Bước đầu nghiên cứu nattokinase của chủng vi khuẩn Bacillus sp. phân lập từ nem chua - Nguyễn Quỳnh Uyển

TAP CHI SINH HOC 2015, 37(1se): 129-133 DOI: 10.15625/0866-7160/v37n1se. BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU NATTOKINASE CỦA CHỦNG VI KHUẨN Bacillus sp. PHÂN LẬP TỪ NEM CHUA Nguyễn Quỳnh Uyển, Hoàng Thu Hà, Nguyễn Hồng Nhung, Phan Thị Hà, Nguyễn Huỳnh Minh Quyên* Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học, ĐHQG Hà Nội, *quyennhm@vnu.edu.vn TÓM TẮT: Nattokinase thu hút sự quan tâm của nhiều nhà khoa học do enzyme này có tác dụng ngăn ngừa cục máu đông trong cơ thể người. Đây là một serine protease có khả năng phân hủy huyết khối và khả năng này của nattokinase mạnh gấp 4 lần plasmin. Trong nghiên cứu của chúng tôi, nattokinase sinh tổng hợp từ chủng vi khuẩn phân lập từ nem chua được sơ bộ tinh sạch qua cột Hitrap Q. Ngoài ra, ảnh hưởng của pH, nhiệt độ và một số ion kim loại đến hoạt độ của enzyme này cũng được bước đầu nghiên cứu. Từ khóa: Bacillus, máu đông, nattokinase, nhồi máu cơ tim, phân hủy huyết khối. MỞ ĐẦU Hiện nay, bệnh nghẽn mạch như chứng nhồi máu cơ tim hay tai biến mạch máu não đang gia tăng không những ở Việt Nam mà còn trên toàn thế giới. Các bệnh liên quan đến nghẽn mạch thường có nguyên nhân là huyết khối. Sự ngăn ngừa hình thành huyết khối và phân hủy huyết khối tích lũy trong máu có vai trò quan trọng trong việc phòng ngừa và điều trị các bệnh này. Có nhiều nhóm thuốc điều trị các bệnh gây ra do huyết khối nhưng nattokinase thu hút sự quan tâm hơn cả do hoạt độ phân hủy huyết khối của nó mạnh gấp 4 lần plasmin (enzyme nội sinh làm tan máu đông) và hấp thụ nattokinase qua đường ăn uống là tuyệt đối an toàn [4]. Nattokinase (còn được gọi là subtilisin NAT) là một serine protease thuộc họ enzyme subtilisin. Nattokinase gồm một chuỗi polypeptide sợi đơn có 275-380 acid amin và có trọng lượng phân tử 26-42 kDa. Cấu trúc của nó gồm 2 xoắn α và 7 phiến β. Trình tự bảo thủ trong trung tâm hoạt động của nattokinase bao gồm các gốc acid amin aspartate (D32), histidine (H64), serine (S221) và asparagine (N155). Trình tự nattokinase có mức tương đồng lớn với các enzyme của họ subtilisin và đặc biệt là ở mức DNA nó có độ tương đồng 99,5% với subtilisin E [4]. Trong nghiên cứu này, ảnh hưởng của pH, nhiệt độ và một số ion kim loại đến hoạt độ của nattokinase sinh tổng hợp từ chủng Bacillus sp. phân lập từ nem chua được bước đầu nghiên cứu. Qua đó có thể thấy đây là enzyme khá bền với nhiệt và hoạt độ của enzyme đạt cao nhất tại pH 9. Đối với ảnh hưởng của các ion kim loại, duy nhất Mg2+ có tác dụng hoạt hóa enzyme, còn K+, Na+ hầu như không có ảnh hưởng đến hoạt tính trong khi Ni2+, Co2+, Mn2+, Ca2+, Zn2+, Ag+, Fe2+, Cu2+ thì ức chế hoạt tính enzyme ở các mức độ khác nhau. Enzyme này cũng được sơ bộ tinh sạch qua cột Hitrap Q và đỉnh có hoạt tính được điện di trên gel SDS-PAGE có cơ chất nhằm cung cấp những thông tin bước đầu về số lượng các băng protease có trong đỉnh này. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu là chủng Bacillus sp. (NC2) phân lập từ nem chua có hoạt tính nattokinase được cung cấp từ phòng Công nghệ Enzyme-Protein, Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội. Các hóa chất đều đạt độ tinh sạch cần thiết cho nghiên cứu. Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn Chủng NC2 được cấy ria trên đĩa chứa môi trường NA (pepton: 5 g, cao thịt: 3 g, thạch: 18 g, nước: 1 lít). Các khuẩn lạc đơn được nuôi cấy trong môi trường NA lỏng để lấy dịch trong xác định hoạt tính. Xác định hoạt độ phân giải huyết khối Hoạt độ nattokinase được định lượng thông qua plasmin thủy phân cơ chất N (p-tosyl) gly-pro-lys-4-nitro anilide acetate salt (AAS) và được phát hiện ở bước sóng 405 nm dựa theo phương pháp của Castellino et al. (1976) [1] và Hernandez et al. (1990) [2] có sửa đổi. Độ bền với nhiệt Dịch enzyme sau khi xử lý ở 60oC, 80oC và 95oC trong các thời gian khác nhau được đặt ngay vào đá khoảng 10 phút và được xác định hoạt độ nattokinase. Ảnh hưởng của pH Dịch enzyme được chỉnh pH đến các pH 7 - 13 bằng dung dịch NaOH 1 M và được xác định hoạt độ nattokinase. Xác định ảnh hưởng của ion kim loại đến hoạt độ của enzyme Dịch enzyme được trộn với các ion kim loại K+, Na+, Ni2+, Co2+, Mg2+, Ca2+, Fe3+, Cu2+, Mn2+, Zn2+ (muối clorua) và Ag+ (muối AgNO3) để đạt nồng độ cuối cùng là 0,01 M; 0,005 M và 0,001 M, sau đó xác định hoạt độ nattokinase. Đối chứng âm là môi trường khử trùng dùng để nuôi cấy vi khuẩn có bổ sung ion kim loại tương ứng với nồng độ 0,01 M; 0,005 M và 0,001 M. Đối chứng dương là dịch enzyme không bổ sung ion kim loại. Sắc ký trao đổi ion Hệ thống tinh sạch protein AKTA được sử dụng trong thí nghiệm sắc ký. Các điều kiện sắc ký: cột trao đổi anion Hitrap Q; đệm A: đệm Tris-HCl 0,02 M, pH 8,5; đệm B: đệm A được bổ sung 1 M NaCl. Điều kiện chạy của hệ thống AKTA: thể tích mẫu lên cột: 1 ml; tốc độ chạy: 1 ml/phút; cột sử dụng: Hitrap Q (5 ml); đệm sử dụng: Tris-HCl 0,02 M pH 8,5; đệm thôi mẫu: Tris-HCl 0,02M, pH 8,5 + NaCl 1 M; điều kiện thôi mẫu: 60% đệm thôi mẫu trong 20 phút, 80% trong 15 phút và 100% đệm thôi mẫu trong 10 phút; phân đoạn: 1 ml. Điện di trên gel polyacrylamide không có SDS Gel cô 4,5% (H20: 1,2 ml; Acrylamide-Bis 30%: 0,3 ml; Tris-HCl pH 6,8 0,5 M: 0,5 ml; APS 10%: 10 ml; TEMED: 10 ml) và gel tách (H20: 1,75 ml; Acrylamide-Bis 30%: 2 ml; Tris-HCl pH 8,8 1,5 M: 1,25 ml; APS 10%: 10 ml; TEMED: 10 ml) được bổ sung cơ chất casein (0,1%) để điện di phát hiện các băng protease. Sau khi điện di, gel được ủ trong đệm Tris-HCl 0,02M pH 8,5 trong 12 h, sau đó nhuộm với Coomassie Brilliant Blue 1%. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Hình 1. Độ bền nhiệt của nattokinase Hình 2. Ảnh hưởng của pH đối với hoạt độ của nattokinase Nghiên cứu một số tính chất của nattokinase được sinh tổng hợp bởi chủng NC2 Để bước đầu tìm hiểu một số tính chất của enzyme do chủng NC2 sinh ra, chúng tôi tiến hành một số thí nghiệm về độ bền với nhiệt, ảnh hưởng của pH và một số ion kim loại đối với hoạt độ của enzyme này. Độ bền với nhiệt Dịch sau nuôi cấy của chủng NC2 được xử lý ở các ngưỡng nhiệt độ 60oC, 80oC và 95oC trong các thời gian khác nhau (10, 20, 30... đến 90 phút) và sau đó hoạt độ nattokinase được xác định. Kết quả cho thấy enzyme này khá bền với nhiệt cụ thể sau khi xử lý 60 phút ở 60oC và 80oC, nattokinase vẫn còn giữ được 100% hoạt độ (kết quả không trình bày ở đây); sau khi xử lý 90 phút ở 95oC, hoạt độ của enzyme này còn lại là 75% (hình 1). Như vậy, nattokinase do chủng NC2 sinh tổng hợp có độ bền nhiệt khá tốt so với nattokinase sinh ra bởi một số chủng Bacillus khác như trong nghiên cứu của Nguyen Thi Thao et al. (2013) [5] và của Wang et. al. (2009) [6]. Cụ thể, nattokinase trong nghiên cứu của Nguyen Thi Thao et al. (2013) còn hơn 85% hoạt độ ban đầu sau khi xử lý ở 50oC trong 60 phút. Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ của enzyme Do nattokinase thuộc serine protease nên enzyme sinh tổng hợp từ chủng NC2 được chỉnh về các pH khác nhau (7 đến 13) và sau đó các mẫu này được xác định hoạt độ nattokinase. Kết quả cho thấy hoạt độ của chủng NC2 cao nhất ở pH 9 (hình 2). Kết quả này tương tự với các kết quả trong nghiên cứu của Fujita et al. (1995) [2]. Hình 3. Ảnh hưởng của một số ion kim loại đến hoạt độ nattokinase của chủng NC2 Ảnh hưởng của một số ion kim loại Dịch nuôi cấy sau khi ly tâm được trộn với các dung dịch kim loại khác nhau (K+, Na+, Ni2+, Co, Fe3+, Mn2+, Ca2+, Zn2+, Ag+, Fe2+, Cu 2+, Mg2+) sao cho các kim loại này có nồng độ cuối cùng là 0,01; 0,005 và 0,001 M. Sau đó các dịch này được sử dụng để xác định hoạt tính nattokinase. Kết quả (hình 3) cho thấy, ion K+, Na+ hầu như không ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme. Ion Ni2+, Co2+, Mn2+, Ca2+, Zn2+, Ag+, Fe2+, Cu 2+ ở nồng độ 0,005 M và 0,01 M đều ức chế hoạt tính enzyme trong đó Cu 2+ ở cả 3 nồng độ ức chế hoàn toàn hoạt tính enzyme. Trong số các ion được sử dụng, duy nhất Mg2+ có tác dụng hoạt hóa enzyme mặc dù hoạt độ của enzyme chỉ tăng được khoảng 14%. Kết quả nàyhoàn toàn tương tự với các kết quả trong nghiên cứu của Nguyễn Thị Thảo và nnk. (2013) [5] cũng như trong nghiên cứu của Wang et al. (2009) [6]. Tinh sạch nattokinase từ dịch nuôi cấy chủng NC2 Dịch nuôi cấy NC2 sau ly tâm được kết tủa bằng aceton lạnh (tỷ lệ 1:4). Cặn thu được sau ly tâm được hòa tan lại trong đệm Tris-HCl 0,02 M, pH 8,5. Dung dịch này được tinh sạch qua cột Hitrap Q trong hệ thống AKTA theo các điều kiện được trình bày ở phần phương pháp. Kết quả tinh sạch (hình 4A) cho thấy có 2 đỉnh protein: đỉnh 1 được thôi ra trong thời gian rửa cột, đỉnh 2 được thôi ra trong thời gian đẩy bằng NaCl 0,6 M. Hình 4. Kết quả sắc ký dịch nuôi cấy chủng NC2 qua cột HiTrap Q A. Sắc ký đồ; B. Hoạt tính nattokinase của mẫu trước (LC) và sau sắc ký (Đ1, Đ2); C. Phổ điện di trên gel có cơ chất các mẫu trước (Lên cột) và sau (Đỉnh 1, Đỉnh 2) sắc ký Các phân đoạn trong đỉnh 1 và đỉnh 2 được dồn chung để xác định hoạt tính nattokinase (hình 4B). Kết quả cho thấy hoạt tính nattokinase chỉ có ở đỉnh 2. Như vậy, với cột HiTrap Q, chỉ một lượng nhỏ protein được loại bỏ. Để có thêm thông tin về protease ở các đỉnh thu được, chúng tôi đã tiến hành điện di các đỉnh đó trên gel có cơ chất casein (hình 4C). Kết quả điện di đồ khẳng định đỉnh 1 không có hoạt tính enzyme, còn đỉnh 2 có ít nhất 6 băng protease khác nhau, tuy nhiên băng nào có hoạt tính nattokinase cần được nghiên cứu thêm. Trong nghiên cứu của Dubey et al., (2011) [7], nattokinase thô của Bacillus subtilis có 2 băng protein khi điện di trên SDS-PAGE. KẾT LUẬN Nattokinase sinh tổng hợp từ chủng vi khuẩn phân lập từ nem chua khá bền với nhiệt: sau 90 phút xử lý ở 95oC, hoạt độ của enzyme này còn lại là 75%. Hoạt độ của nattokinase này mạnh nhất ở pH 9. Ion K+, Na+ hầu như không ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme; ion Ni2+, Co2+, Mn2+, Ca2+, Zn2+, Ag+, Fe2+, Cu 2+ ở nồng độ 0,005 M và 0,01 M đều ức chế hoạt tính enzyme trong đó Cu 2+ ở cả 3 nồng độ ức chế hoàn toàn hoạt tính enzyme; Mg2+ có tác dụng hoạt hóa enzyme (hoạt độ tăng khoảng 14%). Nattokinase sinh tổng hợp từ chủng vi khuẩn phân lập từ nem chua được sơ bộ tinh sạch qua cột Hitrap Q và thu được 2 đỉnh protein; trong đó đỉnh 2 có hoạt tính nattokinase. Đỉnh 2 khi điện di trên gel có cơ chất casein có ít nhất 6 băng protease khác nhau. Lời cảm ơn: Công trình được hoàn thành với sự hỗ trợ kinh phí từ nhiệm vụ Đánh giá tiềm năng di truyền một số nguồn gene vi khuẩn và xạ khuẩn của Việt Nam, mã số VNQG-2011/25. TÀI LIỆU THAM KHẢO Castellino F. J., Sodetz J. M., Brockway W. J., Siefring G. E., 1976. Streptokinase. Methods Enzymol., 45: 244- 257. Fujita M., Hong K., Ito Y., Fujii R., Kariya K. and Nishimuro S., 1995. Thrombolytic effect of nattokinase on a chemically induced thrombosis model in rat. Biol. Pharm. Bull, 18: 1387-1391. Hernandez L., Rodriguez P., Castro A., Serrano R., Rubiera R., 1990. Determination of streptokinase activity by quantitative assay. Biotechnol., Apl 7: 153-160. Meruvu H., Vangalapati M., 2011. Nattokinase: A Review on Fibrinolytic Enzyme. International Journal of Chemical Environmental and Pharmaceutical Research, 2(1): 61-66. Thao Thi Nguyen, Thi Dinh Quyen, HoangThanh Le, 2013. Cloning and enhancing production of a detergent and organic solvent-resistant nattokinase from Bacillus subtilis VTCC-DVN-12-01 by using an eight-protease-gene-deficient Bacillus subtilis WB800. Microbial Cell Factories, 12: 79. Wang C., Du M., Zheng D., Kong F., Zu G.,  Feng Y., 2009. Purification and characterization of nattokinase from Bacillus subtilis Natto B-12. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 9722-9729. Dubey R., Kumar J., Agrawala D., Char T., Pusp P., 2011. Isolation, production, purification, assay and characterization of fibrinolytic enzymes (Nattokina se, Streptokinase and Urokinase) from bacterial sources. African Journal of Biotechnology, 10(8): 1408-1420. A PRIMARY STUDY ON NATTOKINASE OF BACTERIUM Bacillus sp. ISOLATED FROM NEM CHUA Nguyen Quynh Uyen, Hoang Thu Ha, Nguyen Hong Nhung, Phan Thi Ha, Nguyen Huynh Minh Quyen Institute of Microbiology and Biotechnology, Vietnam National University, Hanoi SUMMARY Nattokinase has been attracted many interest of scientists as this enzyme prevents blood clots in human. Nattokinase, a serine protease, has an ability to degrade blood clots. Many drugs have been used to treat the diseases, caused by blood clots. Among these drugs, nattokinase has been shown as the potential one as its ability for degrading blood clots is 4 times more than that of plasmin. In our study, nattokinase of a bacterium isolated from „nem chua“ was primarily purified by using Hitrap Q column. In addition, the effects of pH, temperature and of some metal ions were also studied here. The enzyme was quite thermostable: after treating at 95oC in 90 minutes the enzyme activity remained 75%. At pH 9 the enzyme activity was maximal. The effects of some metal ions on enzyme activity, in particular, were: the enzyme activity was not affected by ion K+, Na+ in general; the activity was partly inhibited by ion Ni2+, Co2+, Mn2+, Ca2+, Zn2+, Ag+, Fe2+, Cu 2+ (at the concentration of 0.005 M and 0.01 M, except ion Cu 2+ as the activity was completely inhibited by this ion at the concentration of 0.01 M; 0.005 M and 0.001 M); the enzyme activity was activated by ion Mg2+ (the activity was increased around 14%). Nattokinase of a bacterium isolated from „nem chua“ was primarily purified by using Hitrap Q column and 2 protein peaks were obtained; among these peaks, the second pick was with nattokinase activity. After performing electrophoresis of the second peak on the gel with casein at least 6 different protease bands were observed. Keywords: Blood clots, enzyme activity, nattokinase, serine protease. Ngày nhận bài: 22-10-2014 CÔNG TY TNHH CÔNG NGHỆ SINH HỌC DƯỢC NANOGEN Công ty TNHH Công nghệ sinh học dược Nanogen được thành lập từ năm 2001 dưới sự lãnh đạo của tiến sĩ Hồ Nhân. Nhà máy Nanogen đạt chứng nhận WHO-GMP, tọa lạc tại Lô I-5C Khu Công nghệ cao, Quận 9, thành phố Hồ Chí Minh. Nanogen là công ty tiên phong tại Việt Nam và khu vực châu Á Thái Bình Dương trong lĩnh vực nghiên cứu và phát triển dược phẩm bằng công nghệ protein tái tổ hợp. Nanogen chủ yếu nghiên cứu về các loại thuốc điều trị về các bệnh mãn tính hiểm nghèo như viêm gan B, C, ung thư, tim mạch, tiểu đường, viêm khớp Các sản phẩm của Nanogen được sản xuất và đóng gói theo dây chuyền hoàn toàn tự động và nghiêm ngặt theo tiêu chuẩn GMP. Ngoài ra, Nanogen cũng đang nghiên cứu về các thuốc điều trị ung thư và dự kiến sẽ đưa ra thị trường trong thời gian gần nhất. Sản phẩm của Nanogen tuân thủ các quy định nghiêm ngặt của thử nghiệm lâm sàng, vì vậy, Nanogen tự hào là công ty đầu tiên thực hiện thử thuốc trên lâm sàng ở trong nước và góp phần xây dựng những hướng dẫn về thử nghiệm lâm sàng dành cho các thuốc tương đương sinh học (biosimilars) tại Việt Nam. Nhà máy sàn xuất và nghiên cứu được đặt trong khuôn viên có diện tích 15.000 m2, nơi đây có hơn 200 nhân viên được đào tạo chuyên nghiệp cùng với các nhà khoa học đầy kinh nghiệm. Nanogen đầu tư cho thử nghiệm và hội thảo lên đến hơn 50 triệu USD và liên tục hợp tác với gần 50 chuyên gia và trung tâm nghiên cứu trên toàn thế giới. Với năng suất 10 triệu sản phẩm/năm, Nanogen hoàn toàn có khả năng cung ứng sản phẩm có chất lượng cao với giá cả phù hợp với thị trường Việt Nam, châu Á, châu Phi, Nam Mỹ... Mục tiêu của Nanogen là không ngừng cải tiến quy trình sản xuất và phát triển các hoạt động nghiên cứu, nhằm tăng cường chất lượng sản phẩm cũng như tạo ra các loại dược phẩm sinh học tiên tiến. Nanogen luôn khẳng định vị trí dẫn đầu trong vai trò là nhà cung cấp các thuốc sinh học chất lượng cao với giá cả phải chăng.