Chế tạo, nghiên cứu tính chất quang của hạt nano Ormosil chứa tâm màu có các nhóm chức năng và ứng dụng đánh dấu sinh học

Phạm Minh Tân và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 96(08): 59 - 67 59 CHẾ TẠO, NGHIÊN CỨU TÍNH CHẤT QUANG CỦA HẠT NANO ORMOSIL CHỨA TÂM MÀU CÓ CÁC NHÓM CHỨC NĂNG VÀ ỨNG DỤNG ĐÁNH DẤU SINH HỌC Phạm Minh Tân1,3*, Trần Thu Trang1,3, Trần Thanh Thủy2, Nghiêm Thị Hà Liên1, Vũ Thị Thùy Dương1, Tống Kim Thuần2, Trần Hồng Nhung1 1Viện Vật lý - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam 2Viện Công nghệ Sinh học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam 3Trường Đại học Khoa học - ĐH Thái Nguyên TÓM TẮT Các hạt nano ormosil được tổng hợp bằng phương pháp Stöber từ precursor Methyltriethoxysilane CH3Si(OC2H5)3 (MTEOS). Hạt nano ormosil pha tâm mầu Rhodamine B (RB) dạng cầu, phân tán trong nước, kích thước vài chục nano mét, có các nhóm chức năng như -NH2, -SH, -OH trên bề mặt. Hạt được bọc bằng bovine serum albumin (BSA). Các hạt nano huỳnh quang được gắn kết với các kháng thể đặc hiệu vi khuẩn Escherichia coli O157:H7. Vi khuẩn E.Coli O157:H7 được đánh dấu huỳnh quang bằng hạt nano ormosil thông qua tương tác và nhận biết đặc hiệu kháng nguyên - kháng thể. Các kết quả nghiên cứu cho thấy khả năng ứng dụng của các hạt nano huỳnh quang trong các phân tích sinh học. Từ khóa: dye-doped silica-based nanoparticles, biofunctionalisation, cell detection MỞ ĐẦU* Hạt nano silica là các hạt SiO2 kích thước nano có thể chứa được một số lượng lớn tâm màu hữu cơ trong một hạt silica đơn. Do đó hạt nano silica chứa tâm màu có độ chói và độ khuếch đại tín hiệu cao gấp nhiều lần so với phân tử màu đơn lẻ. Vì vậy lựa chọn hạt nano silica ứng dụng trong phân tích sinh học có thể cải thiện đáng kể độ nhạy phân tích. Trong các loại hạt nano silica chứa tâm màu hữu cơ thì hạt với nền ormosil (organically modifified silica) đang được hướng tới ứng dụng trong truyền tải gen và thuốc cùng nhiều ứng dụng quang tử quan trọng khác. Hạt nano silica/ormosil có nhiều ưu điểm trong các ứng dụng sinh học vì chúng có thể chứa cả tâm màu và thuốc kỵ nước hoặc tan trong nước. Bằng cách thay đổi các loại thuốc, hạt nano silica/ormosil có thể điều trị các bệnh khác nhau. Bằng cách thay đổi loại tâm màu, các hạt nano silica/ormosil có thể có hiệu suất lượng tử cao và dải phát quang rộng lấp đầy vùng khả kiến và hồng ngoại [5]. Hơn nữa, do bị * Email: phamtantn@gmail.com cầm giữ trong nền silica, các tâm màu được bảo vệ khỏi các ảnh hưởng của môi trường cũng như tác động trực tiếp của ánh sáng nên sự phân hủy quang cũng được giảm thiểu. Các tâm màu được bảo vệ bởi nền silica nên cường độ huỳnh quang có thể được điều khiển bởi số lượng tâm màu trong một hạt và được giới hạn chỉ bởi sự dập tắt huỳnh quang do nồng độ [6]. Để sử dụng trong các ứng dụng y sinh, hạt nano silica/ormosil phải có khả năng gắn kết với phân tử sinh học đích. Mặt khác, để gắn kết hạt nano silica/ormosil có bản chất vô cơ với phân tử sinh học có bản chất hữu cơ thì cần phải thay đổi hóa học bề mặt hạt. Đồng thời, hạt nano silica/ormosil phải được bảo vệ khỏi sự tấn công của môi trường sinh học có các pH khác nhau. Mặt khác, để có thể sử dụng trong các mục đích dẫn thuốc điều trị hay các ứng dụng in-vivo hạt nano silica/ormosil phải tương thích với cơ thể sống. Vì vậy, việc biến đổi tương thích sinh học là khâu mấu chốt trong nghiên cứu ứng dụng vật liệu này trong y – sinh. Đây là vấn đề đang được các nhà vật liệu học trong và ngoài nước quan tâm. Phạm Minh Tân và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 96(08): 59 - 67 60 Báo cáo này trình bày các kết quả nghiên cứu chế tạo hạt nano ormosil pha tâm màu Rhodamine B (RB) dạng cầu, phân tán trong nước, kích thước vài chục nano mét, có các nhóm chức năng như -NH2, -SH, -OH trên bề mặt. Các dung dịch hạt silica/ormosil được chế tạo thường có tính axit yếu, với pH khoảng 5 – 6, do đó dung dịch này thường bị vẩn đục trong các môi trường có tính bazơ hoặc trung tính do các hạt silica/ormosil bị kết đám. Vấn đề đặt ra là phải làm sao để các hạt này có thể sử dụng được trong các môi trường có pH khác nhau. Phương án bọc BSA được lựa chọn do tiếp thu các kết quả bọc hạt nano vàng của nhóm nghiên cứu [9]. Các hạt nano sau khi chế tạo được gắn kết với kháng thể để nhận biết vi khuẩn E.Coli O157:H7. THỰC NGHIỆM Hóa chất Methyltrimethoxysilane (MTEOS), Aminopropyltriethoxysilane (APTEOS), 3- trimethoxysilyl- 1 propanthiol (TMPT), dimethylsulfoxide (DMSO), Butanone-2 được mua từ Merck. Chất màu Rhodamine B (RB) được mua từ Exciton Co. Chất hoạt động bề mặt Aerosol-OT (AOT) (96%) của Fluka, Bovine serum albumin (BSA) của Biochem và túi rửa bán thẩm thấu của Sigma-Aldrich. Chế tạo hạt nano ORMOSIL chứa tâm màu RB Chế tạo hạt nano ORMOSIL chứa tâm màu RB được thực hiện theo phương pháp Stöber, trình bày trên sơ đồ hình 1. Đầu tiên, hỗn hợp chất hoạt động bề mặt AOT và butanone-2 được pha với nhau theo một tỉ lệ: 0,15 g AOT : 250 µl butanone-2, sau đó được rung siêu âm cho tới khi dung dịch trong suốt. Sau đó lấy 990 µl dung dịch hoạt động bề mặt này cộng với 300 µl MTEOS precursor, khuấy từ cho dung dịch đồng nhất. Tiếp theo 10 ml nước cất hai lần được thêm vào và khuấy từ 1h. Sau đó 75 µl chất màu RB trong DMSO được cho thêm vào và khuấy từ 10 phút. Đối với các mẫu đối chứng, 75 µl dung dịch DMSO không có chất màu được thêm vào dung dịch. Sau đó cho xúc tác APTEOS để chế tạo hạt có nhóm chức amin (-NH2) hoặc NH4OH để chế tạo hạt có nhóm chức hydroxyl (-OH). Hệ dung dịch này được khuấy từ liên tục trong 20h ở nhiệt độ phòng. Cho thêm precursor TMPT vào dung dịch có xúc tác NH4OH tiếp tục khuấy từ 10h nữa để chế tạo hạt có nhóm chức thiol (-SH). Cuối cùng, dung dịch thu được được đưa vào túi bán thẩm thấu 10000MWCO và được rửa nhiều lần bằng nước cất hai lần ( 8 - 9 lần), mỗi lần 8h dưới tác động của máy khuấy từ để loại những chất còn thừa trong các phản ứng và loại toàn bộ hoạt động bề mặt AOT và Butanone-2. Bọc hạt nano ORMOSIL bằng bovine serum albumin (BSA) Một lượng BSA được cho vào trong dung dịch đệm MES (axit 2-(N-morpholino) etansulfonic, pH = 5,5, khuấy từ 30 phút. BSA pha trong MES được đưa vào dung dịch nano ORMOSIL sau khi đã chế tạo xong. Hỗn hợp nano ORMOSIL - BSA trong MES được khuấy từ khoảng 30 phút ở 40C cho tới khi dung dịch trở nên trong suốt. Sau đó để ổn định trong tủ lạnh 1-2 ngày. BSA được hấp phụ trực tiếp lên bề mặt hạt nano ORMOSIL. Để khảo sát lượng BSA bọc đủ lên hạt nano ORMOSIL chứa tâm màu RB, các mẫu được bọc BSA với lượng thay đổi từ 0 đến 1,5 mg với bước là 0,1 mg. Mẫu sau khi chế tạo được chia làm 2 đưa vào trong môi trường nước pH = 6 và PBS 4.5X pH = 7,4 (là hỗn hợp dung dịch gồm NaCl (0.15 M)87.0g; KH2PO4 2.0g; Na2HPO4 29.0g; NaN3 2.0g pha trong 4.5 lít nước cất). Sau 24h các mẫu được đo phổ hấp thụ và huỳnh quang. Khảo sát các hạt nano ORMOSIL chứa tâm màu Kích thước và hình dạng của hạt nano ORMOSIL được khảo sát bằng kính hiển vi điện tử quét SEM (Hitachi-S480) và kính hiển vi điện tử truyền qua TEM (JEL 1011). Cấu trúc hóa học của hạt nano được xác định qua phân tích phổ hấp thụ hồng ngoại (Impact 410 Nicolet FTIR). Tính chất quang của hạt nano được khảo sát thông qua việc phân tích phổ hấp thụ (JASCO-V570-UV-VIS-NIR) và phổ huỳnh quang (Cary Eclipse, Varian). Phạm Minh Tân và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 96(08): 59 - 67 61 Hình 1. Sơ đồ chế tạo hạt nano ORMOSIL chứa tâm màu RB. Đánh dấu vi khuẩn Kháng thể thương phẩm đơn dòng E.coli O157:H7 kháng kháng nguyên thân O mua của hãng Abcam (dòng tế bào D3C6), kí hiệu ab 75244 nhận từ thỏ với trọng lượng phân tử 170.000 Dalton, pha loãng bằng dịch PBS 0,1 M, pH=7,3, tới nồng độ ngưng kết tế bào trên phiến kính là 11,8 ng/ml. Phương pháp tạo phức hợp hạt nano ormosil phát quang và kháng thể đặc hiệu E. coli O167:H7: lấy 80 µl kháng thể đặc hiệu nồng độ 11,8 mg/ml cho vào ống Eppendof, bổ sung 5 µl hạt nano ORMOSIL nồng độ 4,77 mg/ml và 1200 µl EDAC 4 mM pha trong đệm MES pH 5.5, vortex đều. Hỗn hợp dịch được ủ lắc ngang liên tục ở 300C trong 3 giờ. Sau đó ly tâm ở 35.000-40.000 vòng/phút trong 60 phút ở 40C để loại bỏ hạt nano ORMOSIL và kháng thể thừa. Rửa 2 lần với dịch PBS pH 7,4. Cặn thu được phân tán vào 1000 µl PBS và bảo quản ở 40C. Gắn kết đặc hiệu vi khuẩn E. coli O157:H7 bằng phức hệ kháng thể - hạt nano ormosil: Vi khuẩn E. coli O157:H7 do Viện Đại học mở cung cấp, được nuôi cấy lắc trong môi trường MPA dịch thể ở 370C. Dịch nuôi cấy vi khuẩn được pha loãng trong đệm PBS tới nồng độ 104CFU/ml. Lấy 500µl phức hợp hạt nano ORMOSIL-kháng thể cho vào ống eppendof, bổ sung 25µl dịch huyền phù vi khuẩn có mật độ 104CFU/ml. Ủ hỗn hợp ở nhiệt độ 300C trên máy lắc ngang. Sau 5, 10, 15, 20, 25, 30 phút, ly tâm 10.000 vòng/phút loại bỏ dịch nổi chứa phức hợp không gắn kết với vi khuẩn đích. Rửa cặn chứa vi khuẩn đã gắn kết với phức hợp bằng PBS, pH 7,4 từ 2- 3 lần, sau đó cặn được phân tán vào 1,5ml PBS. Mẫu được khảo sát bằng kính hiển vi huỳnh quang Nikon Ti-E Eclipse C1 Plus, kính hiển vi điện tử truyền qua (JEL 1011) và phổ kế huỳnh quang (Cary Eclipse, Varian). KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Các hạt nano silica/ormosil có các nhóm chức –NH2, -OH, -SH, được chế tạo theo điều kiện đã nêu trên được bảo quản trong bóng tối và nhiệt độ 40C. Tất cả các hạt nano silica/ormosil đã chế tạo đều được nghiên cứu về hình thái, kích thước, cấu trúc hóa học và tính chất quang Hình dạng, kích thước và cấu trúc hóa học của các hạt nano ORMOSIL Hình 2 trình bày ảnh TEM và SEM của các hạt cho thấy cả 3 loại hạt với các nhóm chức - NH2, -OH, -SH đều có dạng cầu, đơn phân tán, kích thước khá đồng đều, hạt SiO2-NH2 (hình 2a) kích thước khoảng 70nm đến 80nm, hạt SiO2-OH và SiO2-SH kích thước khoảng 100 đến 110nm (hình 2 b) và c). NH4OH APTEOS H2O Dye/DMSO TMPM AOT, Butanone-2, MTEOS OH OH H HO OH SH SH HS HS SH NH2 OH H2N HO NH2 Phạm Minh Tân và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 96(08): 59 - 67 62 a) b) c) Hình 2. a) Ảnh TEM của hạt nano SiO2-NH2 b) Ảnh SEM của hạt nano SiO2-OH c) Ảnh TEM của hạt nano SiO2-SH Cấu trúc hóa học của các hạt nano ORMOSIL Cấu trúc hóa học của hạt nano silica/ormosil có nhóm chức NH2 được xác định bằng phân tích phổ tán xạ micro Raman và phổ hấp thụ hồng ngoại a) 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 -0.01 0.00 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07 0.08 O-Si-O 6SBA60 C=O Si-CH3 OH -C3H6-NH2 Si-CH3 Si-O-CH3 Si-CH3 C − ên g ® é (® vt y) Sè sãng (cm -1 ) OH b) Hình 3. Phổ tán xạ micro Raman (hình a) và phổ hấp thụ hồng ngoại (hình b) của hạt nano SiO2-NH2 Phổ tán xạ micro Raman của hạt nano SiO2- NH2 ngoài hai nhóm vạch đặc trưng cho dao động của liên kết Si-O ở 480 cm-1 và Si-CH3 ở 2921 cm-1 còn có nhóm vạch 883 cm-1 đặc trưng cho dao động của nhóm amine NH2 ở 906 cm-1 (hình 3a). Phổ hấp thụ hồng ngoại của hạt nano ORMOSIL có các vạch đặc trưng cho các dao động của liên kết Si-O (545, 1030, 1126 cm-1), Si-CH3 (780, 1277, 2882, 2930, 2960 cm-1) và -OH (857, 900, 3424 cm-1), ngoài ra phổ còn có nhóm vạch nằm trong dải từ 1467-1634 cm-1 ứng với dao động của nhóm -C3H6-NH2. Điều này chứng tỏ lớp SiO2-C3H6NH2 đã được hình thành trên hạt. Tương tự như trên, phổ hấp thụ hồng ngoại của hạt SiO2-SH (hình 4) có vạch tại 2886 cm-1 đặc trưng cho liên kết –SH, vạch tại 2930 cm-1 đặc trưng cho liên kết –CH2, chứng tỏ sự có mặt của lớp SiO2-SH. Tính chất quang của các hạt nano ormosil chứa tâm màu RB Hình 5 biểu diễn phổ hấp thụ chuẩn hóa của các hạt silica/ormosil chứa tâm màu RB có các nhóm chức khác nhau, từ hình phổ cho thấy phổ hấp thụ của các hạt nano silica/ormosil có các nhóm chức khác nhau có dạng giống với phổ hấp thụ của RB tự do trong nước, với sự dịch đỉnh nhẹ so với đỉnh RB trong nước. 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 0 2000 4000 6000 8000 Si-CH3 -NH2 Si-O-Si C − ên g ® é (® vt y) Sè sãng (cm -1 ) Phạm Minh Tân và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 96(08): 59 - 67 63 5 0 0 1 0 0 0 1 5 0 0 2 0 0 0 2 5 0 0 3 0 0 0 3 5 0 0 4 0 0 0 0 . 0 0 0 . 0 3 0 . 0 6 0 . 0 9 0 . 1 2 C − ên g ® é h Êp t h ô ( ® vt y) S è s ã n g ( c m - 1 ) S - H C H 2 S i - C H 3 S i - O Hình 4. Phổ hấp thụ hồng ngoại của hạt nano SiO2-SH Phổ huỳnh quang của các hạt nano silica/ormosil có các nhóm chức khác nhau cũng có sự dịch đỉnh khác nhau tương tự như phổ hấp thụ: hạt có nhóm -OH và -SH đỉnh hấp thụ và huỳnh quang dịch về phía sóng dài hơn so với hạt có nhóm -NH2. Có thể giải thích sự dịch đỉnh phổ do nguyên nhân: tương tác giữa tâm màu với nền có các nhóm chức khác nhau. Các nhóm chức hữu cơ không tham gia quá trình thủy phân và ngưng tụ sẽ nằm trong các lỗ xốp của lớp SiO2 phía ngoài hạt và lỗ xốp trên bề mặt hạt. Các tâm màu cũng phân tán trong lỗ xốp [10]. Tương tác giữa tâm màu với các nhóm chức khác nhau là khác nhau dẫn tới sự dịch đỉnh khác nhau so với đỉnh của RB tự do trong nước. Phổ hấp thụ của hạt có nhóm -NH2 có nền rất cao, chứng tỏ chất lượng nền SiO2 chưa tốt, nền không trong suốt. 450 500 550 600 650 700 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 Rb/H 2 O SiO 2 -SH SiO 2 -OH SiO 2 -NH 2 § é h Êp t h ô c h u Èn h ãa B−íc sãng (nm) Hình 5. Phổ hấp thụ chuẩn hóa của hạt nano silica/ormosil có các nhóm chức khác nhau Để xác định các đặc trưng của phổ huỳnh quang, chúng tôi tiến hành đo phổ huỳnh quang của các mẫu hạt nano silica/ormosil ở cùng ở một độ hấp thụ, các kết quả cho thấy cường độ huỳnh quang của các hạt nano silica/ormosil có nhóm chức khác nhau là khác nhau. Cường độ huỳnh quang tăng dần từ 122 đến 466 (đvty) ứng với lần lượt các mẫu SiO2-SH, SiO2-OH và SiO2-NH2 (hình 6). Sự khác nhau về cường độ huỳnh quang có thể giải thích do ảnh hưởng của kích thước hạt và chất lượng nền. Kích thước của hạt SiO2-SH và SiO2-OH là 100 - 110 nm lớn, do đó số lượng cũng như nồng độ tâm màu trong một hạt là rất lớn (khoảng 6900 phân tử RB trong một hạt). Mặt khác, nền của hai loại hạt này trong suốt, chứng tỏ kích thước lỗ xốp nhỏ, vì vậy nồng độ tâm màu trong các lỗ xốp là rất lớn, dẫn đến sự dập tắt huỳnh quang do nồng độ. Với hạt SiO2-NH2 kích thước 70-80 nm nồng độ tâm màu khoảng 3900 phân tử RB trong một hạt, chất lượng nền đục chứng tỏ kích thước lỗ xốp lớn, do đó nồng độ tâm màu trong các lỗ xốp nhỏ hơn nên hiệu ứng dập tắt huỳnh quang cũng giảm đi [10]. Bọc hạt nano ORMOSIL bằng protein BSA Các hạt nano silica/ormosil chứa tâm màu RB sau khi bọc BSA (SiO2@BSA) phân tán trong môi trường MES pH= 5,5 được khảo sát hình dạng, kích thước trên kính hiển vi điện tử quét (SEM). Kết quả được trình bày trên hình 7b) cho thấy các hạt nano phân tán tốt hơn so với mẫu hạt tương ứng khi chưa được bọc BSA (hình 7b)). Phạm Minh Tân và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 96(08): 59 - 67 64 540 560 580 600 620 640 660 680 700 0 100 200 300 400 500 C − ên g ® é h u ún h q u an g (®v ty ) B−íc sãng (nm) SiO 2 -NH 2 SiO 2 -OH SiO 2 -SH 540 560 580 600 620 640 660 680 700 0.0 0.5 1.0 SiO 2 -N H 2 SiO 2 -OH SiO 2 -SH B−íc sãng (nm ) C− ên g ® é ch u Èn h ãa Hình 6. a) Phổ huỳnh quang của hạt nano silica/ormosil có các nhóm chức khác nhau b) Phổ huỳnh quang chuẩn hóa của hạt nano silica/ormosil có các nhóm chức khác nhau a) b) 500 550 600 650 700 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 § é h Êp t h ô c h u Èn h ãa B−íc sãng (nm) BSA 1.0 BSA 1.2 BSA 1.3 BSA 1.4 BSA 1.5 BSA 0 BSA 1.1 c) 450 500 550 600 650 700 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 § é h Êp t h ô c h u Èn h ãa B−íc sãng (nm) BSA1 BSA1.3 BSA1.4 BSA0 BSA1.1 BSA1..2 BSA1.5 d) Hình 7. a) và b) Ảnh SEM của hạt nano silica/ormosil trước và sau khi bọc BSA; phổ hấp thụ của hạt nano silica/ormosil trước và sau khi bọc BSA với lượng khác nhau trong nước c) và trong PBS d). Phổ hấp thụ chuẩn hóa của các mẫu SiO2-OH được bọc BSA trong môi trường nước (hình 7c)) và PBS (hình 7d)) cho thấy không có sự biến đổi dạng phổ so với mẫu SiO2-OH ngoài sự dịch đỉnh nhẹ (∼ 2nm) biểu thị sự có mặt của BSA làm môi trường lân cận hạt khác đi. Các hạt nano silica/ormosil được bọc với các lượng BSA khác nhau (được gọi là SiO2-OH@BSA). Các dung dịch hạt ormosil trong môi trường nước và PBS cho thấy: khi không có BSA, dung dịch bị vẩn đục do hiện tượng kết đám làm giảm cường độ huỳnh quang so với cường độ huỳnh quang trong môi trường MES (dữ liệu không đưa ra ở đây). Lượng Phạm Minh Tân và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 96(08): 59 - 67 65 BSA càng tăng thì hiện tượng kết đám càng giảm, dung dịch trở nên trong hơn. Đồ thị cường độ huỳnh quang phụ thuộc vào lượng BSA của dung dịch hạt SiO2@BSA trong nước (hình 8a) cho thấy cường độ huỳnh quang tăng tỉ lệ thuận với lượng BSA tăng từ 0-1.2 mg/ml. Sau đó cường độ huỳnh quang trở nên ổn định khi lượng BSA ≥ 1.2 mg/ml. Tương tự, cường độ huỳnh quang của dung dịch SiO2@BSA trong PBS (hình 7b) tỉ lệ thuận với lượng PBS trong khoảng 0.1-0.3 mg/ml, sau đó cường độ huỳnh quang trở nên ổn định không đổi với lượng BSA trong khoảng 0.3 < BSA < 1.2 mg/ml, rồi giảm nhẹ khi BSA > 1.2 mg/ml. Sự phụ thuộc cường độ huỳnh quang của các hạt SiO2@BSA vào lượng BSA được giải thích như sau: như đã trình bày trong phần mở đầu, các dung dịch hạt silica/ormosil được chế tạo thường hơi có tính axit với pH khoảng 5 - 6, do đó dung dịch này thường bị vẩn đục trong các môi trường có tính bazơ hoặc trung tính do các hạt silica/ormosil bị kết đám. Lớp BSA bao bọc hạt làm cho hạt chịu được các môi trường có pH khác nhau và ngăn không cho các hạt kết tụ tạo đám. Khi lượng BSA chưa đủ để bọc kín các hạt ormosil thì các hạt vẫn bị tụ đám làm giảm cường độ huỳnh quang của dung dịch (so với cường độ huỳnh quang của dung dịch các hạt ormosil được chế tạo). Lượng BSA càng tăng thì diện tích bề mặt hạt được bọc càng nhiều làm giảm khả năng kết tụ dẫn tới cường độ huỳnh quang tăng. Khi lượng BSA đủ để bọc kín bề mặt hạt thì không còn sự kết tụ, các hạt được đơn phân tán, do đó cường độ huỳnh quang trở nên ổn định, không biến đổi khi lượng BSA thay đổi. Kết hợp cả hai đồ thị có thể rút ra kết luận về lượng BSA cần bọc đủ cho hạt nano silica/ormosil kích thước 100-110 nm, nồng độ 7.1012 hạt/ml là 1,2-1,3 mg/ml. Lượng BSA > 1,3 mg/ml sẽ gây ra sự dư thừa BSA ảnh hưởng tới độ đồng nhất quang học của dung dịch. Số liệu BSA này chỉ đúng với một loại hạt với nhóm chức năng, kích thước và nồng độ cụ thể. Ứng dụng hạt nano silica/ormosil chứa RB trong đánh dấu sinh học Mẫu gắn kết E.coli O157:H7 với phức hợp kháng thể - hạt nano ORMOSIL chứa RB cũng được chụp ảnh trên kính hiển vi điện tử truyền qua (hình 9). Hình 9.a là ảnh vi khuẩn E. coli O157:H7 gắn kết đặc hiệu với hạt nano ormosil, do hạt nano bám xung quanh vi khuẩn E. coli O157:H7 nên ảnh có mầu tối; hình 9.b là ảnh vi khuẩn E. coli O157:H7 đối chứng không có kháng thể đặc hiệu nên không có hạt nano ORMOSIL xung quanh nên ảnh có mầu sáng. 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 80 90 100 110 120 130 140 150 160 C − ên g ® é h u ún h q u an g (® vt y) L−îng BSA (mg/ml) SiO2@BSA-H20 a) 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 100 110 120 130 140 150 160 C − ên g ® é h u ún h q u an g (® vt y) L−îng BSA (mg/ml) SiO2@BSA-PBS b) Hình 8. a) Đồ thị cường độ huỳnh quang của SiO2@BSA với lượng BSA khác nhau trong nước b) Đồ thị cường độ huỳnh quang của SiO2@BSA với lượng BSA khác nhau trong PBS Phạm Minh Tân và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 96(08): 59 - 67 66 a) b) Hình 9. Ảnh TEM: a) E. coli O157:H7 + hạt nano ormosil; b) E. coli đối chứng. 550 600 650 700 750 800 850 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 Cu o n g do (dv ty ) Buoc song (nm) Nuoc Hat nano ormosil chua RB trong nuoc PBS PBS-Ecoli Phuc he vi khuan E.Coli O157:H7- hat nano ormosil trong PBS c) Hình 10. Trái: a) Ảnh huỳnh quang của vi khuẩn E.Coli 0157:H7 được đánh dấu bằng hạt nano ormosil chứa tâm mầu RB chụp trên kính hiển hi huỳnh quang Ti-E Eclipse, kính vật 60x NA 1,4, kích thích bằng vạch 480 của đèn thủy ngân; b) Ảnh huỳnh quang của 1 vi khuẩn E.Coli chụp bằng mô đun đồng tiêu C1 Plus, kích thích bằng vạch 543 nm của laser He-Ne, kính vật 60x NA 1,4. Phải: c) Phổ huỳnh quang của hạt nano ormosil chứa RB trong nước và của vi khuẩn E.Coli 0157:H7 nhận biết bằng phức hệ kháng thể đặc hiệu vi khuẩn E.Coli 0157:H7 – hạt nano ormosil chứa RB và vi khuẩn E.Coli trong PBS. Hình 10 biểu diễn ảnh huỳnh quang của các vi khuẩn E.coli O157:H7 được đánh dấu bằng hạt nano ormosil chứa tâm mầu RB chụp trên kính hiển vi huỳnh quang Ti-E Eclipse, kính vật 60x NA 1,4, kích thích bằng vạch 480 của đèn thủy ngân (hình 10b)). Các điểm sáng mầu vàng - đỏ là các vi khuẩn được đánh dấu. Hình 10 a) là ảnh huỳnh quang của 1 vi khuẩn E.Coli chụp bằng mô đun đồng tiêu C1 Plus, kích thích bằng vạch 543 nm của laser He- Ne, kính vật 60x NA 1,4. Ảnh cắt lớp vi khuẩn cho thấy hạt nano ormosil chỉ bám trên bề mặt vi khuẩn đích mà không ở trong vi khuẩn. Như vậy phức hợp kháng thể - hạt nano chỉ gắn trên bề mặt thành tế bào theo nguyên lý miễn dịch (kháng nguyên - kháng thể). Hình 10 c) cho thấy các hạt nano ormosil chứa RB trong nước có đỉnh huỳnh quang ở 578 nm (đường xanh), các hạt nano ormosil chứa RB gắn kết với vi khuẩn E. coli O157:H7 trong đệm PBS (đường đỏ) có đỉnh ở 583 nm và dạng phổ là mở rộng hơn. Việc quan sát được phổ huỳnh quang của vi khuẩn E. coli nhận biết bằng phức hệ kháng thể đặc hiệu vi khuẩn E. coli O157:H7 - hạt nano ormosil cho ta cơ sở để xây dựng đường chuẩn: cường độ phổ - số lượng vi khuẩn đích. KẾT LUẬN Đã chế tạo được các hạt nano ormosil pha tâm mầu Rhodamine B (RB) dạng cầu, phân tán trong nước, kích thước vài chục nano mét, có các nhóm chức năng như -NH2, -SH, -OH trên bề mặt hạt. Nghiên cứu phương pháp bọc a) b) Phạm Minh Tân và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 96(08): 59 - 67 67 các hạt ormosil bằng protein BSA đã đưa ra được cách xác định lượng BSA đủ để bọc hạt với nhóm chức năng, kích thước và nồng độ cụ thể. Các vi khuẩn E. coli O157:H7 đã được nhận biết đặc hiệu theo phương pháp miễn dịch huỳnh quang bằng phức hệ hạt nano - kháng thể. Các kết quả nghiên cứu cho thấy tiềm năng ứng dụng của hạt nano ORMOSIL chứa tâm màu hữu cơ trong các phân tích sinh học. TÀI LIỆU THAM KHẢO [1]. M. -Carmen Estévez, Meghan B. O’Donoghue, Xiaolan Chen, and Weihong Tan, Nano Res (2009) 2: 448 461 [2]. Anna Arkhireeva and John N. Hay, J. Mater. Chem., 2003, 13, 3122–3127 [3]. Jun Qian, Xin Li, Ming Wei, Xiangwei Gao, Zhengping Xu, and Sailing He, OPTICS EXPRESS, Vol. 16, No. 24, (C) 2008 OSA, published 12 Nov 2008, 19568-19578 [4]. Sehoon Kim, Tymish Y. Ohulchanskyy, Haridas E. Pudavar, Ravindra K. Pandey, and Paras N. Prasad, J Am Chem Soc. 2007 March 7; 129(9): 2669–2675. [5]. A. Burns, H. Ow, and U. Wiesner, Chem. Soc. Rev. 35, 1028–1042 (2006). [6]. Indrajit Roy, Tymish Y. Ohulchanskyy, Dhruba J. Bharali, Haridas E. Pudavar, Ruth A. Mistretta, Navjot Kaur, and Paras N. Prasad, PNAS, January 11, 2005, Vol. 102, No. 2, 279–284 [7]. Biofunctionalization of Nanomaterials, Nanotechnologies for the Life Sciences Vol. 1, Copyright © 2005 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim, ISBN: 3-527-31381-8 [8]. A. van Blaaderen and A. Vrij, J. Colloid Interface Sci., 1993, 156, 1. [9]. Nguyễn Thị Tuyến, “ Nghiên cứu chế tạo và chức năng hóa hạt nano vàng định hướng ứng dụng trong sinh học”, Luận văn thạc sỹ Vật lý, Hà Nội, 2010. [10]. Nguyễn Thị Vân, “ Chế tạo và nghiên cứu tính chất quang của hạt nano ormosil pha tâm màu hữu cơ dung trong đánh dấu sinh học”, Luận văn thạc sỹ Vật lý, Hà Nội, 2009. SUMMARY SYNTHESIS, OPTICAL PROPERTIES OF DYE DOPED ORMOSIL NANOPARTICLES FOR BIOLABELING APPLICATION Pham Minh Tan1,3*, Tran Thu Trang1,3, Tran Thanh Thuy2, Nghiem Thi Ha Lien1, Vu Thi Thuy Duong1, Tong Kim Thuan2, Tran Hong Nhung1 1Institute of Physics, Vietnamese Academy of Science and Technology 2Institute of Biotechnology, Vietnamese Academy of Science and Technology 3College of Sciences, Thainguyen University Dye-doped water soluble organically modified silica (ORMOSIL) nanoparticles (NPs) were synthesized by Stöber method from Methyltriethoxysilane CH3Si(OC2H5)3 (MTEOS). The mono- dispersed water soluble NPs having the size various from 70 to 100 nm depending on precursor, surfactant and catalyst quantities. Each particle contains hundreds – thousands dyes and was functionalized with bioactive ligands: NH2, SH and COOH, on the surface. The mono-dispersion of NPs have been improved by capping by Bovin Serum Albumin (BSA). The dye doped ormosil NPs were successfully attached to anti E.Coli 0157:H7 antibodies to form a complex ORMOSIL NP-antibody capable to specifically recognize the target - E.Coli O157:7H bacteria. The results show the ability of NPs as optical bioprobes. Key words: dye-doped silica-based nanoparticles, biofunctionalisation, E.Coli O157:H7 bacteria * Email: phamtantn@gmail.com