Chẩn đoán trước sinh bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh thể thiếu 21 - Hydroxylase

194 TCNCYH 82 (2) - 2013 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC 12. Juan Tian., Guohua Yang et al (2011). Molecular diagnosis of two families Summary MUTATION AND CARRIER DETECTION OF CONGENITAL ADRENAL HYPERPLASIA CAUSED BY 21 - HYDROXYLASE DEFICIENCY Congenital adrenal hyperplasia causes by 21- hydroxylase deficiency (CAH - 21OH) is an autosomal recessive genetic disorder due to mutation in the CYP21A2 gene. The aim of this study was to identify mutations of CYP21A2 gene in patients with CAH - 21OH and detect the carrier in family members of CAH - 21OH patients. 33 CAH - 21OH patients and 78 family members were selected for this study; direct DNA sequencing and MLPA were used to identify the mutation and carriers in CYP21A2. The result showed that, in the patient group, 33/33 (100%) patients were found to have mutation in CYP21A2 gene with 7 different types of mutation and 656 A/C > G (IVS2 - 13A/C > G) was the most common mutation with 13/33 (39.5%) and following is the deletion mutation with 7/33 (21.2%). In the carrier group, 32/33 fathers, 33/33 mother and 5/12 siblings were identified as carrier. Our results are important for prenatal diagnosis and genetic counseling to reduce the ratio of disease and have suitable treatment for mother in initial weeks of gestation. Keywords: congenital adrenal hyperplasia, CYP21A2 mutation, carrier with classic congenital adrenal hyperplasia,. Gene, 05.019, 368 - 389. CHẨN ĐOÁN TRƯỚC SINH BỆNH TĂNG SẢN THƯỢNG THẬN BẨM SINH THỂ THIẾU 21 - HYDROXYLASE Ngô Thị Thu Hương1, Trần Vân Khánh1, Nguyễn Phú Đạt1, Nguyễn Viết Tiến2, Tạ Thành Văn1 1Trường Đại học Y Hà Nội, 2Bệnh viện Phụ sản Trung ương Tăng sản thượng thận bẩm sinh (TSTTBS) là một bệnh di truyền lặn trên nhiễm sắc thể thường, khoảng trên 90% gây nên do thiếu hụt enzym 21- hydroxylase. Việc đưa ra một phác đồ điều trị thích hợp với các bà mẹ mang thai sẽ là giải pháp hiệu quả để để tránh được hiện tượng nam hóa đối với trẻ gái bị bệnh. Nghiên cứu này được tiến hành với mục tiêu chẩn đoán trước sinh cho các thai phụ mang gen đột biến dị hợp tử bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh thể thiếu 21 - OH. Sử dụng kỹ thuật giải trình tự gen và MLPA để xác định đột biến gen ở thai nhi tuần thứ 16 của 04 thai phụ thuộc 04 gia đình bệnh nhân tăng sản thượng thận bẩm sinh. Kết quả cho thấy, 1 thai nhi mang đột biến dị hợp tử 656A/C > G/1763insT, 1 thai nhi mang đột biến đồng hợp tử 2110C > T (R356W) và 2 thai nhi không mang gen đột biến gen. Từ khóa: tăng sản thượng thận bẩm sinh, chẩn đoán trước sinh, đột biến gen CYP21A2 TCNCYH 82 (2) - 2013 195 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC I. ĐẶT VẤN ĐỀ Tăng sản thượng thận bẩm sinh (congenital adrenal hyperplasia - TSTTBS) thể thiếu enzym 21 - hydroxylase (21 - OH) là bệnh di truyền lặn trên nhiễm sắc thể số 6. Bệnh do đột biến gen CYP21A2 gây rối loạn quá trình sinh tổng hợp hormon vỏ thượng thận, bệnh cảnh lâm sàng là cơn suy thượng thận cấp hoặc nam hóa ở trẻ gái, dậy thì sớm giả ở trẻ trai [1, 2]. Bệnh có thể dự phòng bằng phương pháp tư vấn di truyền dựa trên kết quả phát hiện người lành mang gen bệnh và chẩn đoán trước sinh. Theo nghiên cứu của Lee và cộng sự, ước tính tỷ lệ người lành mang gen bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh là 1/83 đối với quần thể người Trung Quốc [3]. Theo các báo cáo khác trên thế giới, tỷ lệ chung người lành mang gen bệnh là 1/55 [4, 5]. Ở Việt Nam, khoa Nội tiết - Chuyển hóa - Di truyền, bệnh viện Nhi Trung ương là một trong những nơi quản lý số lượng lớn khoảng trên 600 bệnh nhân tăng sản thượng thận bẩm sinh. Tuy nhiên, việc phát hiện, quản lý chưa được thực hiện thường quy, mặc dù công việc này là cần thiết nhằm: 1. Chẩn đoán và điều trị trước sinh cho thai nhi gái mắc bệnh để phòng và làm giảm nam hóa gây mơ hồ giới tính sau sinh và điều trị sớm ngay sau sinh cho thai nhi trai. 2. Tư vấn tiền hôn nhân nhằm giảm trẻ sinh ra bị mắc bệnh. Xuất phát từ ý nghĩa thực tiễn trên, đề tài được thực hiện với mục tiêu chẩn đoán trước sinh cho các thai phụ mang gen đột biến dị hợp tử bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh thể thiếu 21 - OH. II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 1. Đối tượng 4 thai phụ của 4 gia đình có con bị bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh thể thiếu enzym 21 - hydroxylase đã xác định được đột biến, đang mang thai ở tuần thứ 16. 2. Phương pháp 2.1. Quy trình lấy mẫu Các thai phụ mang gen dị hợp tử đã có con bị bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh thể thiếu 21 - OH được kiểm tra bằng siêu âm và đo nồng độ HCG trong huyết thanh. Lấy mẫu bằng phương pháp chọc hút dịch ối dưới sự hướng dẫn của siêu âm tại bệnh viện Phụ Sản trung ương. Dịch ối được bảo quản và vận chuyển về trung tâm Nghiên cứu Gen - Protein, trường Đại học Y Hà Nội. 2.2. Kỹ thuật tách chiết DNA DNA được tách chiết từ tế bào ối theo quy trình phenol/chloroform. Tất cả các mẫu DNA được tiến hành đo nồng độ và độ tinh sạch, những mẫu có OD 260 - 280 đạt từ 1,8 - 2 được sử dụng để phân tích gen. 2.2. Kỹ thuật giải trình tự gen Các cặp mồi đặc hiệu được sử dụng để khuyếch đại gen CYP21A2. Chu trình nhiệt phản ứng PCR: 900C - 10 giây, [960 C - 10 giây, 550C - 15 giây, 720C - 2 phút] x 30 chu kỳ. Sản phẩm PCR được tinh sạch và giải trình tự trên máy ABI - 3100 tại trung tâm nghiên cứu Gen - Protein, trường Đại học Y Hà Nội. Kết quả được phân tích bằng phần mềm CLC và so sánh với kết quả của bệnh nhân tăng sản thượng thận bẩm sinh trong gia đình đã xác định được đột biến. 2.3. Kỹ thuật MLPA (Multiplex ligation dependent probe amplification) Sử dụng kit MLPA P050B2 (MRC - Holland) Địa chỉ liên hệ: Tạ Thành Văn - Trường Đại học Y Hà Nội Số 1 Tôn Thất Tùng, Đống Đa, Hà Nội. Email: tathanhvan@hmu.edu.vn Ngày nhận: 04/03/2013 Ngày được chấp thuận: 26/4/2013 196 TCNCYH 82 (2) - 2013 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC để phát hiện đột biến xóa đoạn trên bệnh nhân và người lành mang gen bệnh. Thành phần của kit gồm các probe để khuyếch đại gen CYP21A2, mỗi probe tương ứng với một vùng gen, ngoài ra còn có các probe đặc trưng cho gen của người cũng được sử dụng để làm đối chứng và 2 probe cho nhiễm sắc thể X và Y để xác định giới tính. Sản phẩm khuếch đại được điện di mao quản trên máy giải trình tự. Số lượng sản phẩm khuếch đại của mỗi probe tỷ lệ thuận với số bản copy của đoạn DNA đích đặc hiệu với probe đó. III. KẾT QUẢ Bằng kỹ thuật giải trình tự gen và MLPA, đã phát hiện được 2/4 thai nhi không có đột biến gen CYP21A2, 2/4 thai nhi có đột biến gen giống anh trai của thai nhi (bảng 1). Bảng 1. Kết quả phân tích gen của thai nhi và gia đình Gia đình Bệnh nhân Bố bệnh nhân Mẹ bệnh nhân Thai nhi Gia đình 1 656A/C > G/656A/C > G** (anh trai) 656A/C > G* 656A/C > G* Bình thường Gia đình 2 656A/C > G * /1763insT* (anh trai) 656A/C > G* 1763insT* 656A/C > G/1763insT*/* Gia đình 3 2110C > T/2110C > T** (anh trai) 2110C > T* 2110C > T* 2110C > T/2110C>T** Gia đình 4 exon 1 - 3 del/exon 1 - 3 del** (chị gái) exon 1 - 3 del* exon 1 - 3 del* Bình thường ** Đột biến đồng hợp tử; * Đột biến di hợp tử Kết quả ở bảng 1 cho thấy bố và mẹ đều mang gen ở trạng thái dị hợp tử, bệnh nhân và 2 thai nhi có đột biến gen đều nhận 2 allele đột biến từ bố và mẹ. Kết quả đột biến gen của phả hệ gia đình 3 Gia đình này có người con trai bị bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh được phân tích xác định đột biến gen CYP21A2. Kết quả cho thấy bệnh nhân có đột biến 2110C > T ở trạng thái đồng hợp tử. Kết quả phân tích gen trên bố, mẹ bệnh nhân cho thấy đều mang gen dị hợp tử 2110C > T (người lành mang gen bệnh). Bà mẹ mang thai được chẩn đoán trước sinh ở tuần thứ 16. Kết quả cho thấy thai nhi bị đột biến gen giống như người anh trai (hình 1). TCNCYH 82 (2) - 2013 197 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC I II III Nữ bình thường Nam bình thường Nữ mang gen Nam mang gen Nam bị bệnhThai nhi bị bệnh 2110C>T R 356 W2110C Bệnh nhânNgười bình thường Bố bệnh nhân Mẹ bệnh nhân 2110C>T R 356 W 2110C>T R 356 W 2110C>T R 356 W Thai nhi Hình 1. Kết quả chẩn đoán trước sinh gia đình 3 A) Phả hệ gia đình bệnh nhân; B) Kết quả phân tích gen CYP21A2. Mũi tên thẳng đứng chỉ vị trí đột biến, các chữ số trên mũi tên chỉ vị trí nucleotid. Kết quả đột biến gen của phả hệ gia đình 4 Gia đình này có con gái bị bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh được phân tích xác định đột biến gen CYP21A2. Kết quả cho thấy, bệnh nhân có đột biến đồng hợp tử mất đoạn exon 1 - 3. Kết quả phân tích gen trên bố, mẹ bệnh nhân cho thấy họ đều mang gen dị hợp tử mất đoạn exon 1 - 3 (người lành mang gen bệnh). Bà mẹ mang thai được chẩn đoán trước sinh ở tuần thứ 16. Kết quả cho thấy thai nhi không có đột biến gen giống như người chị gái (hình 2). 198 TCNCYH 82 (2) - 2013 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC I II III Nữ bình thường Nam bình thường Nữ mang gen Nam mang gen Nam bị bệnhThai nhi bình thường ex1ex3 Y Y Y Y Y ex1ex3 ex1ex3 ex1ex3 ex1ex3 Người bình thường Bệnh nhân Bố bệnh nhân Mẹ bệnh nhân Thai nhi Hình 2. Kết quả chẩn đoán trước sinh gia đình 4 A) Phả hệ gia đình bệnh nhân; B) Kết quả phân tích gen CYP21A2. Mũi tên thẳng đứng chỉ vị trí đột biến, ex1, ex3, là các đỉnh tương ứng với vị trí exon 1, 3 của gen CYP21A2; Y là đỉnh tương ứng với nhiễm sắc thể Y dùng để xác định giới tính. TCNCYH 82 (2) - 2013 199 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC IV. BÀN LUẬN Chẩn đoán trước sinh cho 4 thai phụ mang gen dị hợp tử của 4 gia đình có con bị bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh. Kết quả cho thấy 1 thai nhi có đột biến gen dị hợp tử 656A/ C > G/1763insT và 1 thai nhi có đột biến gen đồng hợp tử 2110C > T (R356W), 2 thai nhi không có đột biến gen. Theo phả hệ gia đình số 2 và số 3 có con trai mang đột biến đồng hợp tử 656A/C > G và dị hợp tử 656A/C > G/1763insT đều ở thể mất muối. Đây là dạng đột biến hay gặp với tỷ lệ khá cao, trên thế giới (12 - 56%) tùy thuộc vào từng chủng tộc. Đối với 2 gia đình này, bố mẹ đều mang gen dị hợp tử nên khi người mẹ mang thai có nguyện vọng được chẩn đoán trước sinh. Kết quả phân tích gen cho thấy giống như người anh trai mang đột biến, sau khi được tư vấn, 2 bà mẹ tự nguyện xin đình chỉ thai nghén. Gia đình thứ 1, 4 có bố mẹ đều mang gen dị hợp tử ở vị trí 656A/C > G và mất đoạn ở vị trí exon 1 - 3. Người anh và người chị gái của thai nhi mang gen đột biến đồng hợp tử 656A/C > G và đột biến đồng hợp tử mất đoạn exon 1 - 3 với biểu hiện lâm sàng mất muối nặng, do không được chẩn đoán sớm và điều trị kịp thời nên bệnh rất nặng nề, chị gái của gia đình số 4 có để lại di chứng bại não. Chẩn đoán trước sinh được thực hiện cho 2 bà mẹ khi mang thai ở tuần thứ 16. Kết quả phân tích gen cho thấy, cả 2 thai nhi không mang đột biến gen và được tư vấn giữ thai, 2 bé đồng thời được lập hồ sơ quản lý để có biện pháp tư vấn tiền hôn nhân sau này. Hiện tại 2 bé đã được sinh ra và phát triển khỏe mạnh. Nghiên cứu của B.Ezquieta ở Tây Ban Nha (2006) phân tích gen cho một gia đình có con gái đầu bị bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh thể thiếu 21 - OH, mang gen đột biến đồng hợp tử Q138X với biểu hiện lâm sàng thể mất muối nặng. Kết quả chẩn đoán trước sinh người mẹ cho thấy thai nhi là nam, mang đột biến dị hợp tử nên người mẹ được tư vấn giữ thai. Ở Tây Ban Nha, chẩn đoán trước sinh cho các gia đình có nguy cơ sinh con bị bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh có vai trò rất quan trọng, đặc biệt những gia đình mang gen đột biến Q138X, loại đột biến gây mất hoạt tính của enzym hoàn toàn với biểu hiện lâm sàng thể mất muối nặng [6]. Tăng sản thượng thận bẩm sinh là một bệnh lý di truyền đơn gen lặn trên nhiễm sắc thể thường, bố mẹ mang gen dị hợp tử có khả năng 25% sinh con bình bình thường, 25% sinh con là người lành mang gen và 50% sinh con bị bệnh [7, 8]. Sinh ra một người con bị bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh là một gánh nặng rất lớn về kinh tế và tinh thần cho mỗi gia đình và xã hội, do vậy phát hiện và chẩn đoán sớm trước sinh vẫn là biện pháp cơ bản để phòng ngừa bệnh. V. KẾT LUẬN Chẩn đoán trước sinh cho 4 thai phụ của 4 gia đình có con bị bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh thể thiếu 21 - OH cho kết quả : 1 thai nhi có đột biến gen dị hợp tử 656A/C > G/1763insT, 1 thai nhi có đột biến gen đồng hợp tử 2110C > T (R356W) và 2 thai nhi không có đột biến gen. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Angel.O.K Chan, But.M.W (2011). Molecular analysis of congenital adrenal hyperplasia due to 21- hydroxylase deficiency in Hong Kong Chinese patients, Steroids, 76, 1057 - 1062. 2. Saroj. N, New. M. I (2011). Congenital adrenal hyperplasia due to 21 – hydroxylase deficiency, Annals of the new york academy of sciences, 1192, 5 - 11. 200 TCNCYH 82 (2) - 2013 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC 3. Lee. H. H (2004). The chimeric CYP21P/ CYP21 gene and 21-hydroxylase deficiency, Journal Hum Genet, 49, 65 - 72. 4. Anastasovska.V, Kocova. M (2010). Detected heterozygouts during the molecular analysis of the common CYP21A2 point muta- tions in Macedonian patients with congenital adrenal hyperplasia and their relatives, Contri- butions, Sec, Biol.Med.Sci, 2, 71 - 82. 5. Baumgartner-Parzer. S.M, Nowotny.P, et al (2004). Carrier frequency of congenital adrenal hyperplasia (21 - hydroxylase defi- ciency) in a Middle European population, The journal of clinical Endocrinology & Metabolism, 90(2), 775 - 778. 6. B.Ezquieta. M. Beneyto et al (2006). Gene duplication in 21-hydroxylase deficiency: the importance of accurate molecular diagno- sis in carrier detection and prenatal diagnosis, Prenat Diagne, 26, 1172 - 1178. 7. Finkielstain GP, Chen W, Mehta SP et al (2011). Comprehensive genetic analysis of 182 unrelated families with congenital adrenal hyperplasia due to 21-hydroxylase deficiency, J Clin Endocrinol Metab, 96 (1), 161 - 172. 8. Peter Wieacker, Johannes Steinhard (2010), The prenatal diagnosis of genetic dis- eases, Dtsch Arztebl Int, 107 (48), 857 - 862. Summary PRENATAL DIAGNOSIS OF CONGENITAL ADRENAL HYPERPLASIA DUE TO 21 - HYDROXYLASE DEFICIENCY Congenital adrenal hyperplasia is an autosomal recessive disorder in more than 90% of cases caused by genetic aberrations of the steroid 21-hydroxylase gene (CYP21A2). Appropriate prenatal treatment to the at-risk pregnant mother is effective in reducing genital virilization in the fetus, thus avoiding unnecessary genitoplasty in affected females. This study was carried out with the purpose of prenatal diagnosis for mothers carrying heterozygous mutation in CYP21A2 gene. Sequencing and MLPA methods were used to identify mutation in CYP21A2 gene for fetus at 16th week of the gestation. The results showed that 2 out of 4 fetuses have mutation in CYP21A2 gene including 1 fetus with heterozygous mutation of 656A/C > G/1763insT, 1 fetus with homozy- gous mutation of 2110C > T (R356W) and 2 fetus are normal. Keywords: congenital adrenal hyperplasia, CYP21A2 mutation, prenatal diagnosis