Biểu hiện gen HIV-1 p24 ở cây thuốc lá chuyển gen lục lạp

Science & Technology Development, Vol 15, No.T1 2012 Trang 52 BI<U HI
N GEN HIV-1 p24 CÂY THUC LÁ CHUY<N GEN L'C L P Phan Tư0ng L c, Nguyn HBu H,, Nguyn Th3 Thanh Vi n Sinh hc Nhi t ñi - Vi n Khoa hc và Công ngh Vi t Nam (Bài nh
n ngày 30 tháng 09 năm 2011, hoàn chnh sa cha ngày 09 tháng 02 năm 2012) TÓM T
T : Chuyn gen HIV-1 p24 vào lc lp ñã ñưc thc hin thành công * cây thu c lá V2 (Virginia TBE2). B ng các k- thu
t PCR và Southern blot, các gen chuyn ñưc chng minh ñã hòa nh
p vào ñúng v trí thit k trên lc lp, gia gen trnfM và trnG. Kt qu Western blot cho thy gen HIV-1 p24 biu hin * các dòng thu c lá chuyn gen. Hàm lưng protein p24 ñưc ghi nh
n qua phân tích ELISA cho thy tích lũy * mc cao nht là 6,3 % tng protein hòa tan (total soluble protein - TSP), * các lá gn ng n, và thp nht là 1,7% TSP. Protein ñưc tinh sch b ng phương pháp s,c ký l c gel phân t có ñ tinh sch là 9,694 ln, hiu sut tinh sch là 31,94%, tuy nhiên protein p24 mt hot tính nhiu sau khi tinh sch. T khóa: gen HIV-1 p24, cây thu c lá V2, lc lp . M Đ(U Cây thuc lá V2 ñưc chuy n gen HIV-1 p24 và gen aadA vào lc lp, ch%i ñưc tái sinh trên môi trưng có cht ñiu hòa sinh trư"ng BA 1 mg/l, NAA 0,1 mg/l và kháng sinh chn lc spectinomycin và streptomycin " n%ng ñ ban ñ$u tương ng là 80 mg/l và 125 mg/l. Các ch%i chuy n gen gi ñnh s+ ñưc tip tc chn lc " n%ng ñ cao hơn lên ti 500 mg/l. Có 4 dòng, ký hi u T1, T2, T5, T6 có kh năng kháng hai loi kháng sinh " n%ng ñ cao nht, phát tri n thành cây con và ra r#. Dòng T3 ch kháng ñưc spectinomycin " mc thp và cht " n%ng ñ 250 mg/l. Các dòng T1, T2, T5, T6 ñã ki m tra bng PCR cho thy có s hi n di n ca gen HIV-1 p24 [4], s+ ñưc tip tc phân tích bng các k thut sinh hc phân t và sinh hóa ñ xác ñnh di truyn các gen bin np, s bi u hi n protein p24 và tinh sch protein tái t& hp. V!T LI
U VÀ PHƯƠNG PHÁP V9t liu Cây thuc lá V2 (Virginia TBE2) ñã ñưc chuy n t& hp gen Prrn/HIV-1 p24/TrbcL và Prrn/aadA/TpsbA cu trúc trên vector pITB.HIV-1 p24 vào lc lp bng phương pháp bn gen. Các dòng chuy n gen nhn ñưc sau khi chn lc và ki m tra có s hi n di n ca gen HIV-1 p24 bng phương pháp PCR [4]. Sơ ñ? 1.Cu trúc vector pITB.HIV -1 p24 Pr rn Tr bc L Hi v- 1 p2 4 Tp sb A aa dA Pr rn trn G trn fM TAÏP CHÍ PHAÙT TRIEÅN KH&CN, TAÄP 15, SOÁ T1 2012 Trang 53 Cu trúc vector pITB.HIV-1 p24: + aadA: gen to tính kháng hai loi kháng sinh spectinomycin và streptomycin, dùng ñ chn lc ñi tưng chuy n gen. + HIV-1p24: gen bi u hi n protein HIV-1 p24. + Prrn: promoter operon rRNA lp th . + TrbcL, TpsbA: vùng không dch mã ñ$u 3’ t' gen rbcL, gen psbA lp th . + trnfM, trnG: vùng flank (v trí sưn bên) cha trình t các gen trnfM và trnG lc lp dùng ñ tái t& hp ñ%ng dng. Các dòng thuc lá chuy n gen và cây V2 hoang di ñưc nuôi cy in vitro và tr%ng ngoài vưn ươm ñ làm nguyên li u cho các thí nghi m. Các vt li u, hóa cht khác s dng ñưc trình bày c th theo các phương pháp phân tích. Phương pháp PCR DNA thuc lá, ñưc ly trích t' lá bng b kit tách DNA thc vt mini ca QIAGEN (Đc), dùng làm nguyên li u ñ ki m tra s hi n di n ca các gen bin np vào lc lp bng phương pháp PCR vi các m%i ñ c hi u (Bng 1). Bng 1. Các m%i ñ c hi u Gen Tên m%i Trình t các nucleotide (5’-3’) Kích thưc (bp) aadA aadAp1 aadAp2 AAC CTC CTA TAG ACT AGG C AGC GAA ATG TAG TGC TTA CG 250 HIV-1 p24 p24 for p24 rev ATGGCTAGCGGATCCCCTATT TCTAGAGGAATTCTACTCAGCTTTATGTC 700 Gen lc lp (trnG, trnfM) cpT1 cpT2 GGA TTT GGT ATA GTT GGC C CTT GTT TAT CTA TTA GTT TTC AGT 255 (" lc lp hoang di) Quy trình PCR khuch ñi ñon trình tC dư>i 1000 bp Thành ph$n vt li u: - Nưc ct vô trùng 13,8 µl - 5 X GoTaq flexi buffer 5 µl - MgCl2 (2,5M) 2 µl - M%i xuôi (10 pmol) 1 µl - M%i ngưc (10 pmol) 1 µl - dNTPs (10 mM) 1 µl - GoTaq Polymerase 0,2 µl - DNA template 1 µl - Th tích cui: 25 µl Chu kỳ luân nhi t: 30 chu kỳ theo các bưc sau: 95oC/2 phút [95oC/1 phút , 50-52oC/1 phút, 72oC/2 phút ] 72oC/5 phút. Quy trình PCR khuch ñi ñon trình tC ñ7c hiu trên 1000 bp Thành ph$n vt li u: - Nưc ct vô trùng 38 µl - 10 X buffer 5 µl - dNTPs (20 mM) 2 µl - AccuTaq 1 µl - DNA template 1 µl - M%i xuôi (10 pmol) 1 µl Science & Technology Development, Vol 15, No.T1 2012 Trang 54 - M%i ngưc (10 pmol) 1 µl - DMSO 1 µl - Th tích cui 50 µl Chu kỳ luân nhi t: 30 chu kỳ theo các bưc sau: 98oC/30 giây [94oC/30 giây, 50-60oC/30 giây, 68oC/4 phút ] 68oC/10 phút. Sn ph!m PCR ñưc bo qun " 4oC. Kt qu PCR ñưc ñi n di trên gel agarose 0,8%, dung dch ñ m TBE 1%, thang DNA chu!n 1 kb (Biolabs, Anh) [3,13]. Phương pháp Southern blot Dùng m0u dò ñ c hi u có ñánh du ñ phát hi n trình t DNA c$n ki m tra thông qua lai phân t. Phương pháp Southern blot không phóng x ñưc thc hi n da trên quy trình ca McCabe và cs (1997) [5]. DNA ñưc chit tách t' lá theo b kit DNeasy ca QIAGEN (Đc). M0u DNA thuc lá (5µg DNA t&ng) ñưc ct bng enzym gii hn BglII. Trên lc lp hoang di s+ có kích thưc ñon ct có th lai vi probe là 3,5 kb và trên lc lp chuy n gen là 5,8 kb. H8n hp DNA sau khi ct ñưc chy ñi n di trên gel agarose 0,8 % trong ñi n trưng 25 V qua ñêm (thang chu!n λ HindIII) và sau ñó ñưc chuy n lên màng lai Hybond (GE Healthcare). Sơ ñ? 2. Cu trúc gen bin np vào lc lp gi ñnh và các v trí ct bng enzyme ct gii hn (rps14, trmfM, trnG, ycf9, trnS, psaB, psaC: các gen lp th thuc lá) M0u dò (probe) ñ c hi u cho gen lc lp thuc lá psaB ñưc chu!n b theo phương pháp t&ng hp m0u dò ñánh du DIG bng PCR, vi hai m%i, m%i xuôi 5’-AAT TTC TGC CAA TAT CCA CGC C-3’ và m%i ngưc 5’-GTT GCC GGG TTG GTT AAA TGC-3’ vi kích thưc trình t probe là 543 bp. Quá trình lai ñưc thc hi n " 37oC trong 16 gi. Màng lai sau ñó ñưc mang ñi phát hi n bng phn ng quang hóa và ghi li trên phim X quang [5, 6, 8, 13]. Phương pháp Western blot Ly trích protein Đ ly trích protein t&ng s, 0,3 g lá ñưc nghin trong nitrogen l*ng ñn khi mn, sau ñó thêm vào 1 ml dung dch ly trích protein (50 mMN-2-hydroxyethylpiperazine-N′-2- ethanesulphonic acid (HEPES)/KOH pH 7,5, 1 mM disodium ethylenediaminetetraacetate, 10 mM potassium acetate, 5 mM magnesium acetate, 2 mM phenylmethylsulphonyl fluoride (PMSF), 30 mM 2-mercaptoethanol) ñưc gi " 4oC. Trn ñu h8n hp khong 10 phút trên .......... Tp sb A trn G Bglll Bglll Pr rn rp s1 4 trm fM Pr rn Tr bc L psaC HIV-1 P24 aada psaB trn S yc f9 TAÏP CHÍ PHAÙT TRIEÅN KH&CN, TAÄP 15, SOÁ T1 2012 Trang 55 ñá, sau ñó ly tâm 15 phút " 13000 vòng/p " 4oC, thu ly ph$n dch trong [6]. Dch ly trích protein ñưc chu!n ñ bng phương pháp Bradford. Thang n%ng ñ chu!n ñưc dng vi bovine serum albumin (BSA) " các n%ng ñ 1; 0,5; 0,25; 0,125; 0,0625 (mg/ml) tương quan vi các giá tr OD ño " bưc sóng 595 nm. Da vào ñ% th tính các n%ng ñ protein trong m0u thí nghi m theo các giá tr OD ño ñưc [10]. SDS – PAGE Protein ñưc phân tách bng ñi n di trên gel polyacrylamide da theo kích thưc sau khi ñưc bin tính v cu trúc bc 1 b"i thành ph$n SDS. Bn gel g%m có hai ph$n, ph$n trên là ph$n gel gom (stacking gel) có 4% acrylamide/bisacrylamide và ph$n dưi là ph$n gel phân tách (resolving gel) có 12% acrylamide/bisacrylamide (Bio-rad, M). Protein marker ñưc dùng là GE Rainbow RPN800E. Bn gel ñi n di protein ñưc nhum bng dung dch Coomassie Briliant Blue ñ quan sát các băng protein có trong dung dch [8, 10]. Western blot Bn gel sau khi chy ñi n di vi các băng protein ñưc phân tách (không nhum quan sát) s+ ñưc chuy n sang màng nitrocellulose bng thit b semi-dry blotter (Apelex) trong ñi n trưng 120 mA trong 30 phút. Màng ñưc  trong dung dch c ñnh (5% skimmed milk trong PBS) qua ñêm " nhi t ñ phòng, r%i tip tc  qua ñêm " 4oC trong dung dch kháng th ñơn dòng t' c'u kháng HIV-1 p24 pha loãng 1:500 trong dung dch c ñnh. Sau ñó màng ñưc ra trong dung dch PBS b& sung 0,1% Tween 20 và ñưc  tip vi kháng th ñơn dòng th hai t' dê kháng kháng th c'u kt hp vi horseradish peroxidase, ñưc pha loãng 1:1000 trong dung dch c ñnh [8]. Màng sau ñó ñưc cho phn ng quang hóa vi dung dch phát hi n. Kt qu ñưc ghi nhn trên phim âm bn Kodak. Protein HIV-1 p24 có kích thưc khong 26 kDa. Phương pháp ELISA Lá (100 mg) ñưc nghin mn trong 400 fl dung dch ñ m chit tách protein (2,5% bovine serum albumin (BSA), 0,1% Tween 20, 2 mM PMSF, 30 mM 2-mercaptoethanol). Đĩa Maxisorp 96 ging (Nunc/Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA) ñưc tráng qua ñêm " 4°C vi 50 fl kháng th ña dòng kháng HIV-1 p24 ca c'u (Aalto Bioreagents, Ireland) ñưc pha loãng " n%ng ñ 7,5 fg/ml trong dung dch ñ m sodium cacbonat/bicarbonate 100 mM, pH 9,6. Các ging ñưc ra ba l$n vi 200 fl dung dch ra (0,1% Tween 20/PBS) và sau ñó c ñnh vi 200 fl dung dch c ñnh (2,5% BSA/PBS) trong 2 gi " 37°C (ho c qua ñêm " 4°C). Đ& b* dung dch c ñnh và thay th bng 100 fl m0u ki m tra kháng nguyên HIV-1 p24 pha loãng 1: 200 vi dung dch c ñnh, các m0u này g%m dch chit xut protein ca các dòng thuc lá chuy n gen, cây V2 hoang di và dung dch kháng nguyên chu!n HIV-1 p24 ñưc pha loãng " các n%ng ñ 0, 10, 50, 100 (µg/ml). Sau khi  2 gi " 37°C, các ging ñưc ra bn l$n vi dung dch ra. Kháng th ñơn dòng kháng p24 biotin hóa ph thuc cu to (Aalto Science & Technology Development, Vol 15, No.T1 2012 Trang 56 Bioreagents, Ireland), ñưc pha loãng 1: 500 trong dung dch c ñnh, r%i cho vào các ging,  ñĩa " 37 ° C trong 1 gi. Sau khi ra bn l$n vi dung dch ra, thêm vào 100 fl phc cht streptavidin–alkaline phosphatase (Hoffmann- La Roche, Basel, Thy Sĩ), ñã ñưc pha loãng " 1: 1000 trong dung dch c ñnh vào các ging, ñĩa ñưc  trong 30 phút " 37°C. Các ging ñưc hút sch dch và ra sch bn l$n dung dch ra, r%i thêm vào 200 fl phosphate p-nitrophenyl " n%ng ñ 1,0 mg/ml (SIGMA FAST, dng viên, Sigma, M). Đĩa ñưc  " nhi t ñ phòng trong 10 phút, và sau ñó thêm 100 fl NaOH 1 M ñ d'ng phn ng màu. Đc kt qu dưi máy quang ph& " bưc sóng 405 nm (MWG, Ebersberg, Đc) [6]. Phương pháp tinh sch protein b:ng sDc ký lEc gel phân t- Nghin 20 g lá trong nitrogen l*ng ñn khi mn. Cho vào h8n hp 200 ml dung dch ly trích, trn ñu sau ñó lc qua vi lc. Dch sau lc ñưc ly tâm 15 phút " 13000 v/p và thu ph$n dch trong. Protein ñưc ta bng aceton vi t l dch : aceton là 1: 2. Dch cha ta ñưc ly tâm 30 phút " 13000 v/p. Đ& b* ph$n aceton và ñ ph$n aceton còn th'a trong ta protein bay hơi. Sau ñó hòa ta vào 10 ml dung dch ñ m citric/citrate 5 mM pH 6,5. Lc dch qua màng lc 0,45 µm. Dung dch protein ñưc tinh sch qua h thng sc ký lc gel phân t. Các thông s chy sc ký như sau: ct 50 cm x 1,5 cm, flow adaptor 1,5 cm, th tích m0u 2 ml, phân ñon 2 ml, bưc sóng hp th 280 nm, tc ñ dòng chy 0,14 ml/p. Pha rn là gel Sephadex G50 (gii hn phân tách 1,5-3 kDa), pha l*ng là dung dch ñ m citric/citrate 5 mM pH 6,5 [6, 9, 10]. KT QU VÀ THO LU!N ChEn lEc và theo dõi các biAu hin hình thái ca cây chuyAn gen Lc lp ñưc chuy n gen trong cây " giai ñon ñ$u rt ít so vi ph$n còn li là lc lp hoang di có th lên ti 10.000 ñơn v trong t bào, do ñó, nuôi cy m0u chuy n gen trong môi trưng có áp lc chn lc cao nhm ñ gia tăng s lưng lc lp chuy n gen và hưng ti ñ%ng nht toàn b trong t bào. 7 nhng vòng chn lc ñ$u tiên mt s ch%i/cây chuy n gen có bi u hi n lá loang l& ñm mt màu do spectinomycin và streptomycin c ch hình thành các ribosome t&ng hp protein " lc lp hoang di còn t%n ti, nh hư"ng ñn s to thành di p lc trong lá (Hình 1). TAÏP CHÍ PHAÙT TRIEÅN KH&CN, TAÄP 15, SOÁ T1 2012 Trang 57 Hình 1. Cây chuy n gen vi lá loang l& ñm mt màu " nhng vòng ñ$u chn lc cao bng kháng sinh spectinomycin và streptomycin Đ quá trình chn lc ñưc tri t ñ , các dòng cây chuy n gen ñưc cy truyn liên tc trên môi trưng cơ bn có b& sung spectinomycin và streptomycin " n%ng ñ tăng d$n t' n%ng ñ chn lc ban ñ$u ñn 500 mg/l. Các cây chuy n gen ñưc cho tái sinh li nhiu ñt trên môi trưng có spectinomycin và streptomycin 500 mg/l. Các cá th phát tri n tt nht s+ ñưc chn. Vi c tái sinh ñưc thc hi n 4 l$n (Hình 2) [1, 2, 7]. Hình 2. Các mnh lá cây chuy n gen ñưc nuôi cy tái sinh ch%i li trên môi trưng có kháng sinh spectinomycin và streptomycin 500 mg/l so vi các mnh lá t' cây V2 ñi chng Các dòng chuy n gen sau 4 l$n tái sinh trên môi trưng chn lc không còn bi u hi n loang l& ñm mt màu trên lá, phát tri n tt, lá có màu xanh lá cây ñ%ng ñu (Hình 3). Science & Technology Development, Vol 15, No.T1 2012 Trang 58 Hình 3. Cây chuy n gen phát tri n tt trên môi trưng có kháng sinh spectinomycin và streptomycin " n%ng ñ 500 mg/l. Phân tích PCR Các dòng chuy n gen sau khi chn lc có kh năng sng tt nht là T1, T2, T5, T6, ñã ñưc ki m tra s hi n di n ca gen HIV-1 p24 [4]. Các dòng này ñưc tip tc ki m tra s hi n di n ca gen aadA bng PCR vi các m%i ñ c hi u aadap1 và aadap2. Hình 4. Kt qu PCR ki m tra s hi n di n ca gen aadA trong các dòng thuc lá chn lc sau khi chuy n gen T1, T2, T3, T5, T6 và ñi chng âm t' cây V2 hoang di. Đi chng dương t' pITB.HIV-1 p24. Thang chu!n 1 kb Biolabs. Kt qu trên bn gel có xut hi n các băng khuch ñi ñon trình t phù hp vi kích thưc mong mun 250 bp (Hình 4). Dòng T3, trong quá trình chn lc, có kh năng kháng spectinomycin " n%ng ñ khong 250 mg/l, nhưng khi chuy n sang n%ng ñ cao hơn thì cây b cht. Ki m tra PCR " dòng này, kt qu âm tính, không có băng khuch ñi. Hi n tưng này có th ñưc gii thích do dòng T3 là dòng ñt bin gen rrn16 lc lp, không phi dòng chuy n gen. Vi các kt qu ki m tra bng PCR, có th kt lun các dòng thuc lá T1, T2, T5, T6 ñã ñưc bin np gen HIV-1 p24 và gen aadA vào trong b máy di truyn ca cây. Tuy nhiên ñ ki m tra tính &n ñnh ca cu trúc chuy n gen và v trí hòa nhp ca các gen này trên lc lp, hai phn ng PCR ñưc thc hi n trong ñó phn ng th nht vi c p m%i g%m 1 m%i xuôi cpT1 trên lc lp " v trí gen Ladder T1 V2 T2 T3 T5 T6 PC 250 bp TAÏP CHÍ PHAÙT TRIEÅN KH&CN, TAÄP 15, SOÁ T1 2012 Trang 59 trnG và mt m%i ngưc p24 rev " v trí gen HIV-1 p24. Kt qu sn ph!m PCR vi m%i cpT1 và p24 rev " các dòng T1, T2, T5, T6 cho thy có các băng khuch ñi trình t ñ c hi u liên kt t' gen trnfM ñn HIV-1 p24 kích thưc 2,3 kb (Hình 5). Hình 5. Kt qu PCR ki m tra s hi n di n ca trình t liên kt t' gen trnG ñn HIV-1 p24 vi các m%i cpt1 và p24 rev " các dòng thuc lá chuy n gen T1, T2, T5, T6 và ñi chng âm t' cây V2 hoang di. Đi chng dương t' pITB.HIV-1p24. Thang chu!n 1 kb Biolabs. 7 các sn ph!m PCR thc hi n vi c p m%i cpT1 và cpT2 bt c p trên gen trnG và trnG, kt qu cho thy 4 dòng chuy n gen T1, T2, T5, T6 có duy nht các băng khuch ñi ñ c hi u kích thưc 2,55 kb và " m0u ñi chng V2 ch có băng khuch ñi kích thưc 255 bp. Băng 255 bp là ñon trình t " lc lp hoang di gia cpT1 và cpT2, trong khi ñó băng 2,55 kb là trình t g%m c cu trúc gen bin np chèn gia cpT1 và cpT2. Trong trưng hp ñi tưng ki m tra trong tình trng khm, không chuy n gen ho c bin np vào nhân s+ nhn ñưc băng khuch ñi 255 bp. Điu này chng t* các dòng T1, T2, T5, T6 ñã ñưc chuy n gen HIV-1 p24 &n ñnh vào v trí phù hp trên lc lp và " tình trng ñ%ng nht lp th chuy n gen trong cây (Hình 6). Hình 6. Kt qu PCR ki m tra s hi n di n ca trình t liên kt t' gen trnG ñn gen trnfM vi các m%i cpt1 và cpt2 " các dòng thuc lá chuy n gen T1, T2, T5, T6 và ñi chng âm cây V2 hoang di. Đi chng dương t' pITB.HIV-1 p24, thang chu!n 1 kb Biolabs. NC V2 T1 T2 T5 T6 Marker 2,55 kb 255 bp V2 PC T1 T2 T5 T6 Marker 2,3 kb Science & Technology Development, Vol 15, No.T1 2012 Trang 60 Phân tích Southern blot Các dòng chuy n gen ñưc ki m tra di truyn bng lai phân t Southern blot vi probe là trình t trên gen psaB, nm ngoài các v trí tái t& hp ñ%ng dng trnfM và trnG có kích thưc là 543 bp. DNA t' các dòng chuy n gen và ñi chng ñưc ct bng enzyme ct gii hn BglII, ti 1 v trí ct trên gen psaB và mt v trí ct bên trong k cn trnS. Kích thưc ñon ct gii hn trong ca gen lc lp hoang di là 3,5 kb và lc lp bin np gen là 5,8 kb. Kt qu trên phim t ghi cho thy " dòng ñi chng có băng lai DNA " v trí 3,5 kb và " các dòng chuy n gen có các băng lai " v trí 5,8 kb (Hình 7). Như vy cu trúc gen c$n chuy n ñã ñưc bin np thành công vào lc lp và nm trong liên kt vi các gen lc lp hoang di phù hp. Hình 7. Kt qu phân tích Southern blot các dòng chuy n gen T1, T2, T5, T6 và cây V2 hoang di. Thang DNA chu!n λHindIII. Phân tích biAu hin protein p24 b:ng Western blot Bn dòng thuc lá chuy n gen T1, T2, T5, T6 ñưc ki m tra s bi u hi n ca protein p24 bng phương pháp Western blot. Lá t' các dòng thuc lá tr%ng " vưn ươm khong 1 tháng ñưc dùng ñ ly trích protein. N%ng ñ protein m0u ñưc tính da trên ñưng chu!n BSA. Kt qu ñưng chu!n: N%ng ñ mg/ml 0,0625 0,125 0,25 0,5 1 OD 0,039 0,071 0,127 0,211 0,393 Phương trình ñưng chu!n ñưc thành lp y = 0,4066x theo x là giá tr các n%ng ñ protein chu!n và y là giá tr OD tương ng. N%ng ñ protein t&ng ca m0u ñưc tính theo phương trình trên t' giá tr OD như sau (Bng 2): V2 T1 T2 T5 T6 5,8 kb 3,5 kb TAÏP CHÍ PHAÙT TRIEÅN KH&CN, TAÄP 15, SOÁ T1 2012 Trang 61 Bng 2. N%ng ñ protein t&ng " các dòng phân tích. M0u V2 T1 T2 T5 T6 OD 0,144 0,225 0,352 0,352 0,217 N%ng ñ protein mg/ml 0,708313 1,106739 1,731431 1,067388 0,993606 N%ng ñ protein trong lá mg/g 2,361043 3,689129 3,55796 3,55796 3,312018 Protein ca các cây V2 hoang di ñi chng âm, các dòng chuy n gen T1, T2, T5, T6 và protein ñi chng dương t' vi khu!n E. coli ñưc phân tách bng ñi n di trên gel acrylamide trên nn SDS vi marker GE Rainbow RPN800E. Các băng protein ñưc nhum th hi n trên bn gel (Hình 8). Hình 8. Bn gel ñi n di phân tích các protein ly trích t' các dòng chuy n gen T1, T2, T5, T6 , cây V2 hoang di và t' vi khu!n E.coli mang plasmid pITB.HIV-1 p24. Các băng protein trên bn gel s+ ñưc chuy n qua màng lai và kt qu thc nghi m Western blot xác ñnh ñưc các băng protein p24 " dòng ñi chng dương và các dòng chuy n gen T1, T2, T5, T6. 7 cây V2 hoang di ñi chng âm không có băng protein p24 (Hình 9). Hình 9. Các băng protein HIV-1 p24 " các dòng chuy n gen T1, T2, T5, T6 và E. coli mang plasmid pITB.HIV-1 p24 ñưc phát hi n b"i phương pháp Western blot Marker V2 T6 T5 T2 VK T1 26 kDa 24 kDa V2 VK T1 T2 T5 T6 p24 ~ 26 kDa Science & Technology Development, Vol 15, No.T1 2012 Trang 62 Kt qu Western blot cho thy protein p24 ñưc bi u hi n " các dòng thuc lá chuy n gen T1, T2, T5, T6. Phân tích hàm lưng protein p24 trong các dòng chuyAn gen b:ng phương pháp ELISA Các dòng chuy n gen có bi u hi n protein p24 ñưc chng minh bng Western blot s+ ñưc ki m tra bng k thut ELISA ñ xác ñnh hàm lưng protein p24 so vi hàm lưng protein tan t&ng. Lá ca cây chuy n gen và ñi chng ñưc thu nhn " ngày th 55 trên các lá 12 và 20. M0u ñưc ly trích protein t&ng và cho kt qu như sau: N%ng ñ mg/ml 0,0625 0,125 0,25 0,5 1 OD 0,056 0,116 0,193 0,409 0,665 Phương trình ñưng chu!n ñưc thành lp y = 0,7025x theo x là n%ng ñ protein BSA chu!n và y là giá tr OD tương ng. N%ng ñ protein ca m0u ñưc tính theo công thc trên t' giá tr OD như sau (Bng 3): Bng 3. N%ng ñ protein t&ng " các dòng phân tích. M0u V2 T1 T2 T5 OD Lá 12 0,591 0,569 0,606 0,589 mg/OD 1,68256228 1,619929 1,725267 1,676868 mg/g lá 5,60854093 5,399763 5,75089 5,589561 OD lá 20 0,6498 0,659 0,672 0,659 mg/OD 1,84996441 1,876157 1,913167 1,876157 mg/g lá 6,16654804 6,253855 6,377224 6,253855 Các m0u trên sau ñó ñưc phân tích bng k thut ELISA ñ xác ñnh hàm lưng protein p24 da trên thang chu!n là kháng nguyên protein p24 tinh khit " các n%ng ñ 0, 10, 50, 100 fg/ml. N%ng ñ fg/ml 0 10 50 100 OD 0,013 0,12 0,175 0,35 dOD 0 0,107 0,162 0,337 Phương trình ñưng chu!n ñưc thành lp y = 0,0035x theo x là n%ng ñ protein p24 và y là giá tr OD tương ng. Kt qu hàm lưng protein p24 " các m0u ñưc tính theo công thc trên t' giá tr OD như sau (Bng 4): TAÏP CHÍ PHAÙT TRIEÅN KH&CN, TAÄP 15, SOÁ T1 2012 Trang 63 Bng 4. N%ng ñ protein p24 " các dòng phân tích ELISA M0u V2 T1 T2 T5 OD Lá 12 0,079 0,159 0,383 0,348 ∆OD 0,08 0,304 0,269 Protein p24 µg/ml 23,52941 89,41176 79,11765 Protein p24 µg/g lá 94,11765 357,6471 316,4706 % protein p24/protein t&ng 1,742996 6,218987 5,661815 OD Lá 20 0,085 0,422 0,373 0,252 ∆OD 0,337 0,288 0,167 Protein p24 µg/ml 99,11765 84,70588 49,11765 Protein p24 µg/g lá 396,4706 338,8235 196,4706 % protein p24/protein t&ng 6,339619 5,313025 3,141592 N%ng ñ protein p24 bi u hi n có s khác bi t " các v trí khác nhau. Tinh sch protein p24 bng sc ký lc gel phân t Lá ñưc thu nhn t' các dòng chuy n gen " ph$n g$n ngn ñưc ly trích, tinh sch và ta protein bng aceton trong 1 gi " 4oC. Dch trích protein có hàm lưng protein t&ng hòa tan là 5,122 mg/g lá. T' 20 g lá thu ñưc ph$n ta rn là 1,16 g. Lưng ta này ñưc hòa vào 10ml dung dch ñ m citrate/citric 5mM pH 6,5 và lc qua màng lc 0,45 fm ñ thu ph$n dch trong. Ph$n gi li trên lc là 0,249 g. Kt qu tinh sch sc ký lc gel như sau (Bng 5, Hình 10): Bng 5. Kt qu sc ký lc gel Tên nghi m thc ∑ Hàm lưng (mg) Đ tinh sch (l$n) Hi u sut (%) Trưc sc ký Sau sc ký 30,348 9,694 1 9,694 100 31,94 Science & Technology Development, Vol 15, No.T1 2012 Trang 64 Hình 10. Đ% th chy sc ký lc gel protein p24. Th tích dung dch các phân ñon sau sc ký ca peak 1 và 2 ñưc ñông khô có trng lưng tương ng vi peak 1 và 2 là 0,11 và 0,065 g. Dùng 1/10 trng lưng tương ng vi peak1 và peak 2 hòa tan trong nưc ñ xác ñnh hàm lưng protein p24 bng phân tích ELISA cho kt qu như sau: Bng 6. Hàm lưng protein p24 trong peak 1 và 2 thu nhn sau sc ký M0u V2 TB P1 P2 OD 0,08325 0,102222 0,094815 dOD 0,018972 0,011565 µg/ml 5,580065 3,401416 Lưng protein p24 thu ñưc " hai m0u th là 8,98 fg/ml, Lưng p24 trên t&ng s m0u thu ñưc sau sc ký lc gel " peak 1 và 2 là 89,8 fg, T l ph$n trăm protein p24 so vi lưng protein t&ng ch ñt 0,92% (theo công thc [89,8x100:(9,694x10000)]). T l này thp hơn nhiu so vi t l thu nhn trc tip " dch ly trích protein chưa qua tinh sch, Điu này có th do s mt hot tính ca protein p24 trong các quá trình tinh sch và chy sc ký. Trong nghiên cu này, h thng vector chuy n gen lp th pITB.HIV1 ñưc s dng, TAÏP CHÍ PHAÙT TRIEÅN KH&CN, TAÄP 15, SOÁ T1 2012 Trang 65 g%m gen HIV-1 p24 ñưc ñiu khi n b"i promoter rrn và gen aadA cũng ñưc ñiu khi n b"i promoter rrn. Đây là nghiên cu chuy n gen vào lc lp thuc lá to protein tái t& hp ñ$u tiên ñưc thc hi n " Vi t Nam, do ñó nó mang ý nghĩa mô hình nhm hoàn thi n các các thông s, quy trình chuy n gen lc lp và phân tích cây chuy n gen trong ñiu ki n phòng thí nghi m thc hi n. Mô lá in vitro cây thuc lá V2 ñưc dùng làm nguyên li u chuy n gen. Khi ki m tra mc chng chu, mô lá khá nhy cm vi n%ng ñ kháng sinh chn lc, b c ch b"i spectinomycin " n%ng ñ 80 mg/l và streptomycin 125 mg/l. Tuy nhiên, mô lá sau khi ñưc chuy n gen có th tái sinh ch%i trên môi trưng có kháng sinh chn lc spectinomycin và streptomycin " n%ng ñ cao 500 mg/l, các cây con chuy n gen cũng phát tri n tt trên môi trưng có cùng n%ng ñ kháng sinh. Các n%ng ñ kháng sinh này cũng ñưc s dng trong chn lc cây chuy n gen ca McCabe và cs (2008) [6] Zhou và cs (2008) [13]. Các dòng thuc lá chuy n gen sau chn lc T1, T2, T5, T6, khi ki m tra bng PCR vi các m%i ñ c hi u khác nhau cho thy có s hi n di n ca các gen trong cu trúc gen ñã chuy n. Điu ñó cho thy cây thuc lá V2 in vitro có kh năng bin np gen vào lc lp và cu trúc Prrn/ aadA/TrbcL bi u hi n tt. Ngoài ra dòng thuc lá T3 thu nhn ñưc trong quá trình chn lc ch kháng ñưc spectinomycin " n%ng ñ khong 250 mg/l và cht khi chuy n sang n%ng ñ cao, ki m tra bng PCR cho thy không phi là cây chuy n gen, có th là các dòng ñt bin t nhiên gen 16S rRNA trong lc lp hoang di, tham kho theo báo cáo ca Maliga (2004) [7]. Trong phân tích Southern blot các dòng chuy n gen T1, T2, T5, T6, khi ct b gen lc lp bng enzyme ct gii hn BglII, v trí ct ñưc xác ñnh như trên sơ ñ%, hai băng DNA ñưc phát hi n b"i m0u dò trình t psaB. Băng th nht " v trí 3,5 kb xut hi n " dòng hoang di, ging vi kt qu thc hi n trên ging thuc lá Petite Havana hoang di trong công trình ca tác gi Zhou và cs (2008) [13], dùng m0u dò và enzyme ct gii hn tương t. Băng th hai " v trí 5,8 kb xut hi n " các dòng chuy n gen, trong khi " các dòng chuy n gen vi vector pZF5 trong công trình ca Zhou và cs (2008) là 6 kb [13]. pZF5 có cu trúc khá g$n vi cu trúc chúng tôi s dng và có cùng v trí hòa nhp trên lc lp thuc lá. Kt qu PCR và Southern blot ñã xác ñnh bt c$u các v trí gen chuy n trong lc lp, chng minh trình t gen chuy n hòa nhp vào ñúng v trí mc tiêu trên lc lp vi cu trúc &n ñnh. 7 phân tích Western blot, dch chit xut protein t' các dòng cây chuy n gen T1, T2, T5, T6 ki m tra ñu có băng protein HIV-1 p24 ñưc phát hi n bng kháng th ñ c hi u, ging vi kt qu ki m tra t' dch chit xut protein ca vi khu!n. Kt qu tương t vi kt qu các dòng chuy n gen vi vector PZF5 ca tác gi Zhou và cs (2008) [13] vi vector pZSJH1p24 ca McCabe và cs (2008) [6]. Khi phân tích bng ELISA 3 dòng chuy n gen T1, T2 và T5, hàm lưng protein p24 tái t& Science & Technology Development, Vol 15, No.T1 2012 Trang 66 hp bi u hi n tích lũy " các lá 12 và 20 ñánh s t' gc lên ngn ñưc ghi nhn vào ngày th 55. Kt qu cho thy hàm lưng protein p24 trên t&ng protein hòa tan " lá th 12 cây T1 là 1,7%; T2 là 6,2%; T5 là 5,6% và lá th 20 cây T1 là 6,3%; T2 là 5,3%, T5 là 3,1% Tham kho s bi u hi n protein p24 trong cây thuc lá " mt s công trình khác cho thy có s khác bi t rt ln " chuy n gen nhân và chuy n gen lc lp. Công trình chuy n gen p24, P35S vào nhân có mc bi u hi n protein p24 là 0,35% TSP (Zhang và cs, 2002) [12]. Trong chuy n gen lc lp, công trình ca Zhou và cs (2008) [13] bi u hi n p24-nef, ñiu khi n b"i trình t T7g10 " mc 40% TSP; công trình ca McCabe và cs (2008) [6], trên cây thuc lá Maryland Mammoth bi u hi n p24, ñiu khi n b"i Prrn " mc 2,5%TSP; bi u hi n p24-cco, ñiu khi n b"i Prrn-T7g10, " mc 4,5% TSP. Tuy nhiên trong các trưng hp bi u hi n p24 trong lc lp ñưc ñi u khi n b"i T7g10 (Zhou và cs, 2008; McCabe và cs, 2008) có ki u hình bt thưng lá vàng, cây chm phát tri n. Các dòng chuy n gen trong công trình nghiên cu ca chúng tôi có mc bi u hi n kh quan, kiu hình bình thưng, tuy nhiên c$n phi ki m tra thêm trên s lưng m0u ln hơn và " các thi ñi m khác nhau ñ có th xác ñnh mc bi u hi n rõ ràng hơn. Trong thí nghi m tinh sch protein p24 t' dch chit xut ca các dòng thuc lá, phương pháp sc ký lc gel phân t ñưc s dng ñ thu nhn các protein trong gii hn 1,5-3 kDa. Tuy nhiên hàm lưng protein p24 sau khi tinh sch ñưc ki m tra bng ELISA bi u th rt thp, ñiu này có th do các ñiu ki n khi ta protein toàn ph$n bng aceton chưa thích hp và thi gian lưu khi phân tích sc ký lc gel quá dài. Trong khi ñó " nghiên cu ca mình, McCabe và cs (2008) ñã s dng ta phân ñon vi amonium sulphate ñ thu protein p24 và dùng h thng sc ký trao ñ&i ion dương, có thi gian lưu rt ngn, ñ ñiu ch p24. Đây cũng là nhng thông s rt quan trng có th ci thi n hi u sut thu h%i trong các nghiên cu tip theo ca chúng tôi. KT LU!N Bng phương pháp chn lc kéo dài và tái sinh 4 l$n trên môi trưng có b& sung các kháng sinh spectinomycin và streptomycin " n%ng ñ cao 500 mg/l, 4 dòng thuc lá V2 chuy n gen HIV-1 p24 và gen aadA vào lc lp T1, T2, T5, T6 ñã ñưc chn lc, có s phát tri n hình thái bình thưng và &n ñnh. Bn dòng chuy n gen trên ñã ñưc phân tích bng k thut PCR và Southern blot cho thy có mang gen HIV-1 p24 và gen aadA theo ñúng cu trúc trên vector chuy n gen, t& hp gen chuy n hòa nhp vào lc lp ñúng v trí ñích và các dòng cây sau chn lc có tình trng ñ%ng nht lp th chuy n gen. Kt qu phân tích Western blot cho thy gen HIV-1 p24 bi u hi n " 4 dòng T1, T2, T5, T6; và bng phân tích ELISA ghi nhn sơ b ñưc hàm lưng protein p24 thu ñưc trên t&ng protein tan ca lá tương ng vi các dòng T1, T2, T5 sau 55 ngày tr%ng " lá th 12 là 1,7%, 6,2%, 5,7% và lá 20 là 6,3%, 5,3%, 3,1%. Dùng sc ký lc gel phân t ñ tinh sch h8n hp protein ly trích t' lá, lưng protein sau sc TAÏP CHÍ PHAÙT TRIEÅN KH&CN, TAÄP 15, SOÁ T1 2012 Trang 67 ký thu ñưc ñt hi u sut tinh sch 31,94%, ñ tinh sch ñt 9,964 l$n. Phân tích bng ELISA cho thy hàm lưng protein p24 trong h8n hp protein sau sc ký là 0,92%. Protein p24 bi u hi n trong lá có s khác bi t " các v trí và thi ñi m khác nhau. Do ñó, ñ thu nhn ñưc hàm lưng cao nht, c$n thc hi n thêm các thí nghi m kho sát s bi u hi n protein theo v trí và thi gian nuôi cy " quy mô ln hơn. C$n xác ñnh li các ñiu ki n ly trích, kt ta và tinh sch ñ bo ñm protein p24 không mt hot tính trong quá trình thu h%i. HIV-1 P24 EXPRESSION IN TRANSPLASTOMIC TOBACCO PLANTS Phan Tuong Loc, Nguyen Huu Ho, Nguyen Thi Thanh Institute of Tropical Biology, VAST ABSTRACT: Expression of HIV-1 p24 gene in chloroplasts was achieved in a tobacco variety V2 (Virginia TBE2). Through PCR and Southern blot analyses, it was demonstrated that the transgene integrated into the target site in the chloroplasts, between trnfM and trnG. Western blot results showed that HIV-1 p24 gene expressed in transplastomic tobacco plants. p24 protein accumulations were detected by ELISA in the range from 1.7% to 6.3% TSP and the high concentrations in the leaves near the top. p24 protein was purified by gel filtration chromatography demonstrated that the purification is 9.694 folds and the performance is 31.94%, however, protein p24 largely was inactive after purification. TÀI LI
U THAM KHO [1]. R. Bock, Transgenic chloroplasts in basic research and plant biotechnology, J. Mol. Biol, 312, 425–438 (2001). [2]. H. Daniell, Transformation and foreign gene expression in plants mediated by microprojectile bombardment, Methods Mol. Biol, 62, 453–488 (1997). [3]. H. Daniell, A. Dhingra, O. N. Ruiz, Chloroplast genetic engineering to improve agronomic traits, Methods Mol. Biol, 286, 111 – 137 (2004). [4]. P. T. Lc, N. H. H&, N. T. Thanh, Bưc ñ$u chuy n gen HIV-1 p24 vào lc lp cây thuc lá ging V2 bng phương pháp bn gen, Tp chí Phát trin khoa h c và công ngh 14, 35-46 (2011). [5]. M. S. McCabe, J. B. Power, A. M. de Laat, M. R. Davey, Detection of single- copy genes in DNA from transgenic plants by nonradioactive Southern blot analysis, Mol. Biotechnol, 7, 79–84 (1997). [6]. M. S. MaCable, M. Klaas, G. N. Rabade, M. Poage, C. A. J. Badillo, F. Zhou, D. Science & Technology Development, Vol 15, No.T1 2012 Trang 68 Karcher, R. Bock, J. C. Gray, J. P. Dix, Plastid transformation of high-biomass tobacco variety Maryland Mammoth for prodcution of human immunnodeficiency virus type 1 (HIV-1) p24 antigen, Plant Biotechnology Journal 6, 914-929 (2008). [7]. P. Maliga, Plastid transformation in higher plants, Annu. Rev.Plant Biol, 55, 289–313 (2004). [8]. N. D. Singh, Y. Ding, H. Daniell, Methods in molecular biology, recombinant proteins from plants, Humana Press, Chapter 10, 169-192 (2009). [9]. H. Thiellement, M. Zivy, C. Damerval, V. Méchin, Plant Proteomics, Methods and Protocols, Humana Press (2007). [10]. M. J. Walker, The Protein Protocols Handbook, Second Edition, Humana Press (2002). [11]. D. Walls, S. T. Loughran, ProteinChromatography: Methods and Protocols, Humana-Press (2011). [12]. G. G. Zhang, L. Rodrigues, B. Rovinski, K. A. White, Production of HIV-1 p24 protein in transgenic tobacco plants, Molecular Biotechnology 20, 131-136 (2002). [13]. F. Zhou, C. J. A. Badillo, D. Karcher, G. N. Rabadez, K. Piepenburg, M. I. A. Borcher, P. A. Maloney, A. T. Kavanagh, C. J. Gray, R. Bock, High level expression of human immunodeficiency virus antigens from the tobacco and tomato plastid genomes, Plant Biotechnology Journal, 6, 897-913 (2008).