Bước đầu tinh sạch polyphenol có hoạt tính chống oxy hóa từ hải miên Aaptos suberitoides Brøndsted (1934)

64 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 4/2017 THOÂNG BAÙO KHOA HOÏC BƯỚC ĐẦU TINH SẠCH POLYPHENOL CÓ HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA TỪ HẢI MIÊN Aaptos suberitoides Brøndsted (1934) INITIAL PURIFICATION OF POLYPHENOL WITH ANTIOXIDANT ACTIVITY FROM SPONGE Aaptos suberitoides Brøndsted (1934) Trần Khắc Trí Nhân1, Vũ Ngọc Bội2, Đặng Xuân Cường3 Ngày nhận bài: 15/11/2017; Ngày phản biện thông qua: 22/12/2017; Ngày duyệt đăng: 29/12/2017 TÓM TẮT Bài báo tập trung trình bày về kết quả bước đầu tinh sạch polyphenol có hoạt tính chống oxy hóa từ loài hải miên Aaptos suberitoides. Kết quả nghiên cứu cho thấy phân đoạn polyphenol trong chloroform có hàm lượng polyphenol cao nhất là 122,645 ± 0,053 mg acid gallic/ml, tương ứng với hoạt tính chống oxy hóa và hoạt tính khử sắt lần lượt là 226,76 mg a.ascorbic/ml và 15,605 mg FeSO 4 /ml. Độ tinh sạch của phân đoạn polyphenol trong chloroform cao nhất, tăng 13,778% so với dịch chiết cô đặc. Polyphenol thu nhận từ loài hải miên Aaptos suberitoides có thể được ứng dụng để sản xuất các sản phẩm y dược phẩm và thực phẩm. Từ khóa: Aaptos suberitoides, chống oxy hóa, hải miên, phân đoạn, polyphenol ABSTRACT The paper focused on initial purifi cation of polyphenol with antioxidant activity from Aaptos suberitoides sponge. The results showed that the polyphenol fraction in chloroform has the highest polyphenol content, 122.645 ± 0.053 mg gallic acid/ml. Total antioxidant and reducing power activity of the polyphenol fraction in chloroform were 226.76 mg ascorbic acid/ml and 15.605 mg FeSO 4 /ml. Purifi cation degree of polyphenol in the chloroform fraction was also the highest, increased to 13.778%, comparable to concentrated extract. Polyphenol extracted from sponge Aaptos suberitoides can be applied into the production for the product of functional food and medicine. Keywords: Aaptos suberitoides, antioxidant, sponge, fraction, polyphenol 1 Trần Khắc Trí Nhân. GV. Khoa CNTP, Cao Đẳng nghề Phú Yên. Email: Tran.khac.tri.nhan.1992@gmail.com. SĐT. 01645610389 2 Vũ Ngọc Bội - PGS. TS. Khoa Công nghệ Thực phẩm, Đại học Nha Trang 3 Đặng Xuân Cường – TS. Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang, VAST spongosine [4], crotonoside [13], suberitine A-D [6],.... Nhiều công bố cho thấy, polyphenol hải miên có hoạt tính cao trong việc ức chế tế bào khối u P388 (gây bệnh bạch cầu), ung thư phổi và u tủy ở động vật và polyphenol còn có khả năng giúp hải miên tự bảo vệ chống lại các mối đe dọa từ môi trường như các cuộc tấn công của động vật ăn thịt, vi sinh, sinh vật bám hay chống lại các tác động bất lượi của môi trường [12]. I. MỞ ĐẦU Hải miên là động vật biển được cho là có chứa nhiều chất có hoạt tính sinh học, có thể sử dụng để hỗ trợ điều trị bệnh cho con người như: di-isobutyl phthalate [1], di-n- butyl phthalate, acid linoleic [9], β–sitosterol [3], triglyceride [14],... Trong số đó các nhà khoa học đã phát hiện được các loại polyphenol có hoạt tính chống oxy hóa cao như spongouridine, spongothymidine [10], Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 4/2017 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 65 Vì thế chúng tôi tiến hành nghiên cứu về polyphenol ở hải miên. Bài báo này đã thể hiện kết quả nghiên cứu ban đầu về quá trình tinh sạch polyphenol có hoạt tính chống oxy hóa từ hải miên Aaptos suberitoides nhằm mục đích định hướng quá trình nghiên cứu tinh sạch polyphenol có hoạt tính chống oxy hóa từ loài này để ứng dụng trong thực phẩm chức năng cũng như dược phẩm. II. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Nguyên liệu Nguyên liệu hải miên Aaptos suberitoides được thu mẫu tại ven biển Hòn Mun, Hòn Một thuộc Nha Trang, Khánh Hòa và được chuyên gia Thái Minh Quang - Viện Hải dương học Nha Trang định danh. Kết quả thu mẫu cho thấy, loài hải miên Aaptos suberitoides có trữ lượng tại vùng thu mẫu vào khoảng 400 gam mẫu/5m2. Sau khi thu mẫu, hải miên được rửa sạch bằng nước biển và ướp đá xay theo tỷ lệ hải miên/đá xay là 1/3 (w/w) và vận chuyển ngay về phòng thí nghiệm tại Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Nha Trang ngay sau khi thu mẫu. Tại phòng thí nghiệm, Hải miên được bảo quản ở tủ đông sâu và phá vỡ cấu trúc bằng nitơ lỏng, đồng hóa và bảo quản bột hải miên trong tủ đông. Bột hải miên được sử dụng để chiết polyphenol trong quá trình nghiên cứu. 2. Phương pháp nghiên cứu 2.1. Phương pháp chiết polyphenol từ hải miên Polyphenol có hoạt tính chống oxy hóa được chiết từ bột hải miên bằng phương pháp ngâm chiết có hỗ trợ sóng siêu âm ở chế độ gián đoạn, dung môi chiết là methanol 99,9%, nhiệt độ chiết 500C, thời gian chiết 75 phút, tỷ lệ DM/NL là 40/1 (v/w), chiết 1 lần. Dịch chiết được lọc qua giấy lọc Whatman No. 4 để loại bỏ tạp chất. Sau đó, dịch lọc được cô đặc bằng thiết bị cô quay chân không ở nhiệt độ 400C và sử dụng dịch cô đặc để nghiên cứu sơ bộ tinh sạch. Sau khi cô đặc, dịch cô đặc (A) có một số chỉ tiêu chất lượng: hàm lượng polyphenol là 169,325 mg phloroglucinol/ml dịch chiết cô đặc (chiếm 73,694% trong tổng số chất khô có trong dịch cô đặc) tăng 9,899 lần so với dịch chiết ban đầu (17,106 mg phloroglucinol/ml dịch chiết ban đầu), Hoạt tính chống oxy tổng là 469,839 mg acid ascorbic/ ml dịch chiết cô đặc, tăng 7,306 lần so với dịch chiết ban đầu (64,316 mg acid ascorbic/ml dịch chiết) và hoạt tính khử sắt là 39,136 mg FeSO4/ ml dịch chiết cô đặc, tăng 7,596 lần so với dịch chiết ban đầu (5,153 mg FeSO4/ml dịch chiết). 2.2. Tinh sạch sơ bộ polyphenol từ hải miên bằng kỹ thuật chiết lỏng - lỏng Dịch chiết cô đặc được chiết phân đoạn bằng kỹ thuật chiết lỏng lỏng bằng các dung môi hữu cơ có độ phân cực khác nhau: n-hexan, chlorofrom, ethyl acetat, n-butanol, nhằm phân đoạn các polyphenol có độ phân cực khác nhau và hoạt tính khác nhau. Chiết phân đoạn polyphenol trong n-hexan, sử dụng tỷ lệ n-hexan/dịch methanol cô đặc là 1/1; 4/1; 9/1; 10/1; 11/1 (v/v); Chiết phân đoạn polyphenol trong chloroform, sử dụng tỷ lệ chloroform/ dịch methanol cô đặc là 1/1; 3/1; 5/1; 8/1; 10/1; 11/1 (v/v); Chiết phân polyphenol trong đoạn ethanol, sử dụng tỷ lệ ethanol/ phân đoạn chloroform là 1/1; 4/1; 10/1; 11/1 (v/v); Phân đoạn polyphenol trong ethyl acetate, sử dụng tỷ lệ ethyl acetate/ dịch methanol cô đặc là 1/1; 4/1; 6/1; 7/1 (v/v) và chiết phân đoạn polyphenol trong n-butanol, sử dụng tỷ lệ n-butanol/ dịch methanol cô đặc là 1/1; 4/1; 6/1; 7/1 (v/v). Các phân đoạn thu được sẽ được sử dụng để ánh giá hàm lượng polyphenol, hoạt tính chống oxy hóa và hoạt tính khử sắt. 2.3. Phương pháp định lượng polyphenol Định lượng hàm lượng polyphenol tổng (TPC) theo phương pháp sử dụng Folin- Ciocalteu của Swanson và cộng sự , 2002 [11] với phloroglucinol là chất chuẩn. Cách tiến hành: lấy 300 μl dịch mẫu bổ sung 01 ml Folin- Ciocalteu 10%, giữ 5 phút. Tiếp theo thêm vào 2 ml Na2CO3 10%, trộn đều, giữ 90 phút trong 66 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 4/2017 bóng tối, sau đó đo độ hấp thụ ở bước sóng 750 nm, đo trên máy UV-Vis Spectrophotometer JenWay 6400/ 6405. 2.4. Phương pháp xác định hoạt tính của poly- phenol - Hoạt tính chống oxy hóa tổng (TA): được xác định theo phương pháp của Prieto và cộng sự (1999) [8]. Cách tiến hành: lấy 100µl mẫu bổ sung 900µl nước cất và thêm 3 ml dung dịch A (H2SO4 0,6 M, sodium phosphate 28 mM and ammonium Molybdate 4 mM). Hỗn hợp được giữ 90 phút ở 950C. Sau đó đo ở bước sóng 695 nm với chất chuẩn là acid ascorbic. - Hoạt tính khử Fe (RP): được xác định theo phương pháp của Zhu và cộng sự (2002) [14]. Cách tiến hành: lấy 500µl dịch mẫu bổ sung 0,5ml đệm phosphate pH 7,2 và 0,2 ml K3[Fe(CN)6] 1%. Giữ hỗn hợp 20 phút ở 50 0C. Sau đó thêm vào 500µl CCl3COOH 10% với sự bổ sung 300µl nước cất và 80µl FeCl3 0,1%. Tiếp theo đo ở bước sóng 655 nm với chất chuẩn là FeSO4. 2.5. Phân tích dữ liệu Thực nghiệm được tiến hành lặp lại 3 lần (n=3), phân tích thống kê và ANOVA trên cơ sở sử dụng phần mềm MS. Excel 2010. III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 1. Bước đầu tinh sạch POLYPHENOL từ hải miên AAPTOS SUBERITOIDES bằng các dung môi hữu cơ khác nhau 1.1. Hàm lượng polyphenol, hoạt tính chống oxy hóa và hoạt tính khử sắt của dịch chiết phân đoạn polyphenol hải miên Aaptos suberitoides trong n-hexan Kết quả chiết phân đoạn polyphenol từ Aaptos suberitoides bằng n-Hexan theo các tỷ lệ dung môi n-Hexan/dịch chiết cô đặc theo tỷ lệ 1/1; 4/1; 9/1; 10/1; 11/1 (v/v), như sau: Hình 1. Hàm lượng polypehnol (a), hoạt tính chống oxy hóa tổng (b) và hoạt tính khử sắt (c) của phân đoạn polyphenol từ A. suberitoides trong khác nhau Phân đoạn n-Hexan có hàm lượng polyphenol và hoạt tính chống oxy hóa, hoạt tính khử sắt thấp hơn so với phân đoạn chloroform. Sự có mặt của polyphenol trong phân đoạn n-Hexan chứng tỏ polyphenol trong Hải miên Aaptos suberitoides khá phong phú và có chứa nhiều loại có đặc tính không phân cực, nên phân đoạn n-Hexan có chứa polyphenol hoạt tính. Hàm lượng polyphenol không phân cực với hoạt tính chống oxy hóa và hoạt tính khử sắt trong phân đoạn n-hexan được chiết theo tỷ lệ n-hexan/dịch chiết cô đặc là 1/1 (v/v) luôn cao hơn so với các tỷ lệ chiết phân đoạn khác và đạt mức tương ứng 2,965 ± 0,35 mg/ml dịch phân đoạn n-hexan (Hình 1a). Hoạt tính chống oxy hóa và hoạt tính khử sắt của phân đoạn n-hexan khi chiết với tỷ lệ n-hexan/methanol là 1/1 (v/v) cũng cao nhất và đạt tương ứng là 7,733 ± 0,012 mg a.ascorbic/ml và 0,785 ± 0,004 mg FeSO4/ ml (Hình 1b và 1c). TA và RP của phân đoạn n-hexan ở các tỷ lệ n-hexan/dịch cô đặc khác nhau từ 1/1 (v/v) cho tới 9/1 (v/v) tăng lên tương ứng 1,624 lần và 1,446 lần. Khi chiết phân đoạn n-hexan cần chiết nhiều lần với nhiều tỷ lệ khác nhau và ở tỷ lệ 11/1 (v/v) đã thu Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 4/2017 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 67 hoàn toàn polyphenol chống oxy hóa không có độ phân cực. Hàm lượng polyphenol và hoạt tính chống oxy hóa có mối tương quan mạnh qua từng phân đoạn. Dung môi n-hexan là phù hợp cho việc tinh chế polyphenol không phân cực có hoạt tính chống oxy hóa từ hải miên và ứng dụng polyphenol trong thực dược phẩm. 1.2. Hàm lượng polyphenol, hoạt tính chống oxy hóa và hoạt tính khử sắt của dịch chiết phân đoạn polyphenol hải miên Aaptos suberi- toides trong chloroform Dịch chiết methanol cô đặc từ A. suberitoides tiếp tục được phân đoạn bằng chloroform theo các tỷ lệ dung môi chloroform/ dịch chiết cô đặc như sau: 1/1; 3/1; 5/1; 8/1; 10/1; 11/1 (v/v). Kết quả phân tích trình bày ở Hình 2. Hình 2. Hàm lượng polyphenol (a), hoạt tính chống oxy hóa tổng (b) và hoạt tính khử sắt (c) của phân đoạn polyphenol từ A. suberitoides trong chloroform Từ kết quả phân tích cho thấy phân đoạn polyphenol trong chloroform có hàm lượng polyphenol và TA, RP cao hơn nhiều so với các phân đoạn khác. Sự có mặt của polyphenol trong phân đoạn này chứng tỏ có một lượng lớn polyphenol trong Hải miên A. suberitoides có độ phân cực yếu (hằng số điện môi ~ 4,81), điều này thể hiện qua việc hòa tan trong chloroform. Hàm lượng polyphenol ở phân đoạn tỷ lệ chloroform/dịch chiết cô đặc là 1/1 (v/v) đạt mức 74,63 ± 0,03 mg/ml (Hình 2a), cao hơn so với hàm lượng polyphenol ở các phân đoạn chloroform khác và cao gấp 2,4 lần hàm lượng polyphenol của phân đoạn polyphenol trong n-Hexan, ethanol, ethyl acetate, n-Butanol và lượng dịch sau cùng. TA và RP của phân đoạn chloroform theo tỷ lệ chloroform/methanol cô đặc 1/1 (v/v) cũng cao nhất, đạt tương ứng 226,76 ± 0,389 mg a.ascorbic/ml và 15,605 ± 0,005 mg FeSO4/ ml dịch phân đoạn chloroform. Phân đoạn chloroform ở tỷ lệ 8/1 (v/v) được đánh giá là phân đoạn có TA và RP thấp nhất, tương ứng là 5,666 ± 0,018 mg a.ascorbic/ ml và 0,002 mg FeSO4/ ml dịch phân đoạn chloroform (Hình 2b và 2c). Khi tỷ lệ chloroform/dịch cô đặc đã phân đoạn n-hexan tăng từ 1/1 đến 8/1 (v/v), hàm lượng polyphenol của phân đoạn chloroform tăng lên 1,61 lần, TA và RP tăng tương ứng 1,599 lần và 1,643 lần. Khi tỷ lệ chloroform/ dịch cô đặc đã phân đoạn n-hexan tăng hơn 8/1 (v/v), xét trong cùng một hàm mục tiêu, sự khác biệt có ý nghĩa thống kê đã không xảy ra giữa các tỷ lệ chiết phân đoạn. Sự tương quan giữa các hàm mục tiêu đã được tìm thấy ở mức mạnh mẽ và sự biến đổi tuân theo quy luật hàm phi tuyến. Như vậy, phân đoạn chloroform có hàm lượng polyphenol và hoạt tính chống oxy hóa cao hơn các dịch chiết phân đoạn trong các dung môi khác và phân đoạn này nên được thu nhận dùng cho các quá trình nghiên cứu tiếp theo. 1.3. Hàm lượng polyphenol, hoạt tính chống oxy hóa và hoạt tính khử sắt của dịch chiết phân đoạn polyphenol hải miên Aaptos suberitoides trong ethanol Sau khi thu được phân đoạn chloroforom, tiếp tục làm sạch polyphenol bằng cách phân đoạn bằng ethanol 96% ở các tỷ lệ ethanol/ chloroform là 1/1; 4/1; 10/1; 11/1 (v/v). 68 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 4/2017 Kết quả cho thấy có sự tương đồng về hàm lượng polyphenol và hoạt tính chống oxy hóa, họat tính khử sắt của các phân đoạn này khi so với phân đoạn trong chloroform. Hàm lượng polyphenol có tính phân cực yếu tan trong ethanol chỉ chiếm 4,28% so với tổng polyphenol ở phân đoạn chloroform. Hàm lượng polyphenol trong ethanol cao nhất khi chiết phân đoạn theo tỷ lệ 1/1 (v/v) tương ứng với 4,273 ± 0,074 mg/ml. Hoạt tính chống oxy hóa tổng và khử sắt ở phân đoạn này cũng khá cao, tương ứng với 14,233 ± 0,001 mg acid ascorbic/ml dịch phân đoạn ethanol và 0,994 ± 0,002 mg FeSO4/ml (Hình 3b và 3c). Kết quả nghiên cứu của chúng tôi có một chút tương đồng với nghiên cứu phân đoạn polyphenol trong ethanol tách từ phấn hoa Bee Venezuelan cung thu được phân đoạn có hàm lượng polyphenol với hoạt tính chống oxy hóa cao hơn so với phân đoạn methanol và nước [7]. Hình 3. Hàm lượng polypehnol (a), hoạt tính chống oxy hóa tổng (b) và hoạt tính khử sắt (c) của phân đoạn polyphenol từ A. suberitoides trong ethanol Từ kết quả nghiên cứu này cho thấy phân đoạn polyphenol trong ethanol này đã thu nhận được polyphenol có tính phân cực thấp đã hòa tan trong dung môi chloroform. 1.4. Hàm lượng polyphenol, hoạt tính chống oxy hóa và hoạt tính khử sắt của dịch chiết phân đoạn polyphenol hải miên Aaptos suberi- toides trong ethyl acetate Dịch chiết methanol từ Aaptos suberitoides sau khi được phân đoạn trong chloroform (gọi là dung dịch C) tiếp tục được phân đoạn bằng ethyl acetate theo các tỷ lệ ethyl acetate/ dung dịch C như sau: 1/1; 4/1; 6/1; 7/1 (v/v). Kết quả nghiên cứu trình bày ở Hình 4 cho thấy phân đoạn polyphenol trong ethyl acetate có hàm lượng polyphenol, TA và RP thấp hơn so với phân đoạn trong chloroform. Sự có mặt của polyphenol trong phân đoạn này chứng tỏ Hải miên A. suberitoides có chứa cả polyphenol có độ phân cực trung bình (hằng số điện môi ~ 6,02). Tuy nhiên, polyphenol nhóm này chiếm tỷ lệ thấp trong tổng số hàm lượng polyhenol có hoạt tính chống oxy hóa trong loài A. suberitoides. Hình 4. Hàm lượng polyphenol (a), hoạt tính chống oxy hóa tổng (b) và hoạt tính khử sắt (c) của phân đoạn polyphenol từ A. suberitoides trong ethyl acetate Hàm lượng polyphenol có độ phân cực trung bình với hoạt tính chống oxy hóa và hoạt tính khử sắt khi phân đoạn với tỷ lệ ethyl acetate/ dịch chiết cô đặc là 1/1 (v/v) cao hơn so với các tỷ lệ khác và đạt mức 3,043 ± 0,004 mg /ml dịch phân đoạn ethyl acetate (hình 4a). Polyphenol có độ phân cực trung bình hòa tan trong dung môi ethyl acetate chỉ bị chiết hoàn toàn Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 4/2017 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 69 khỏi dung dịch dịch C khi sử dụng tỷ lệ 5/1 (v/v). Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy hàm lượng polyphenol trong ethyl acetate chỉ chiếm tỷ lệ nhỏ (chiếm 1,814%) trong tổng hàm lượng polyphenol của tất cả các phân đoạn, hàm lượng polyphenol của phân đoạn n-butanol cao hơn phân đoạn n-hexan nhưng vẫn thấp hơn phân đoạn methanol sau cùng. Khi sử dụng tỷ lệ ethyl acetate/dung dịch C là 1/1 (v/v), TA và RP tương ứng là 8,526 ± 0,003 mg a.ascorbic/ ml phân đoạn ethyl acetate và 2,588 ± 0,002 mg FeSO4/ ml (Hình 4b và 4c). Kết quả phân tích thống kê cho thấy giữa hàm lượng polyphenol và hoạt tính có mối tương tác mạnh mẽ với nhau theo hàm phi tuyến và sự khác biệt chỉ xảy ra không có ý nghĩa khi chiết phân đoạn với tỷ lệ ethyl acetate/dung dịch C lớn hơn 6/1 (v/v). Như vậy, phân đoạn ethyl acetate có hàm lượng polyphenol thấp nên khó phù hợp cho mục tiêu tinh chế polyphenol có hoạt tính chống oxy hóa từ loài Hải miên Aaptos suberitoides để ứng dụng trong thực dược phẩm với hàm lượng cao. 1.5. Hàm lượng polyphenol, hoạt tính chống oxy hóa và hoạt tính khử sắt của phân đoạn polyphenol hải miên Aaptos suberitoides trong n-butanol Dịch chiết methanol từ A. suberitoides sau khi được phân đoạn trong chloroform (gọi là dung dịch D) tiếp tục được phân đoạn bằng n-butanol theo các tỷ lệ n-butanol/ dung dịch D theo tỷ lệ như sau: 1/1; 4/1; 6/1; 7/1 (v/v). Kết quả nghiên cứu cho thấy phân đoạn n-butanol có hàm lượng polyphenol, TA và RP thấp hơn so với phân đoạn trong chloroform. Sự có mặt của polyphenol trong phân đoạn này chứng tỏ loài Aaptos suberitoides có chứa cả polyphenol có độ phân cực mạnh (hằng số điện môi ~ 18). Tuy vậy, polyphenol có độ phân cực mạnh chỉ chiếm tỷ lệ thấp so với tổng số hàm lượng polyhenol có hoạt tính chống oxy hóa thu được từ loài này. Kết quả ở trên cũng cho thấy trong các phân đoạn khác nhau, từ dung môi không phân cực tới phân cực mạnh đều có hàm lượng polyphenol, TA và RP cao nhất khi phân đoạn ở tỷ lệ 1/1 (v/v). Hàm lượng polyphenol trong phân đoạn n-butanol là 7,111 ± 0,062 mg/ ml dịch phân đoạn n-butanol (Hình 5a). Trong phân đoạn này, hàm lượng polyphenol chỉ bị chiết hoàn toàn khỏi dung dịch D khi sử dụng đến tỷ lệ n-butanol/ dung dịch D là 6/1 (v/v). Polyphenol có độ phân cực tan trong n-butanol chiếm 5,368% so với tổng số polyphenol có trong dịch chiết methanol cô đặc. Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy hàm lượng polyphenol trong phân đoạn n-butanol cao hơn phân đoạn n-hexan và ethyl acetate nhưng thấp hơn trong phân đoạn methanol sau cùng. Hình 5. Hàm lượng polypehnol (a), hoạt tính chống oxy hóa tổng (b) và hoạt tính khử sắt (c) của phân đoạn polyphenol từ A. suberitoides trong n-butanol Kết quả cũng cho thấy hoạt tính TA và RP của phân đoạn n-butanol cao nhất khi chiết phân đoạn với tỷ lệ n-butanol/dung dịch D là 1/1 (v/v). Ở phân đoạn tỷ lệ 1/1 (v/v), hoạt tính TA và RP tương ứng là 3,361 ± 0,026 mg a.ascorbic/ ml dịch phân đoạn n-butanol và 1,302 ± 0,006 mg FeSO4/ ml dịch phân đoạn n-butanol (hình 5b và 5c). Như vậy, hàm lượng polyphenol trong phân đoạn n-butanol cũng có hàm lượng thấp và rất khó để thu được lượng lớn đủ để sử dụng trong thực phẩm hay dược phẩm. Tuy nhiên, chúng ta cũng cần quan tâm 70 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 4/2017 nghiên cứu về loại polyphenol này để có những ứng dụng phù hợp. 2. Đánh giá độ sạch của POLYPHENOL chiết phân đoạn Kết quả cho thấy, dịch chiết cô đặc được phân đoạn bằng kỹ thuật chiết lỏng thành sáu phân đoạn khác nhau: n-hexan, chloroform, ethanol, ethyl acetate, n-butanol và dịch chiết methanol sau cùng. Hàm lượng polyphenol trong phân đoạn n-hexan chiếm 96,84% trên tổng số các chất có trong phân đoạn và độ sạch của loại polyphenol này đã tăng lên 23,154% so với dịch cô đặc ban đầu. Dịch sau khi phân đoạn bằng n-hexan được tiến hành phân đoạn bằng chloroform. Hàm lượng polyphenol của phân đoạn chloroform chiếm 87,46% so với tổng số các chất có trong phân đoạn, đồng nghĩa với độ tinh sạch của polyphenol tăng 13,778% so với dịch cô đặc. Phân đoạn chloroform có hàm lượng polyphenol, hoạt tính chống oxy hóa và khử sắt cao nhất, tương ứng 74,63 mg /ml, 226,76 mg a.ascorbic/ml và 15,605 mg FeSO4/ ml. Phân đoạn này có độ sạch cao nên có thể sử dụng để tiếp tục tinh sạch qua cột Sephadex LH 20. Dịch sau phân đoạn bằng chloroform được sử dụng để tiếp tục phân đoạn bằng ethanol. Phân đoạn polyphenol trong ethanol có hàm lượng polyphenol chiếm 91,574% so với tổng chất khô có trong phân đoạn ethanol và độ sạch của polyphenol trong phân đoạn này đã tăng lên 4,111% so với độ sạch của polyphenol trong phân đoạn chloroform. So sánh với polyphenol trong phân đoạn n-hexan cho thấy polyphenol trong phân đoạn ethanol có độ sạch, hàm lượng polyphenol và hoạt tính chống oxy hóa cao hơn. Dịch chiết còn lại sau phân đoạn bằng chloroform được sử dụng để tách phân đoạn bằng ethyl acetate. Phân đoạn ethyl acetate có hàm lượng polyphenol chiếm 92,135% tổng lượng chất khô của phân đoạn, tương ứng với độ sạch của polyphenol tăng lên 18,45% so với ban đầu. Dịch chiết còn lại sau phân đoạn bằng ethyl acetate được sử dụng để tách phân đoạn bằng n-butanol và kết quả tách cho thấy phân đoạn n-butanol có hàm lượng polyphenol chiếm 96,65% tổng chất khô có trong phân đoạn, tương ứng với độ tinh sạch tăng lên 22,967%. Dịch chiết còn lại sau khi phân đoạn bằng n-butanol là phân đoạn methanol còn lại. Phân đoạn này có chứa 41,23% polyphenol trong tổng số các chất còn lại trong phân đoạn, tương ứng với độ sạch của polyphenol tăng lên 14,72% so với dịch cô đặc ban đầu. Các phân đoạn polyphenol trong chloroform, ethanol, n-hexan, ethyl acetate và n-butanol có thể ứng dụng trong điều chế chế phẩm polyphenol, có độ tinh sạch cao sử dụng trong thực phẩm hay dược phẩm. Ngoài ra, kết quả khảo sát của chúng tôi cho thấy loài Hải miên Aaptos suberitoides là loài có trữ lượng lớn (thu được 390 gam mẫu/5m2 tại vùng biển Khánh Hòa). Do vậy, hoàn toàn có thể sử dụng Hải miên Aaptos suberitoides để thu nhận polyphenol có hoạt tính chống oxy hóa để ứng dụng trong một số lĩnh vực của cuộc sống [5]. IV. KẾT LUẬN Từ các nghiên cứu ở trên có thể rút ra một số kết luận như sau: - Polyphenol có trong loài hải miên Aaptos suberitoides khá đa dạng về đặc tính hóa học thể hiện qua mức độ tan trong các dung môi khác nhau. Kết quả này cho phép nhận định rằng polyphenol từ hải miên Aaptos suberitoides đa dạng về hoạt tính sinh học. - Trong các phân đoạn polyphenol từ hải miên Aaptos suberitoides, phân đoạn chloroform có hàm lượng polyphenol cao nhất và đạt mức 122,645 ± 0,053 mg/ml, độ tinh sạch tương ứng của polyphenol tăng gấp 53,371% so với dịch chiết cô đặc. Hoạt tính chống oxy hóa tổng và hoạt tính khử sắt của phân đoạn polyphenol trong chloroform lần lượt là 226,76 mg a.ascorbic/ml và 15,605 mg FeSO4/ ml. Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 4/2017 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 71 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Bergmann W. and Feeney R. J., 1950. The isolation of a new thymine pentoside from sponges. J. Am Chem. Soc., 72, 2809-2810. 2. Brøndsted, H. V. 1934. Résultats Scientifi ques du Voyage aux Indes Orientales Néerlandaises de LL. AA. RR. le Prince et la Princesse Léopold de Belgique. Mémoires du Musée royal d’histoire naturelle de Belgique, Hors série. Van Straelen, 2(15), 1-27. 3. Faulkner D. J., 2002. Marine natural products. Nat Prod Rep, 19, 1-48. 4. Fox, Jack J., Yung, Naishun, Bendich and Aaron, 1957. Pyrimidine Nucleosides. II. The Synthesis of 1-β-D- Arabinofuranosylthymine (“Spongothymidine”)1. Journal of the American Chemical Society, 79(11), 2775- 2778. 5. Karin S., Andreas K., 2012. Sponge Farming Trials: Survival, attachment, and growth of two Indo-Pacifi c sponges, Neopetrosia sp. and Stylissa massa. Journal of Marine Biology, (2012), 11 pages. 6. Liu C., Tang X., Li P. and Li G., 2012. Suberitine A-D, four new cytotoxic dimeric aaptamine alkaloids from the marine sponge Aaptos suberitoides, 14(8), 1994-7. 7. Pérez Pérez E. M., Vit P., Rivas E., Sciortino R., Sosa A., Tejada D., Rodríguez Malaver A. J., 2012. Antioxidant activity of four color fractions of bee pollen from Mérida, Venezuela. Arch. Latinoam Nutr., 62(4), 375 - 380. 8. Prieto P., Pineda M. and Aguilar M., 1999. Spectrophotometric quantitation of antioxidant capacity through the formation of a phosphomolybdenum comple x: specifi c application to the determination of vitamin E. Analytical Biochemistry, 269, 337 - 341. 9. Proksch P., Edrada R. and Ebel R., 2002. “Drugs from the seas-current status and microbiological implications”. Appl Microbiol Biotechnol, 59, 125 - 134. 10. Sagar S., Kaur M., Minneman K. P., 2010. Antiviral lead compounds from marine sponge. Mar Drugs, 8(10), 2619 - 2638. 11. Swanson A. K. and Druehl L. D., 2002. Induction, exudation and the UV protective role of kelpphlorotannins. Aquatic Botany, 73, 241 - 253. 12. Tom Turk, Robert Frangež, Kristina Sepčić. 2007. Mechanisms of Toxicity of 3-Alkylpyridinium Polymers from Marine Sponge Reniera sarai. Mar Drugs., 5(4), 157 - 167. 13. Yan P., Zhang L., Peng C., Zhang R., 2017. Pharmacokinetics and tissue distribution of crotonoside. Xenobiotica, 1-9. 14. Zhu Q. T., Hackman R. M., Ensunsa J. L., Holt R. R. and Keen C. L., 2002. Antioxidative activities of oolong tea. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 50, 6929 - 6934.