma và bệnh nấm sợi của da (do Trichophyton),... Các phản ứng này phát hiện cảm nhiễm trong quá khứ nhưng nhiều khi là bệnh đang tiến triển. Tiêm tubercullin vào trong da (nội bì) nếu phản ứng dương tính ta thấy chỗ tiêm viêm tấy đỏ và cứng vào khoảng 72 giờ. Các dị ứng nguyên quá mẫn muộn khác cũng có thể áp dụng và cho kết quả tương tự. Ngoài ra, ở động vật để tiện thực hiện, phản ứng có thể là dưới da (tiêm kháng nguyên vào dưới da), trong mắt (nhỏ kháng nguyên vào niêm mạc mắt). Phản ứng dưới da có thể xác định kết quả nhờ đo độ dày chỗ da bị tiêm trước khi tiêm và sau khi tiêm 1 - 3 ngày và có thể vận dụng với hầu hết tất cả các bệnh nêu trên. Riêng bệnh tỵ thư ở ngựa phản ứng trong mắt khá tiện lợi, buộc ngựa cần kiểm tra vào chỗ tránh gió lùa, nhỏ kháng nguyên vào một mắt để mắt kia làm đối chứng âm. Phản ứng dương tính biểu hiện viêm kết mạc mắt (sau một ngày) kèm theo dòng ghèn trắng đục, nhầy và dính chảy ra từ khóe mắt. IV. Chẩn đoán phân tử thông qua phân tích gen 1. Phương pháp lai phân tử (hybridization) Các phương pháp lai phân tử (hybridization) có nguyên lý chung là nếu ADN hai sợi và ARN hai sợi được biến tính bởi nhiệt hoặc kiềm thì trở thành một sợi. Nếu hỗn hợp axit nucleic một sợi này với axit nucleic một sợi khác thì khi gặp điều kiện nhiệt độ nhất định các đoạn axit nucleic một sợi có trình tự nucleotid tương bổ sẽ kết hợp với nhau nhờ liên kết hydro. Vì hình thành axit nucleic lai tạp (hybrid) nên phương pháp được gọi là hybridization (phương pháp lai, để thuận tiện trong tiếng Việt thường gọi lai phân tử). Với nguyên lý này, nếu có một đoạn ADN hoặc ARN có trình tự nucleotid đặc hiệu virut hoặc vi khuẩn ta có thể đánh dấu bằng (cho kết hợp với) đồng vị phóng xạ, biotin, hoặc digoxygenin rồi kiểm tra xem nó có lai với ADN hoặc ARN (ở trạng thái một sợi) trong bệnh phẩm hay không ta có thể phát hiện được sự hiện diện của mầm bệnh trong bệnh phẩm. ADN hoặc ARN một sợi được đánh dấu gọi là "dò" hay "mẫu dò" (probe). Phương pháp kiểm xuất biotin lợi dụng avidin và phương pháp kiểm xuất digoxygenin lợi dụng kháng thể đánh dấu enzym,... là những phương pháp phi phóng xạ được khai phát đã làm các phương pháp lai phân tử trở nên khả thi trong chẩn đoán. Các phương pháp này so với dùng đồng vị phóng xạ có nhiều lợi điểm như khả năng bảo quản dò được lâu và có thể áp dụng trong các phòng thí nghiệm thông thường, không lo ô nhiễm phóng xạ nên có thể tiếp xúc dễ dàng. Tuy nhiên do có độ nhạy thấp so với phương pháp PCR (sau đây) nên chúng chỉ được sử dụng trong việc đồng định hoặc định typ vi sinh vật đã phân lập thuần khiết. Phương pháp lai phân tử thông thường cần cố định axit nucleic có trong bệnh phẩm lên màng nylon hoặc nitrocelluloza rồi cho phản ứng với dò đặc hiệu. Sau đó rửa bỏ các thành phần (kể cả dò) không gắn kết do không có trình tự tương bổ đặc hiệu với axit nucleic đã cố định và cho hiển thị dò đặc hiệu. Nếu không thấy được dò chứng tỏ không có sự tương đồng trong trình tự nucleotid của dò và của axit nucleic đã cố định. Tùy thuộc vào phương pháp cố định mà ta có những biến thể dưới đây. 1.1. Lai khuẩn lạc (colony hybridization) Phương pháp này dùng để đồng định vi khuẩn mầm bệnh đã phân lập hình thành khuẩn lạc trên môi trường thạch. Đặt màng nylon lên mặt môi trường thạch sẽ làm khuẩn lạc in lên màng, hoặc là lấy cặn vi khuẩn phết lên màng, sau đó bằng phương pháp kiềm làm biến tính axit nucleic rồi cho phản ứng với dò. Do có thể không cần cấy chuyển và bồi dưỡng thuần khiết nên có thể thực thi nhanh việc chẩn đoán. Tuy nhiên, do nhiều thành phần của tế bào nên phản ứng có thể bị trở ngại và làm việc phán định kết quả khó khăn. 1.2. Lai đốm (dot hybridization) Còn gọi là phương pháp thẩm đốm (dot blot), phương pháp này bắt đầu bằng việc chiết xuất axit nucleic từ bệnh phẩm rồi nhỏ giọt (đốm) lên màng và cố định axit nucleic trên đó rồi cho phản ứng với dò. Tuy cần nuôi cấy phân lập lứa cấy thuần vi khuẩn mầm bệnh nhưng là phương pháp nhanh chóng do sử dụng axit nucleic không cần tinh khiết được chiết xuất bằng phương pháp đơn giản. 1.3. Lai Southern (Southern hybridization) Phân tử ADN cần kiểm có thể để nguyên hoặc được cắt bằng enzym hạn chế rồi điện di để phân đoạn trên gel agarose, sau đó chuyển các phân đoạn ADN từ gel sang màng nylon rồi cho phản ứng với dò. Bằng phương pháp này có thể phân tích một cách chi tiết đoạn ADN nào phản ứng với dò nên không chỉ dùng để đồng định mà còn sử dụng để giám biệt typ. Hơn nữa với các loại mầm bệnh có ADN lớn như vi khuẩn, nguyên trùng, ký sinh trùng,... thì sau khi phân cắt bằng enzym hạn chế rồi điện di thì số phân đoạn quá nhiều làm khó phân tích nhưng với phương pháp này có thể phân tích được các mô hình, hay kiểu dạng (pattern), do số phân đoạn phản ứng với dò trở nên hạn chế tức là chỉ những đoạn ADN đặc hiệu được hiển thị vị trí trong làn gel điện di. Sự khác biệt của các kiểu dạng của các đoạn cắt bởi enzym hạn chế phản ứng với dò được gọi là tính đa hình độ dài phân đoạn hạn chế (restriction fragment length polymorphism). 1.4. Lai khay vi thể (microplate hybridization) Chiết xuất axit nucleic từ vi sinh vật mầm bệnh, cho hấp phụ cố định vào đáy lỗ khay vi thể rồi cho phản ứng với dò. Nếu sử dụng phương pháp kháng thể đánh dấu để phát hiện dò thì phương pháp này tương tự phản ứng ELISA, có thể phán định và xử lý kết quả tương tự, đồng thời có thể xử lý chẩn đoán số lượng lớn mẫu bệnh phẩm. Hơn nữa, các axit nucleic từ vi khuẩn mầm bệnh không chỉ có ADN mà còn có ARN thông tin vốn rất nhiều trong tế bào cũng phản ứng với dò nên độ nhạy của phương pháp cao. 2. PCR (Phản ứng chuỗi polymeraza) 2.1. Nguyên lý và ứng dụng PCR Phản ứng chuỗi polymeraza (PCR: polymerase chain reaction) là kỹ thuật dựa trên phản ứng tổng hợp ADN nhờ enzym DNA-polymeraza lặp đi lặp lại mà chỉ một đoạn nhất định của ADN đặc hiệu trong bệnh phẩm được tăng lượng. DNA-polymeraza (DNA-polymerase) là enzym lấy ADN một sợi làm khuôn để tổng hợp sợi ADN tương bổ. Quá trình tổng hợp ADN được thực hiện nối dài một hướng từ đầu 5' đến đầu 3' và tại vị trí xuất phát của quá trình tổng hợp phải có mặt một đoạn ngắn ADN một sợi gọi là mồi (primer) tương bổ với ADN khuôn. Nếu tổng hợp được hai mồi (một cặp) tương bổ với hai vị trí trên hai sợi khác nhau của một ADN hai sợi và hướng của phản ứng từ một mồi ngược với hướng phản ứng từ mồi kia, tức là kẹp một đoạn cần tăng lượng của ADN, thì nếu cho cặp primer với lượng gấp bội vào dịch chứa bệnh phẩm thì phản ứng DNA- polymeraza sẽ thực hiện lặp đi lặp lại nhiều lần. Kết quả là từ vị trí một mồi ADN được kéo dài rồi trong chu kỳ tiếp theo lại làm khuôn cho mồi có chiều ngược lại tổng hợp kéo dài ADN đến quá vị trí của mồi trước. Quá trình tổng hợp lặp đi lặp với một cặp mồi làm cho chỉ đoạn ADN nằm giữa (tức được kẹp giữa) hai mồi được tăng lượng theo cấp số nhân. Nếu số chu kỳ nhiệt là 30 thì đoạn ADN này tăng là 230 (tức khoảng 109) lần. Để thực hiện phản ứng cần có DNA-polymeraza chịu nhiệt và thiết bị luân nhiệt (thermocycler) tự động hóa, và mỗi chu kỳ phản ứng phải qua ba bước 1) biến tính ADN hai sợi thành một sợi bằng nhiệt (94 - 95 °C), 2) nhiệt độ thích hợp để mồi gắn vào trình tự nucleotid đặc hiệu của ADN bệnh phẩm và 3) nhiệt độ thích hợp phản ứng kéo dài chuỗi ADN nhờ DNA-polymeraza. Nhiệt độ chu kỳ 2) và 3) phụ thuộc vào thành phần nucleotid của mồi và khuôn nhưng có thể vận dụng nhiệt độ gắn mồi khoảng 60 °C, nhiệt độ phản ứng kéo dài khoảng 70 °C. Thành phần dịch phản ứng gồm DNA-polymeraza chịu nhiệt (Taq polymerase), hỗn hợp deoxyribonucleotid triphosphat (dNTP, gồm 4 loại dATP, dTTP, dCTP và dGTP), cặp mồi (primer), dung dịch đệm và ADN khuôn (template DNA). Sản phẩm PCR được điện di để xác nhận độ dài đặc hiệu của ADN theo lý luận phải có, thường nhờ điện di song song với ADN dấu phân tử lượng (molecular weight marker DNA). Đôi khi sản phẩm được lai Southern để kiểm tra tính đặc hiệu. Để điện di thường dùng gel agarose 0,8% trong dung dịch đệm acetat-tris, nhuộm ADN bằng ethidium bromid (~50 g/ml) pha vào agarose trước khi đổ bản gel hoặc pha vào dung dịch điện di sau khi điện di. Thời gian gần đây nhờ phát triển kỹ thuật chế primer đánh dấu huỳnh quang chỉ phát quang khi gắn kết vào ADN và thiết bị phân tích huỳnh quang tự động người ta đã phát triển PCR thông thường thành PCR thực thời (real-time PCR) với năng lực chẩn đoán và phân tích định lượng rất tiện lợi. Nhờ PCR có thể tăng lượng bất kỳ ADN nào có trong bệnh phẩm nên ta có thể chẩn đoán thông qua phát hiện sự hiện diện của gen đặc hiệu mầm bệnh mà không cần nuôi cấy phân lập mầm bệnh. Điều này làm cho việc chẩn đoán các mầm bệnh không nuôi cấy được trở nên khả thi. Phương pháp PCR còn được phối hợp với các kỹ thuật sinh học phân tử khác trong nghiên cứu như mô tả dưới đây. 2.2. PCR-RFLP (Phản ứng chuỗi polymeraza - đa dạng độ dài đoạn ngẫu nhiên) PCR-RFLP là phương pháp so sánh các kiểu dạng (hay mô hình: pattern) các phân đoạn của sản phẩm PCR được phân cắt bởi enzym hạn chế được phân tách bằng điện di trong gel. 2.3. RT-PCR (Phản ứng phiên ngược - chuỗi polymeraza) RT-PCR là phương pháp kết hợp phản ứng tổng hợp ADN tương bổ (cDNA) trên khuôn ARN nhờ enzym phiên ngược (RT: reverse transcriptase) hay enzym tổng hợp ADN phụ thuộc ARN (RNA-dependent DNA-polymerase) sau đó ADN được tổng hợp nhờ cặp mồi đặc hiệu trong hàng loạt chu kỳ luân nhiệt tiếp theo. Nhờ phản ứng này genom của các virut ARN trở nên có thể tổng hợp bằng PCR. 2.4. PCR-SSCP (Phản ứng chuỗi polymeraza - đa dạng cấu hình lập thể chuỗi đơn) Nếu một ADN hai sợi được biến tính thành một sợi thì ADN một sợi phụ thuộc vào trình tự nucleotid mà có cấu trúc bậc cao khác nhau và đặc hiệu. Nếu điện di ADN một sợi này trong gel polyacrylamid phi biến tính có gia nhiệt thì các cấu trúc bậc cao khác nhau phản ứng khác nhau, tức cùng độ dài nhưng dịch chuyển trong điện trường với tốc độ khác nhau phụ thuộc vào cấu hình lập thể. Phương pháp này gọi là phân tích đa dạng cấu hình lập thể chuỗi đơn (SSCP: single strand conformation polymorphism). Có thể phân biệt được tối thiểu 1 bazơ khác biệt tồn tại trong các đoạn ADN dài hàng trăm bazơ. Nếu áp dụng kỹ thuật phân tích này để phân tích sự sai khác có thể có trong trình tự nucleotid của các sản phẩm PCR thì phương pháp này được gọi là PCR-SSCP. 2.5. RAPD (ADN sao chép ngẫu nhiên đa hình) ADN đa hình được khuyếch đại ngẫu nhiên (random amplified polymorphic DNA) còn gọi là tổ hợp mơ hồ tính đa hình độ dài khuyếch đại hay ALP-HA (amplified fragment length polymorphism hazy association), PCR được mồi ngẫu nhiên hay AP- PCR (arbitrarily primed PCR) hay lấy vân tay khuyếch đại ADN (DNA amplification fingerprinting),... Đây là phương pháp đồng định mầm bệnh hoặc định typ nhờ sử dụng các cặp mồi có tính đặc hiệu tương đối thấp hoặc mồi chế từ các trình tự lặp trong genom mầm bệnh để thực thi PCR, kết quả là có hàng loạt sản phẩm PCR với độ dài khác nhau được hình thành và nhờ điện di phân tách thành các băng dưới dạng mã vạch tạo ra những mô hình (kiểu dạng) đặc trưng. 3. Điện di axit nucleic Điện di axit nucleic chiết xuất từ mầm bệnh có thể sử dụng trong chẩn đoán. Phương pháp này thường áp dụng sau khi phân lập và đồng định vi sinh vật mầm bệnh và dùng để khu biệt dạng/typ huyết thanh học, và đôi khi trong một dạng huyết thanh học cũng có thể tách biệt tiếp thành những nhóm nhỏ hơn. Với trường hợp virut ARN hai sợi phân đoạn như reovirut và rotavirut có thể phân biệt các virut thuộc các typ huyết thanh học khác nhau nhờ kiểu dạng điện di ARN phân đoạn. Với các virut ADN hai sợi như herpesvirut và adenovirut thì chiết xuất ADN, phân cắt bằng enzym hạn chế rồi điện di để phân biệt typ dựa vào kiểu dạng enzym hạn chế. Với vi khuẩn gây bệnh và plasmid đã được chiết xuất thì điện di, xác định độ lớn và số lượng, phân tích so sánh có thể phân biệt typ huyết thanh học và typ kháng thuốc. Những phân tích này còn có thể dùng để phân tích dịch tễ học xác định mối quan hệ giữa các vụ dịch. V. Phân tích dịch tễ học bệnh truyền nhiễm Khi nhận biết bệnh phát sinh trong tập đoàn động vật, việc truy tìm nguyên nhân phát sinh bệnh đó có ý nghĩa đối với việc khống chế và dự phòng bệnh. Quy trình nghiên cứu thực nghiệm xác định mầm bệnh đã được Koch phát biểu trong "Định đề Koch" gồm bốn điểm phải thỏa mãn. Tuy nhiên, trong thực tế, việc vận dụng định đề Koch không thể thực hiện được với nhiều loại bệnh khác nhau. Khi đó, các phương pháp dịch (tễ) học (epidemiological study) là phương pháp hữu hiệu có thể tuân thủ trong nghiên cứu mầm bệnh. Nghiên cứu dịch học bao gồm nhiều phương pháp và có thể nhóm thành hai nhóm: 1) nghiên cứu dịch tễ học mô tả và 2) nghiên cứu dịch học phân tích. Điều tra bệnh trong tập đoàn gọi là điều tra dịch (tễ) học hay nghiên cứu dịch (tễ) học mô tả. Bên cạnh mô tả hiện tượng bệnh (mô tả ca bệnh, mô tả loạt ca bệnh), nghiên cứu dịch tễ học mô tả còn bao gồm quan sát các điều kiện mà bệnh tật hoặc trở ngại sức khỏe phát sinh. Để biết thực trạng bệnh tật nhất thiết phải biết bệnh phát sinh trong quần thể như thế nào, cho nên khi nắm bắt tình trạng bệnh trong quần thể cần biết những thông tin liên quan đến toàn bộ quần thể. Vì vậy, nghiên cứu mô tả thường theo dõi tỷ lệ mới mắc, tỷ lệ hiện mắc hay lưu hành bệnh so với tổng đàn, tỷ lệ chết, tuổi, giống, loài mắc, mùa vụ, thời gian, không gian mắc của bệnh, tập quán chăn nuôi, tỷ lệ động vật đã được tiêm phòng,... trong các nhóm đàn động vật và giải thích các đặc điểm phát sinh của bệnh trong quần thể động vật. Trên cơ sở những kết quả đó đưa ra giả thuyết về nguyên nhân (mầm bệnh) và những điều kiện phát sinh bệnh. Giả thuyết này sẽ được dùng để làm cơ sở cho nghiên cứu dịch tễ học phân tích. Nghiên cứu phân tích có thể là nghiên cứu hồi cứu (còn gọi là nghiên cứu bệnh chứng - case-control study), trong đó lấy tập đoàn bệnh và tập đoàn chứng không bệnh làm thành hai nhóm đối tượng và truy tìm khả năng tiếp xúc với yếu tố nguy cơ (mầm bệnh theo giả thuyết) như thế nào trong quá khứ. Khi có được một hệ số tương quan thuận cao thì khả năng kết luận đúng về nguyên nhân bệnh là cao. Nghiên cứu phân tích cũng có thể là nghiên cứu theo dõi (còn gọi là nghiên cứu thuần tập - cohort study), trong đó người nghiên cứu ghi nhận hai nhóm động vật (cùng loài) có tiếp xúc và không tiếp xúc với yếu tố nguy cơ (theo giả thuyết) và theo dõi trong thời gian sau đó. Nghiên cứu này thường đòi hỏi theo dõi kéo dài với số lượng động vật lớn để đạt độ tin cậy cao. Mối quan hệ nhân quả có thể là thuyết phục nếu hệ số tương quan thuận cao. Nghiên cứu phân tích cũng còn có thể là nghiên cứu ngang (cross-sectional study) nghiên cứu các cá thể có mặt trong thời gian nghiên cứu và tất cả số liệu được thu thập trong thời gian nghiên cứu nhằm tìm ra mối liên hệ giữa hiện tượng bệnh và yếu tố nguy cơ (mầm bệnh, theo giả thuyết, đối với bệnh truyền nhiễm). Trong nghiên cứu ngang để có số liệu thuyết phục cần có những xét nghiệm có độ nhạy cũng như độ đặc hiệu cao (phân lập và đồng định mầm bệnh, xét nghiệm kháng thể đặc hiệu, xét nghiệm kháng nguyên đặc hiệu, xác nhận ADN hay ARN đặc hiệu,...). Tương tự các nghiên cứu phân tích khác, quan hệ nhân quả là thuyết phục nếu hệ số tương quan thuận cao. Dưới đây trình bày một số phương pháp phân tích số liệu dịch tễ học để xác nhận mối quan hệ nhân quả (bệnh - mầm bệnh) và đánh giá hiệu quả của biện pháp (phòng bệnh bằng một vacxin nào đó,...) ứng dụng trong thực tiễn thú y. Phân tích nghiên cứu bệnh - chứng: Sau khi quan sát mô tả và hình thành một giả thuyết nhân quả giữa bệnh và một yếu tố nguy cơ ta có thể xác nhận quan hệ nhân quả giả thuyết đó. Căn cứ vào giả thuyết nhân quả đó, nghiên cứu bệnh chứng tiến hành phân tích nhằm tìm ra được sự khác biệt giữa nhóm bệnh và nhóm không bệnh trong quan hệ với yếu tố được giả thiết là nguyên nhân (yếu tố mầm bệnh). Phân tích nghiên cứu bệnh - chứng là so sánh tần số cảm nhiễm một yếu tố (được coi là) nguy cơ ở nhóm bệnh và nhóm chứng được lấy ngẫu nhiên để tính toán về mối kết hợp này. Số liệu dịch tễ học được thể hiện ở dưới dạng bảng liên thông, như sau: Bệnh Không bệnh Bộc lộ với yếu tố nguy cơ a b a+b Không bộc lộ c d c+d Cộng a+c b+d a+b+ c+d Trong đó: a là số động vật bị bệnh mà ta hồi cứu thấy có tiếp xúc yếu tố nguy cơ, b là số động vật không bệnh nhưng có tiếp xúc yếu tố nguy cơ, c là số động vật bệnh nhưng không tiếp xúc yếu tố nguy cơ, d là số động vật không bệnh cũng không tiếp xúc yếu tố nguy cơ, a+b là tổng số cảm nhiễm yếu tố nguy cơ, c+d là tổng số không cảm nhiễm yếu tố nguy cơ, a+c là tổng số động vật mắc bệnh, b+d là tổng số động vật không mắc bệnh. Đại lượng nguy cơ tương đối (relative risk) RR=[a/(a+b)]/[c/(c+d)] =a(c+d)/c(a+b) là đại lượng giúp xác định mức độ kết hợp giữa bệnh và bộc lộ với yếu tố nguy cơ. RR>1 nói lên rằng có sự liên quan giữa bệnh và yếu tố nguy cơ, RR=1 cho thấy không có sự liên quan giữa bệnh và cảm nhiễm yếu tố nguy cơ, còn RR<1 nói lên một kết hợp âm. Tương tự, người ta có thể sử dụng đại lượng tỷ suất chênh lệch (odds ratio) OR=ad/bc làm đại lượng kiểm định mức độ kết hợp bệnh với yếu tố nguy cơ. OR >1 nói lên sự kết hợp và giá trị này càng cao thì sự kết hợp càng mạnh. OR=1 cho thấy không có sự liên quan giữa bệnh và cảm nhiễm yếu tố nguy cơ, còn OR<1 nói lên một kết hợp âm. Phân tích nghiên cứu thuần tập có liên quan đến việc tính tỷ lệ mắc bệnh ở các nhóm rồi so sánh tỷ lệ này ở nhóm bộc lộ (cảm nhiễm) với yếu tố nguy cơ (giả thiết) và ở nhóm không bộc lộ. Các số liệu thu thập được trình bày ở bảng sau: Bệnh Không bệnh Bộc lộ với yếu tố nguy cơ a b a+b Không bộc lộ c d c+d Cộng a+c b+d a+b+ c+d Trong đó: a là số động vật có tiếp xúc yếu tố nguy cơ bị phát bệnh, b là số động vật có tiếp xúc yếu tố nguy cơ nhưng không phát bệnh, c là số động vật bệnh nhưng không tiếp xúc yếu tố nguy cơ, d là số động vật không bệnh cũng không tiếp xúc yếu tố nguy cơ, a+b là tổng số cảm nhiễm yếu tố nguy cơ, c+d là tổng số không cảm nhiễm yếu tố nguy cơ, a+c là tổng số động vật mắc bệnh, b+d là tổng số động vật không mắc bệnh. Tương tự như trên, đại lượng nguy cơ tương đối RR=[a/(a+b)]/[c/(c+d)] =a(c+d)/c(a+b) cũng là đại lượng giúp xác định mức độ kết hợp giữa bệnh và bộc lộ với yếu tố nguy cơ. RR>1 nói lên rằng có sự liên quan giữa bệnh và yếu tố nguy cơ, RR=1 cho thấy không có sự liên quan giữa bệnh và cảm nhiễm yếu tố nguy cơ, còn RR<1 nói lên một kết hợp âm. Cũng như vậy, người ta có thể sử dụng đại lượng tỷ suất chệnh lệch (odds ratio) OR=ad/bc làm đại lượng kiểm định mức độ kết hợp bệnh với yếu tố nguy cơ. OR >1 nói lên sự kết hợp và giá trị này càng cao thì sự kết hợp càng mạnh, tức yếu tố nguy cơ (mầm bệnh) giả thuyết là nguyên nhân của bệnh là có xu hướng khẳng định. Đánh giá ảnh hưởng của tiêm vacxin đối với tỷ lệ mắc bệnh: là một trong những bài toán thực tiễn đòi hỏi ngay cả khi vacxin đã được nhà sản xuất thực nghiệm và khuyến cáo sử dụng. Một trong những phương pháp là phân tích tính phụ thuộc giữa tỷ lệ gia súc được tiêm vacxin và tỷ lệ mắc bệnh (sau khi vacxin theo lý luận phải có hiệu lực) hàng năm. Ví dụ dữ liệu thu thập được 10 năm (1990 - 1999) trong bảng sau giúp ta giải quyết vấn đề này. Năm 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 Tỷ lệ tiêm vacxin (%) 55 57 63 64 62 68 71 75 74 77 Tỷ lệ mắc bệnh (%) 1,8 1,7 2,1 1,6 1,2 1,4 0,9 0,8 0,8 0,6 Có một số phương pháp xác định mối phụ thuộc giữa hai dãy số liệu trên. Trong đó, phương pháp xác định hệ số liên quan thứ bậc rrange là phương pháp khá tiện lợi. Hệ số liên quan thứ bậc rrange = 1-{6∑d2/[(n(n-1)(n+1)]} mang giá trị từ -1 đến +1. Giá trị dương chỉ mối tương quan thuận, tức cùng tăng cùng giảm, giá trị âm chỉ mối tương quan nghịch. Giá trị từ 0 đến 0,5 chỉ mối phụ thuộc yếu, từ 0,5 đến 0,8 chỉ mức trung bình, lớn hơn 0,8 đến 1 chỉ mối quan hệ phụ thuộc mạnh. Trước hết cần lập bảng xác định thứ bậc, như sau: Số thứ tự bậc Năm Tỷ lệ tiêm X (%) Tỷ lệ bệnh Y (%) X Y d (=X-Y) d2 1990 55 1,8 10 2 +8 64 91 57 1,7 9 3 +6 36 92 63 2,1 7 1 +6 36 93 64 1,6 6 4 +2 4 94 62 1,2 8 6 +2 4 95 68 1,4 5 5 0 0 96 71 0,9 4 7 -3 9 97 75 0,8 2 8 -6 36 98 74 0,8 3 9 -6 36 99 77 0,6 1 10 -9 81 ∑d2=306 Hệ số liên quan thứ bậc rrange =1-{6×306/(10×9×11)}=1-1,85=-0,85. Điều này nghĩa là tỷ lệ tiêm phòng bằng vacxin và tỷ lệ mắc bệnh có mối tương quan nghịch mạnh. Hay nói cách khác, tiêm vacxin giảm đáng kể tỷ lệ mắc bệnh ở gia súc. Đánh giá so sánh hiệu giá kháng thể các tập đoàn: Phương pháp phân tích này áp dụng khi thử nghiệm hai hay nhiều loại vacxin dự phòng cùng một bệnh. Khi đó số mẫu thu thập được cần phải xét nghiệm bằng cùng một phương pháp thậm chí trong nhiều trường hợp phải được xử lý bằng một lô kháng nguyên đặc hiệu nhất định trong cùng một đợt xét nghiệm để bảo đảm tính so sánh. Nguyên nhân của điều kiện này là do kết quả xét nghiệm xác định hiệu giá kháng thể phụ thuộc vào nồng độ của epitop kháng nguyên tham gia phản ứng. Nồng độ epitop kháng nguyên chuẩn cao làm giảm kết quả hiệu giá vì phản ứng thể hiện rõ khi tỷ số giữa "hóa trị" của kháng nguyên và của kháng thể xung quanh giá trị 1. Từ số liệu hiệu giá kháng thể của hai tập đoàn thu thập được, chỉ số có thể dùng để so sánh là giá trị trung bình nhân hiệu giá (GMT: geometric mean titre). Giá trị trung bình cộng các hiệu giá không thể dùng để đánh giá hiệu quả đáp ứng miễn dịch vì, chẳng hạn, nếu trong một nhóm 10 cá thể được nghiên cứu chỉ có một cá thể có hiệu giá cao (103) còn 9 cá thể khác không có kháng thể, trong khi đó ở nhóm khác cả 10 cá thể đều có hiệu giá kháng thể vừa đủ bảo vệ (102) thì trung bình cộng hiệu giá của hai nhóm là bằng nhau. Mặc dù vậy, nếu công cường độc bằng mầm bệnh tương ứng thì chỉ một cá thể thuộc nhóm thứ nhất được bảo vệ trong khi ở nhóm thứ hai cả 10 cá thể đều miễn dịch. Giá trị trung bình nhân hiệu giá kháng thể được tính theo công thức: GMT= (T1×T2×...×Tn)1/n. Trên thực tế để tiện phân tích và tránh cho vế phải bằng không (0) người ta vận dụng lôgarit hóa cả hai vế. Khi đó, logGMT=(logT1+logT2+...logTn)/n; trong đó T1, T2,... và Tn là các hiệu giá riêng rẽ. Chú ý khi đọc kết quả phản ứng cần gán cho các mẫu âm tính hoàn toàn (với huyết thanh nguyên, không pha) giá trị logT=-1, còn mẫu huyết thanh cho kết quả dương tính chỉ khi không pha loãng có giá trị logT=0 (tức a0=1). Bằng phép đối lôgarit xác định được giá trị GMT. Chú ý rằng trong các thí nghiệm dạng này cần phải thực hiện xét nghiệm với mẫu huyết thanh không pha loãng để tránh sai số do bỏ mất các giá trị logT=-1. Tuy nhiên, giá trị này có thể bỏ qua khi nghiên cứu tập đoàn lớn vẫn bảo đảm ý nghĩa so sánh.