Bước đầu chuyển gen Bt vào cây mía (Saccharum officinarum L.) - Phan Tường Lộc

TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 170-179 170 BƯỚC ĐẦU CHUYỂN GEN Bt VÀO CÂY MÍA (Saccharum officinarum L.) Phan Tường Lộc*, Hoàng Văn Dương, Mai Trường, Lê Tấn Đức, Trần Thị Ngọc Hà, Văn Đắc Thành, Phạm Đức Trí, Nguyễn Thị Thanh, Nguyễn Hữu Hổ Viện Sinh học Nhiệt đới, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, (*)locphan@itb.ac.vn TÓM TẮT: Nhóm sâu đục thân là một trong những loài sâu hại làm giảm năng suất đáng kể cho mía. Việc phun thuốc bảo vệ mía gặp một số trở ngại do mật độ mía ở ruộng rất dày, lá mía sắc và sâu đục thân lại sống bên trong thân mía. Chuyển gen kháng sâu (Bt- tổng hợp) cry1Ab và cry1B-cry1Ab (gen lai) vào hai giống mía VN 84 4137 và Suphanbury 7 nhằm mong muốn tạo ra các giống mía có khả năng kháng sâu hiệu quả, chủ yếu là sâu đục thân. Hai dòng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens đã được biến nạp các plasmid mang gen cry1Ab và gen cry1B-cry1Ab dùng để chuyển gen vào thực vật. Khảo sát các điều kiện nuôi cấy mô mía cho thấy, khi nuôi cấy tạo mô sẹo từ mảnh lá non ở lõi ngọn mía ex vitro, tỉ lệ tạo mô sẹo cao nhất của giống VN84 4137 trên môi trường có 2,4-D ở nồng độ 3 mg/l là 93,33%, trong khi của giống Suphanbury 7 ở nồng độ 2 mg/l là 96,67%. Tỉ lệ mô sẹo tái sinh chồi cao nhất trên môi trường có tổ hợp BAP 2 mg/l và NAA 1 mg/l là 100% ở cả hai giống. Bước đầu chuyển gen cry1Ab và cry1B- cry1Ab gián tiếp nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens vào mía đã thu được các khối mô sẹo có biểu hiện GUS và kháng chất chọn lọc phosphinothricin ở nồng độ 3 mg/l, là nồng độ gây chết khi khảo sát khả năng chống chịu phosphinothricin ở mô sẹo không chuyển gen. Từ khóa: Agrobacterium tumefaciens, Bt, chuyển gen, sâu đục thân cây mía. MỞ ĐẦU Hơn một thập niên qua, ngành mía đường Việt Nam vẫn luôn gặp khó khăn do nguồn nguyên liệu mía cung cấp không đủ để sản xuất. Với nhu cầu ngày càng tăng, và theo dự kiến của ngành, đến năm 2020 cả nước sẽ đạt mức tiêu thụ đường 2 triệu tấn/năm [25], việc bảo đảm sản lượng mía đáp ứng đủ và ổn định cho sản xuất là vấn đề cần thiết. Một trong những nguyên nhân làm giảm sản lượng mía là do sâu hại, trong đó, nhóm sâu đục thân thuộc bộ Cánh vảy (Lepidoptera) có thể gây thiệt hại có thể lên đến 30% [14, 24]. Ứng dụng chuyển gen Bt là một giải pháp tiềm năng để tạo ra được các giống mía có khả năng kháng các loại sâu đục thân [3, 9, 18, 21], mà tập tính sống của chúng thường gây khó khăn cho việc xử lý bằng hóa chất [14]. Độc tố kháng côn trùng từ Bacillus thuringiensis (Bt) là các độc tố crystal viết tắt là Cry do các gen cry mã hóa [20]. Độc tố Cry được phân loại dựa trên cơ sở đồng dạng của trình tự amino acid của tiền độc tố. Các protein tiền độc tố với ít hơn 45% sự đồng nhất trình tự sẽ có hệ số khác nhau trong dãy phân hạng đầu tiên (ví dụ Cry1, Cry2) và ở mức dưới 78% và 95% đồng dạng sẽ thiết lập ranh giới cho các dãy phân hạng thứ hai và thứ ba (ví dụ Cry1Ab) [12]. Tính đặc hiệu và hoạt tính của độc tố Cry là kết quả của sự tương tác và ly giải của tiền độc tố bên trong hệ thống tiêu hóa của từng loài côn trùng cụ thể [12]. Do biến nạp vào thực vật dùng các gen cry đơn, nguyên bản cho biểu hiện độc tố không cao trong giai đoạn ban đầu, nghiên cứu chuyển gen Bt đã có những cải tiến trong giai đoạn sau này. Các gen cry được tổng hợp có nhiều thay đổi trình tự so với nguyên bản, như giảm các thành phần A, T, tăng tỷ lệ C + G, để thích hợp biểu hiện cao ở thực vật [5, 9]; hoặc áp dụng mô hình hiệu quả quy tụ (pyramiding) để tạo hiệu quả kháng sâu cao khi lai các gen cry có tác động khác nhau lại và đồng chuyển vào thực vật [9]. Theo các công bố, gen cry1Ab có tính kháng chủ yếu với côn trùng thuộc bộ Lepidoptera [1, 2, 6, 12] và cry1B có tính kháng kép trên Lepidoptera và Coleoptera [5, 12]. Protein lai Cry1B-Cry1Ab có thể tạo hiệu ứng kháng hiệu quả hơn đối với Lepidoptera và cả Coleoptera [4]. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu Giống mía: Hai giống mía được dùng để chuyển gen là Suphanbury 7 (Thái Lan) và VN84 4137 (Việt Nam), được cung cấp bởi Phan Tuong Loc et al. 171 Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Mía Đường, xã Phú An, huyện Bến Cát, tỉnh Bình Dương. Chủng vi khuẩn: Chủng vi khuẩn E. coli mang plasmid pCAMBIA3301-cry1Ab và chủng E. coli DH5α. Chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens EHA 105 có mang sẵn helper plasmid chứa các gen vir và gen kháng kháng sinh rifampicin. Plasmid: Plasmid pCRY1B-1Ab, kích thước khoảng 17 kb, mang tổ hợp gen Pubi/cry1B- cry1Ab/Tnos (cry1B-cry1Ab: gen lai - tổng hợp) và gen chọn lọc P70S/bar/T35S trong T-DNA biểu hiện ở thực vật, và gen nptII kháng kanamycin biểu hiện ở vi khuẩn. Gen bar quy định tính kháng phosphinothricin (PPT) dùng để chọn lọc đối tượng chuyển gen (hình 1A). Plasmid pCAMBIA3301-cry1Ab, có kích thước 15,6 kb, từ plasmid pCAMBIA3301 được chèn thêm tổ hợp gene Pubi-1/cry1Ab/Tnos trong TDNA (Pubi : maize ubiquitin-1 (Ubi-1) promoter, Tnos: nopaline synthase (NOS) terminator, cry1Ab: gen tổng hợp) (hình 1B). Các gen cry1Ab, cry1B-cry1Ab có nguồn gốc từ Altosaar I. (Canada), chương trình trao đổi khoa học. A B Hình 1. Sơ đồ plasmid A. Plasmid pCRY1B-1Ab; B. Plasmid pCAMBIA3301-cry1Ab Môi trường Môi trường nuôi cấy vi khuẩn gồm môi trường LB (Luria-Bertani) dùng nuôi cấy và giữ giống E. coli và Agrobacterium tumefaciens; môi trường AB (Chilton) dùng để chuyển gen. Môi trường nuôi cấy thực vật gồm môi trường khoáng cơ bản MS, vitamin MS, vitamin B5, đường 30 g/l, pH 5,8; chất điều hòa sinh trưởng BAP, NAA. Phương pháp Biến nạp plasmid vào vi khuẩn E. coli bằng xung điện Biến nạp được thực hiện bằng xung điện trên máy BTX ECM 830 ở 2500 V, 40 uF, 5 ms, cuvette 2 mm. Vi khuẩn sau khi biến nạp được chọn lọc trên môi trường LB có bổ sung kanamycin 100 mg/l và được ly trích plasmid để kiểm tra đặc điểm, kích thước bằng enzyme cắt giới hạn HindIII [8, 15]. Biến nạp plasmid vào vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Biến nạp được thực hiện bằng phương pháp CaCl2 nhiệt. Vi khuẩn sau khi biến nạp được cấy chọn lọc trên môi trường có bổ sung rifampicin 100 mg/l và kanamycin 100 mg/l. Theo dõi kết quả sau 24-48 giờ [10, 11, 16]. Kiểm tra sự hiện diện của các gen cry1Ab và gen cry1B-cry1Ab bằng phương pháp PCR Đối với gen cry1Ab, trình tự mồi xuôi là (F): 5’-TTC CT T GGA CGA AAT CCC ACC- 3’ và mồi ngược là (R): 5’-GCC AGA ATT GAA CAC ATG AGC GC-3’ kích thước đoạn khuếch đại tương ứng 559 bp. Đối với gen cry1B-cry1Ab, trình tự mồi xuôi là (F): 5’-GAT AGC AGG ACC TAT CCA AT-3’ và mồi ngược là (R): 5’-GCC GAA GAG GGA GGC GTC AA-3’, kích thước đoạn khuếch đại tương ứng là 0,5 kb. Chương trình nhiệt phản ứng PCR: 94oC/4 phút (94oC/30 giây, 50-54oC/1 phút, 72oC/30-90 giây), 72oC/10 phút, với 35 chu kỳ. Hỗn hợp các thành phần của phản ứng PCR gồm có 5 l buffer PCR 5X, 0,5 l dNTP 10 mM, 0,25 l taq polymerase 5 U/l, 2 l mồi xuôi 1 M, 2 l mồi ngược 1 M, 1 l DNA plasmid, thêm nước cất đủ thể tích 25 l [7]. Khảo sát ảnh hưởng của 2,4-D lên quá trình tạo mô sẹo từ lá non Phần lõi lá non bên trong ngọn mía, thường ở tình trạng vô trùng, được cắt thành các khoanh dày 2 mm và tách các lớp lá để nuôi cấy trên môi trường tạo mô sẹo gồm thành phần khoáng MS, vitamin MS, casein 0,5 g/l và agar 10 g/l, có bổ sung 2,4-D ở các nồng độ khác nhau PUbi Tnos cry1Ab cry1B 5'UTR Ubi P70S bar T35S RB LB KaR PUbi Tnos cry1Ab P35S bar T35S LB RB KaR gus P35S Tnos TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 170-179 172 (0; 1; 2; 3; 4 mg/l) để đánh giá ảnh hưởng của 2,4-D lên quá trình tạo mô sẹo của mẫu [19]. Khảo sát ảnh hưởng của BAP và NAA lên quá trình tái sinh chồi từ mô sẹo Mô sẹo sau thời gian nuôi sẽ được cho tái sinh chồi trên môi trường có thành phần khoáng MS, vitamin B5, bổ sung tổ hợp chất điều hòa sinh trưởng BAP (1; 2 mg/l) NAA (0,2; 0,5; 1 mg/l) [23]. Khảo sát ảnh hưởng của chất chọn lọc PPT lên sự phát triển mô sẹo, cây con in vitro Nuôi cấy tạo mô sẹo và nuôi cấy cây con trên môi trường có bổ sung PPT ở các nồng độ khác nhau (0; 1; 2; 3; 4; 5 mg/l) vào môi trường, để đánh giá ảnh hưởng của PPT lên sự phát triển của mô sẹo và cây con [13]. Phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens và chọn lọc mô chuyển gen Vi khuẩn A. tumefaciens được nuôi cấy lắc qua đêm ở 28oC trong môi trường LB có bổ sung kháng sinh kanamycin 100 mg/l và rifampicin 50 mg/l, sau đó, được ly tâm lấy sinh khối ở 4000 g, trong 5 phút và chuyển sang nuôi mới trong môi trường AB ở các điều kiện như trên có bổ sung thêm acetocyringone 200 M trong 1 giờ. Mô sẹo được để khô bớt độ ẩm trong tủ cấy vô trùng khoảng 30 phút, rồi ngâm 10 phút trong dịch vi khuẩn ở điều kiện áp suất thường, sau đó đưa vào điệu kiện chân không - 50 kPa trong 3 phút rồi đưa trở lại môi trường áp suất thường 5 phút, trước khi được mang ra thấm khô và chuyển sang ủ chung với vi khuẩn trên môi trường tạo mô sẹo, khoảng 2-3 ngày. Mô sẹo sau đó được rửa sạch bằng dung dịch kháng sinh cefotaxime 500 mg/l để diệt khuẩn Agrobacterium tumefaciens, rồi chuyển sang chọn lọc mô chuyển gen trên môi trường tạo mô sẹo, có bổ sung cefotaxime ở nồng độ 500 mg/l và PPT ở nồng độ ngưỡng gây chết [17]. Khảo sát sự biểu hiện của gen chỉ thị gus bằng kỹ thuật hóa mô [13] KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Biến nạp tạo chủng vi khuẩn E. coli chứa vector plasmid pCRY1B-1Ab Để có thể lưu giữ và nhân bản, plasmid pCRY1B-1Ab được biến nạp vào dòng E. coli DH5 bằng phương pháp xung điện. Vi khuẩn sau khi chuyển gen được cấy trải để chọn lọc trên môi trường LB rắn có bổ sung kanamycin 100 mg/l. Sau 2 ngày, nhận được khoảng 70 khuẩn lạc mọc trên đĩa petri nuôi cấy, được giả định đã biến nạp plasmid pCRY1B-1Ab, trong khi ở đĩa đối chứng nuôi cấy vi khuẩn E. coli DH5 không biến nạp, không có khuẩn lạc nào xuất hiện. Các khuẩn lạc giả định biến nạp plasmid được chọn và nuôi cấy trong môi trường LB lỏng có bổ sung kanamycin 100 mg/l để tách plasmid và phân tích. Plasmid sau khi tách chiết, được cắt bằng enzyme giới hạn HindIII và điện di kiểm tra trên gel agarose, cho thấy có 1 băng DNA 17 kb phù hợp với kích thước plasmid pCRY1B-1Ab chứng tỏ các dòng E. coli DH5 đã được biến nạp plasmid pCRY1B-1Ab (hình 2). Hình 2. Kiểm tra plasmid cry1B-cry1Ab sau khi biến nạp vào dòng vi khuẩn E.coli DH5 L. Thang chuẩn DNA -HindIII; 1. Plasmid kiểm tra được cắt bằng enzyme HindIII có kích thước khoảng 17 kb. Biến nạp tạo dòng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens mang plasmid pCAMBIA3301- cry1Ab và dòngvi khuẩn A. tumefaciens mang plasmid pCRY1B-1Ab Hai dòng E. coli mang plasmid pCAMBIA3301-cry1Ab và pCRY1B-1Ab được nhân lên và tách plasmid. Biến nạp plasmid pCAMBIA3301-cry1Ab và pCRY1B-1Ab vào L 1 17 kb Phan Tuong Loc et al. 173 vi khuẩn Agrobacterium tumefacien EHA 105 được thực hiện bằng phương pháp xử lý nhiệt với CaCl2. Vi khuẩn sau khi biến nạp được cấy chọn lọc trên môi trường LB rắn có bổ sung kanamycin 100 mg/l và rifampicin 100 mg/l (hệ thống binary vector) ở 28oC. Sau 2 ngày, trên các đĩa nuôi cấy xuất hiện khoảng 20 khuẩn lạc Agrobacterium tumefaciens EHA 105 giả định đã biến nạp plasmid. Tách khuẩn lạc và kiểm tra sự có mặt của các gen cry1Ab và cry1B-cry1Ab trong cấu trúc bằng phương pháp PCR với các mồi đặc hiệu. Kết quả biểu hiện trên gel agarose với marker 1 kb cho thấy, ở dòng A. tumefaciens biến nạp plasmid pCAMBIA-Cry1Ab và dòng A. tumefaciens biến nạp plasmid pCRY1B-1Ab, sản phẩm PCR từ các plasmid được tách đều có băng khuếch đại của gen cry1Ab giống với đối chứng dương (được khuếch đại từ pCAMBIA3301-cry1Ab của E. coli), phù hợp với trình tự mục tiêu là 559 bp (hình 3). Trong khi đó ở dòng A. tumefaciens biến nạp pCRY1B-1Ab còn có thêm băng khuếch đại trình tự đặc hiệu của đoạn DNA cry1B-cry1Ab giống với đối chứng dương (được khuếch đại từ pCRY1B-1Ab của E. coli) phù hợp với trình tự mục tiêu là khoảng 0,5 kb (hình 4). Hình 3. Kết quả kiểm tra bằng PCR sự hiện diện gen cry1Ab trên các plasmid của vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. L. Thang chuẩn DNA 1 kb; PC. Băng DNA 559 bp được khuếch đại từ vi khuẩn E. coli mang pCAMBIA3301-cry1Ab; 1. Băng DNA 559 bp được khuếch đại từ vi khuẩn A. tumefaciens biến nạp pCAMBIA3301-cry1Ab; 2. Băng DNA 559 bp được khuếch đại từ vi khuẩn A. tumefaciens biến nạp pCRY1B1Ab. Hình 4. Kết quả kiểm tra bằng PCR sự hiện diện của gen cry1B-cry1Ab trên plasmid của vi khuẩn A. tumefaciens bằng PCR. L. Thang chuẩn DNA 1 kb; PC. Băng DNA 0,5 Kb được khuếch đại từ vi khuẩn E. coli mang pCRY1B- Ab; 1. Băng DNA 0,5 Kb được khuếch đại từ vi khuẩn A. tumefaciens biến nạp pCRY1B-1Ab. Như vậy, dòng vi khuẩn A. tumefaciens EHA 105 biến nạp plasmid pCAMBIA3301-cry1Ab và dòng vi khuẩn A. tumefaciens EHA 105 biến nạp plasmid pCRY1B-1Ab đã được thực hiện thành công và có thể dùng để chuyển gen vào thực vật. Khảo sát ảnh hưởng của 2,4-D lên quá trình tạo mô sẹo của mô lá Mô lá non mía được nuôi cấy trên môi trường tạo mô sẹo có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng 2,4-D ở các nồng độ khác nhau. Mô sẹo bắt đầu hình thành sau 12 ngày ở các mép mô. Mô sẹo của giống Suphanbury 7 mềm và ướt hơn ở giai đoạn đầu, màu sắc khối mô vàng nhạt hơn so với giống VN84 4137 (hình 5). Sau 28 ngày, tỉ lệ mô sẹo hình thành khác biệt rõ rệt nhất giữa các công thức. Công thức với nồng độ 2,4-D 3 mg/l cho tỉ lệ mẫu tạo mô sẹo cao nhất ở giống VN84 4137 và 2,4-D 2 mg/l ở giống Suphanbury 7 (bảng 1). Tiếp tục nuôi cấy khoảng 1,5 tháng, mô sẹo phát triển thành các khối mô chắc, có bề mặt căng láng (hình 6). 500 bp L PC H2O 1 559 bp L PC H2O 1 2 TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 170-179 174 Bảng 1. Kết quả tạo mô sẹo của giống VN84 4137 và giống Suphanbury 7 trên môi trường MS có bổ sung nồng độ 2,4-D khác nhau Công thức thí nghiệm 2,4-D (mg/l) Tỷ lệ mẫu hình thành mô sẹo ở giống VN84 4137 (%) Tỷ lệ mẫu hình thành mô sẹo ở giống Suphanbury 7 (%) 1 0 0 a 0 a 2 1 40 b 76,66 bd 3 2 76,67 c 96,67 c 4 3 93,33 d 80 bd 5 4 63,33 e 66,67 bde Các giá trị trung bình không theo cùng nhóm có mẫu chữ giống nhau có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức p = 0,01 dựa theo kiểm định thống kê LSD. Giống VN84 4137 Giống Suphanbury 7 Hình 6. Mô sẹo phát triển hình thành các khối tế bào có khả năng tái sinh Hình 5. Khối mô sẹo phát sinh từ mô lá non mía sau khoảng 20 ngày nuôi cấy Các khối mô này được mang đi tái sinh trên môi trường MS có bổ sung các tổ hợp chất điều hòa sinh trưởng BAP và NAA khác nhau. Sau 1 tuần, chồi có dấu hiệu hình thành. Số liệu được lấy ở các công thức đạt tỷ lệ tạo chồi tuyệt đối sau 21 ngày. Kết quả kiểm tra ở ngày 21 cho thấy, ở công thức gồm tổ hợp NAA 1 mg/l và BAP 2 mg/l có 100% mẫu tạo chồi ở cả hai giống mía, số lượng chồi trên mẫu nhiều, chồi có hình dạng bình thường. Các công thức khác cũng hình thành chồi nhưng chậm hơn, số lượng ít hơn và các chồi có hình dạng không đồng đều trên cùng khối mô hoặc dị dạng (bảng 2, hình 7). Bảng 2. Kết quả tái sinh chồi của giống mía VN84 4137 và giống Suphanbury 7 trên môi trường MS có bổ sung các tổ hợp chất điều hòa sinh trưởng BAP và NAA khác nhau Công thức TN BAP (mg/l) NAA (mg/l) Tỷ lệ mô sẹo hình thành chồi trên một nghiệm thức ở giống VN84 4137 (%) Tỷ lệ mô sẹo hình thành chồi trên một nghiệm thức ở giống Suphanbury 7 (%) 1 0 0 13,33 a 0 a 2 1 0,2 80,00 cd 60,00 c 3 1 0,5 86,67 de 73,33 cd 4 1 1 53,33 b 40,00 b 5 2 0,2 80,00 cd 80,00 d 6 2 0,5 66,67 bc 86,67 de 7 2 1 100 e 100 e Các giá trị trung bình không theo cùng nhóm có mẫu chữ giống nhau có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức p = 0,01 dựa theo kiểm định thống kê Duncan. Phan Tuong Loc et al. 175 VN84 4137 Suphanbury 7 Hình 7. Chồi giống VN84 4137 và Suphanbury 7 hình thành từ mô sẹo trên môi trường có các tổ hợp chất điều hòa sinh trưởng BAP 2 mg/l và NAA 1 mg/l Nghiên cứu ảnh hưởng của PPT lên khả năng phát triển mô sẹo, cây con in vitro Mô sẹo sau một tháng nuôi cấy của cả hai giống mía VN84 4137 và Suphanbury 7 được chuyển sang môi trường có bổ sung PPT ở các nồng khác nhau. Từ nồng độ 1 mg/l các khối mô sẹo bắt đầu chuyển sang màu vàng đậm hơn do tích tụ ammonia sau 2 tuần. Ở nồng độ 3 mg/l tất cả các mô sẹo hóa nâu đen và chết ở cả hai giống mía sau một tháng, trong khi ở các nồng độ cao hơn thời gian chết trong khoảng 1- 2 tuần (hình 8). Các cây mía con in vitro của cả hai giống mía VN84 4137 và Suphanbury 7 được nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung PPT ở các nồng độ khác nhau như trên. Sau 10 ngày, ở nồng độ PPT từ 3 mg/l, các cây con đều vàng lá và chết dần (hình 9). VN84 4137 Suphanbury 7 Hình 8. Ảnh hưởng của PPT ở nồng độ 3 mg/l gây chết mô sẹo PPT 2 mg/l PPT 3 mg/l Hình 9. Ảnh hưởng của PPT ở các nồng độ khác nhau đối với sự phát triển của cây mía con VN84 4137 in vitro TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 170-179 176 Bước đầu chuyển gen mô sẹo mía thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Mô sẹo mía sau 1 tháng nuôi cấy trên môi trường có 2,4-D ở 3 mg/l cho giống VN84 4137 và 2 mg/l cho giống Suphanbury 7 có hình thái đồng nhất sẽ được xử lý chuyển gen với hai dòng vi khuẩn A.tumefaciens mang plamid pCAMBIA3301-cry1Ab và pCRY1B-1Ab. Các mô sẹo được tiếp tục nuôi cấy chọn lọc trên môi trường tạo mô sẹo có bổ sung PPT 3 mg/l. Sau 2 tuần chuyển gen, nhuộm sơ bộ một số cụm mô chuyển gen với plasmid pCAMBIA3301- cry1Ab trong dung dịch X-Gluc thu được các mô có màu xanh dương đậm đặc trưng, có thể giả định các mô này đã được chuyển gen và có biểu hiện GUS (hình 10). Sau 4 tuần hầu hết các mô sẹo nâu hóa và chết, một số cụm mô nhỏ có khả năng sống trên PPT ở nồng độ 3 mg/l tiếp tục phát triển mô mới. Số lượng mô kháng được PPT 3 mg/l khoảng từ 2-4% mẫu chuyển gen (bảng 3, hình 11). VN84 4137 Suphanbury 7 Hình 10. Mô sẹo chuyển gen plasmid pCAMBIA3301-cry1Ab biểu hiện gen gus khi nhuộm trong dung dịch X-Gluc Giống VN84 4137 pCAMBIA3301-cry1Ab Giống Suphanbury 7 pCAMBIA3301-cry1Ab Giống Suphanbury 7 pCRY1B-1Ab Giống VN84 4137 pCRY1B-1Ab Hình 11. Mô sẹo chuyển gen được chọn lọc trên môi trường tạo mô sẹo Phan Tuong Loc et al. 177 Bảng 3. Tỷ lệ mô sẹo phát triển trên môi trường chọn lọc PPT 3 mg/l sau 4 tuần chuyển gen pCAMBIA3301-cry1Ab pCRY1B-1Ab Giống VN84 4137 2% 3% Giống Suphanbury 7 4% 3% Thảo luận Suphanbury 7 và VN84 4137 là hai giống mía có năng suất và hàm lượng đường cao, CCS trên 11% đang được trồng nhiều trong các vùng nguyên liệu mía. Việc có thể thích hợp nuôi cấy in vitro, làm cơ sở cho các ứng dụng công nghệ sinh học đối với hai giống mía này, mang ý nghĩa thực tiễn cao. Mô lá non tạo mô sẹo 93,33-96,67% trên môi trường có bổ sung 2,4-D ở nồng độ 2-3 mg/l tương tự với nghiên cứu của một số tác giả trước đây [2, 19, 23], các mẫu mô sẹo tái sinh chồi đạt tỉ lệ 100% trên môi trường có bổ sung BAP 2 mg/l và NAA 1 mg/l là các điều kiện thuận lợi để ứng dụng chuyển gen. Mô sẹo và cây mía con khá nhạy cảm với PPT, là một chất chọn lọc mạnh, bị ức chế sinh trưởng và chết ở nồng độ 3 mg/l, Điều này giúp khả năng chọn lọc cây thuần cao, tuy nhiên, sẽ khó nhân mô và tái sinh cây trong quá trình chọn lọc. Các dòng Agrobacterium tumefaciens sau khi được biến nạp plasmid pCAMBIA3301- cry1Ab và pCRY1B-1Ab được dùng để chuyển gen vào hai giống mía. Kết quả bước đầu nhận được các mô sẹo biểu hiện GUS ở hai giống mía chuyển gen với plasmid pCAMBIA3301- cry1Ab và các mô sẹo chuyển gen từ cả hai plasmid pCAMBIA3301-cry1Ab và pCRY1B- 1Ab có khả năng chống chịu và tiếp tục phát triển trên môi trường có bổ sung PPT 3 mg/l, điều này cho thấy, biến nạp gen từ Agrobacterium vào mô sẹo mía đã được thực hiện. Các mô sẹo chuyển gen sẽ được tiếp tục chọn lọc và cho tái sinh thành cây hoàn chỉnh. KẾT LUẬN Tạo được hai chủng Agrobacterium tumefaciens dùng để chuyển gen mía, gồm chủng chứa plasmid pCRY1B-1Ab và chủng chứa plasmid pCAMBIA3301-cry1Ab. Xác định được nồng độ 2,4-D thích hợp cảm ứng tạo mô sẹo ở giống mía VN84 4137 là 3 mg/l, Suphanbury 7 là 2 mg/l. Tổ hợp chất điều hòa sinh trưởng cho tỉ lệ tái sinh chồi 100% từ mô sẹo ở hai giống mía VN84 4137 và Suphanbury 7 cao nhất là BAP 2 mg/l, NAA 1 mg/l. Xác định được nồng độ PPT gây chết mô sẹo và cây con có thể dùng làm nồng độ bắt đầu chọn lọc các đối tượng chuyển gen trong điều kiện in vitro là 3 mg/l. Bước đầu thu được 2-4% mô sẹo chuyển gen giả định có biểu hiện gen gus và phát triển tốt trên môi trường chọn lọc với PPT 3 mg/l. Các mô chuyển gen giả định sẽ được tiếp tục chọn lọc trên môi trường có bổ sung PPT ở nồng độ cao hơn (5 mg/l) để chọn lọc mô và tái sinh cây thuần. Cây chuyển gen sẽ được phân tích bằng các kỹ thuật sinh học phân tử để xác định đặc điểm di truyền và biểu hiện gen. Lời cảm ơn: Các tác giả xin chân thành cảm ơn Bộ Khoa học và Công nghệ, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã hỗ trợ về kinh phí cho công trình này. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Arvinth S., Selvakesavan R. K., Subramonian N., Premachandran M. N., 2009. Transmission and expression of transgenes in progeny of sugarcane clones with cry1Ab and aprotinin genes, Sug Tech, 11(3): 290-295. 2. Arvinth S., Arun S., Selvakesavan R. K., Srikanth J., Mukunthan N., Ananda Kumar P., Premachandran M. N., Subramonian N., 2010. Genetic transformation and pyramiding of aprotinin-expressing sugarcane with cry1Ab for shoot borer (Chilo infuscatellus) resistance, Plant Cell Rep., 29: 383-395. 3. Arencibia A. D., Vaquez R. I., Prieto D., Tellez P., Carmona E. R., Coego A., Hernandez L., de La Riva G. A., Housein G. TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 170-179 178 S., 1997. Transgenic sugarcane plants resistant to stem borer attack. Mol. Breed, 3: 247-255. 4. Bano-Maqbool S., Riazuddin S., Loc N. T., Gatehouse A. M. R., Gatehouse J. A., Christou P., 2001. Expression of multiple insecticidal genes confers broad resistance against a range of different rice pests. Mol. Breed, 7: 85-93. 5. Bohorova N., Frutos R., Royer M., Estanol P., Pacheco M., Rascon Q., Mclean S., Hoisington D., 2001. Novel synthetic Bacillus thuringiensis cry1B gene and the cry1B-cry1Ab translational fusion confer resistance to southwestern corn borer, sugarcane borer and fall armyworm in transgenic tropical maize. Theor. Appl. Genet., 103: 817-826. 6. Braga D. P. V., Arrigoni E. D. P., Silvia- Filho M. C., Ulian E. C., 2003. Expression of the Cry1Ab protein in genetically modified sugarcane for the control of Diatraea saccharalis (Lepidoptera: Crambidae). J. New Seeds, 5: 209-222. 7. Casali N., Preston A., 2003. Methods in molecular Biology. E.coli plasmid vector. Methods and applications, Humana Press, 235: 316. 8. Chassy B.M. and Flickinger J.L., 1987. Transformation of Lacobacillus casei by electroporation. FEMS Microbiol Lett, 44: 173-177. 9. Christou P., Capell T., Kohli A., Gatehouse J. A., Gatehouse A. M. R., 2006. Recent developments and future prospects in insect pest control in transgenic crops. TRENDS in Plant Science, 11(6): 302-308. 10. Cohen S. N., Chang A. C. Y., Hsu L., 1972. Nonchromosomal antibiotic resistance in bacteria: genetic transformation of Escherichia coli by R-factor DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69: 2110-2114. 11. Dagert M., Erlich S. D., 1979. Prolonged incubation in calcium chloride improves the competence of Escherichia coli cells. Gene, 6: 23-28. 12. de Maagd R. A., Bravo A., Crickmore N., 2001. How Bacillus thuringiensis has evolved specific toxins to colonize the insect world. TRENDS in Genetics, 17(4): 193-199. 13. Enriquez-Obregon G. A., 1998. Herbicide- resistant sugarcane (Saccharum offcinarum L.) plants by Agrobacterium-mediated transformation. Planta, 206: 20-27. 14. Fauconnier R., 1993. Sugar cane, Macmillan Press Ltd, London, UK. 15. Fiedler S., Wirth R., 1988. Transformation of bacteria with plasmid DNA by electroporation. Anal. Biochem., 170: 38- 44. 16. Hanahan D., 1983. Studies on the transformation of Escherichia coli with plasmids. J. Mol. Biol., 166: 557-580. 17. Joyce P., Kuwahata M., Turner N., Lakshmanan P., 2010. Selection system and co-cultivation medium are important determinants of Agrobacterium-mediated transformation of sugarcane. Plant Cell Rep., 29: 173-183. 18. Kim S., Kim C., Li W., Kim T., Li Y., Zaidi M. A., Altosaar I., 2008. Inheritance and field performance of transgenic Korean Bt rice lines resistant to rice yellow stem borer. Euphytica, 164: 829-839. 19. Rashid H., Khan S. A., Zia M., Chaudhary M. F., Hanif Z., Chaudary Z., 2009. Callus induction and regeneration in elite sugarcane cultivar hsf-240. Pak. J. Bot., 41(4): 1645-1649. 20. Schnepf H. E., Crickmore N., Van Rie N., Dereclus J., Baum J., Feitelson J., Zeigler D.R., Dean D. H., 1998. Bacillus thuringiensis and its pesticidal crystal proteins. Microbiol. Mol. Biol. Rev., 62: 775-806. 21. Valderrama A. M., Velasquez N., Rodriguez E., Zapata A., Zaidi M. A., Altosaar I., Arango R., 2007. Resistance to Tecia solanivora (Lepidoptera : Gelechiidae) in three transgenic Andean varieties of potato expressing Bacillus thuringiensis Cry1Ac protein. J. Econ. Entomol., 100: 172-179. Phan Tuong Loc et al. 179 22. Weng L. X., Deng H., Xu J. L., Wang L. H., Jiang Z., Zhang H. B., Li Q., Zhang L. H., 2006. Regeneration of sugarcane elite breeding lines and engineering of stem borer resistance. Pest Manage Sci., 62:178-187. 23. Xu L. P., Que Y. X., Xu J. S., Fang S. R., Zhang M. Q., Chen Y. Q., Chen R. K., 2008. Establishment of genetic transformation system and obtaining transgenic sugarcane (var. badila) transformed with RS gene. Sugar Tech, 10(2): 128-132. 24. 04/Phong-tru-sau-benh-hai-mia-2150229/. 25. Http: //www.thesaigontimes.vn/Home/ kinhdoanh/dautu/45285/10-nam-i-ach-1- trieu-tan-duong.html. PRELIMINARY TRANSFORMATION OF Saccharum officinarum L. WITH Bt GENE Phan Tuong Loc, Hoang Van Duong, Mai Truong, Le Tan Duc, Tran Thi Ngoc Ha, Van Dac Thanh, Pham Duc Tri, Nguyen Thi Thanh, Nguyen Huu Ho Institute of Tropcial Biology, VAST SUMMARY Borer is one of the major pests of sugarcane that can cause a loss of crop yield. Spraying pesticides for the control of borer faces obstacles because the pest lives inside sugarcane stem and sugarcanes with sharp leaves are planted at high density in fields. Transformation of two sugarcane varieties, VN 84 4137 and Suphabury 7, with synthetic Bt genes, cry1Ab and hybrid cry1B-cry1Ab, aims to provide effective resistance against pests, mainly borer. Two strains of Agrobacterium tumefaciens were transformed with plasmids containing cry1Ab gene or cry1B-cry1Ab gene for plant transformation. Sugarcanes were investigated in vitro conditions of cultivation, which indicated that the highest calli formation from the young leaf rolls was obtained on the medium with 3 mg/l 2,4-D for VN84 4137 at 93.33% and 2 mg/l 2,4-D for Suphanbury 7 at 96.67%. The highest number of calli forming shoots was achieved on the medium with the combination of 2 mg/l BAP and 1 mg/l NAA at 100% for two varieties. Preliminary Agrobacterium-mediated transformation of sugarcane was obtained with calli expressing GUS and/or resistant to phosphinothricin at 3 mg/l, which was the lethal threshold for wild-type callus and in vitro young plants. Keywords: Agrobacterium tumefaciens, Bt, sugarcane, gen-transformation. Ngày nhận bài: 21-6-2012