Biến đổi của gen ND1 ty thể ở bệnh nhân ung thư vú - Tô Thị Vân Anh

TAP CHI SINH HOC 2015, 37(1se): 143-149 DOI: 10.15625/0866-7160/v37n1se. BIẾN ĐỔI CỦA GEN ND1 TY THỂ Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ VÚ Tô Thị Vân Anh1, Nguyễn Thị Tú Linh1, Đỗ Minh Hà1, Tạ Văn Tờ2, Trịnh Hồng Thái1* 1Trường Đại học Khoa học tự nhiên, ĐHQG Hà Nội, *thaith@vnu.edu.vn 2Bệnh viện K, Hà Nội TÓM TẮT: Gen ND1 ty thể mã hóa cho NADH dehydrogenase subunit 1, thuộc phức hệ I trong chuỗi hô hấp tế bào. Việc nghiên cứu các biến đổi của gen ND1 trên bệnh nhân ung thư vú đã được thực hiện trên thế giới, tuy nhiên, chưa có nghiên cứu nào được tiến hành trên bệnh nhân ung thư vú ở Việt Nam. Trong công trình này, chúng tôi phân tích các biến đổi của gen ND1, tập trung vào đột biến T4216C và biến đổi A4164G. Trong số 101 bệnh nhân ung thư vú được nghiên cứu, đột biến T4216C được tìm thấy ở một bệnh nhân và là đột biến hiếm gặp ở người Việt Nam. Biến đổi A4164G xuất hiện với tần suất 21,2% ở bệnh nhân ung thư vú và 9% ở người bình thường. Biến đổi A4164G đã được chứng minh có liên quan đến bệnh ung thư vú (p<0,05). Phân tích đồng thời mô vú và máu của cùng bệnh nhân trong 16 trường hợp đã cho thấy biến đổi A4164G không xuất hiện như nhau trong 2 loại mô khác nhau của cùng một bệnh nhân. Vì vậy, biến đổi A4164G có thể là đột biến soma. Kết quả nghiên cứu cũng đã xác định được một số biến đổi, trong đó có một biến đổi mới (G3412A) chưa được tìm thấy trong các nghiên cứu đã được công bố và 6 biến đổi làm thay đổi acid amin. Từ khóa: ADN ty thể, đột biến soma, gen ND1, ung thư vú. MỞ ĐẦU Ung thư vú là bệnh phổ biến nhất và là một trong năm loại ung thư có tỷ lệ tử vong cao nhất ở nữ giới trên thế giới và tại Việt Nam. Do đó, đối tượng này đã thu hút sự quan tâm của nhiều nghiên cứu nhằm tìm ra các chỉ thị sinh học hỗ trợ sàng lọc, chẩn đoán sớm và điều trị ung thư vú. Ty thể có hệ gen riêng, dạng vòng. Khác với ADN nhân, ADN ty thể dễ bị biến đổi do môi trường giàu các gốc tự do (là sản phẩm của quá trình phosphoryl hóa oxy hóa diễn ra ở màng trong ty thể) và thiếu cơ chế sửa chữa hiệu quả [2]. Các đột biến trong gen ty thể dù là đột biến điểm, mất đoạn hay đảo đoạn thường xảy ra ở các cơ quan sử dụng nhiều năng lượng như cơ, xương, não bộ, tim và thường gây ảnh hưởng lớn đến chức năng của chúng với cơ thể. Gen ND1 nằm trên sợi nặng của ADN ty thể, có kích thước 956 bp, vị trí base: 3307-4262. Gen ND1 ty thể mã hóa cho protein NADH dehydrogenase subunit 1 thuộc phức hệ I, có vai trò quan trọng trong chuỗi hô hấp tế bào [1]. Các biến đổi của gen ND1 ty thể có thể làm thay đổi cấu trúc của protein NADH dehydrogenase subunit 1, dẫn đến việc không đảm bảo chức năng, có thể làm ảnh hưởng tới dòng vận chuyển điện tử bình thường. Điều này có thể là nguyên nhân gây nên nhiều bệnh, trong đó có bệnh ung thư. Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành xác định và tìm hiểu các biến đổi của gen ND1 ở bệnh nhân ung thư vú, tập trung vào biến đổi A4164G và T4216C và tiến hành phân tích mối liên quan giữa các biến đổi này với một số đặc điểm bệnh học của bệnh nhân ung thư vú. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu nghiên cứu là 101 cặp mẫu mô u và mô lân cận u (cách mô u 2-3 cm) của bệnh nhân ung thư vú do bệnh viện K cung cấp, trong đó có 16 bệnh nhân được cung cấp cả mẫu máu đi kèm. Mẫu đối chứng là 100 mẫu máu bình thường của người cho máu do Viện Huyết học và Truyền máu Trung Ương cung cấp. ADN tổng số được tách chiết từ mẫu mô và mẫu máu theo kit của hãng Qiagen và Thermoscientific. Cặp mồi đặc hiệu 4015F: 5’-GTT TGT TAA GAT GGC AGA-3’ và 4350R: 5’-TGT ATG AGT TGG TCG TAG C-3’. Sản phẩm PCR (kích thước 335 bp) được xử lý với enzyme cắt giới hạn NlaIII, trình tự cắt 5’-CATG-3’. Có bốn trường hợp có thể xảy ra. Với mẫu không có biến đổi, sản phẩm RFLP thu được có kích thước 335 bp. Với mẫu có đột biến T4216C làm xuất hiện vị trí nhận biết điểm cắt của enzyme, sản phẩm RFLP thu được là hai băng có kích thước 202 bp và 133 bp. Đối với những mẫu có biến đổi A4164G, sản phẩm RFLP thu được là hai băng có kích thước 185 bp và 150 bp. Với những mẫu xuất hiện đồng thời cả 2 biến đổi tại vị trí 4164 và 4216, sản phẩm PCR sẽ bị cắt thành 3 băng có kích thước 52 bp, 133 bp và 150 bp. Sản phẩm cắt enzyme được điện di trên gel polyacrylamide 10%. Bên cạnh đó, sản phẩm PCR được tinh sạch để giải trình tự trực tiếp nhằm xác định chính xác sự tồn tại của đột biến T4216C và biến đổi A4164G. Trong nghiên cứu này, chúng tôi cũng sử dụng cặp mồi 3226F: 5’-GTT TGT TAA GAT GGC AGA 3’ và 4166R: 5’-TGT ATG AGT TGG TCG TAG C 3’ để nhân sản phẩm PCR có kích thước 940 bp. Sau đó, sản phẩm PCR được tinh sạch để giải trình tự trực tiếp, nhằm khảo sát các biến đổi khác trên gen ND1 ty thể. Sử dụng các phần mềm Sequence scanner, BioEdit, BLAST, ClustalXđể phân tích kết quả giải trình tự thu được. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Tỷ lệ biến đổi A4164G và T4216C ở bệnh nhân ung thư vú Sử dụng cặp mồi đặc hiệu với khuôn là ADN tổng số từ mẫu mô, mẫu máu bệnh nhân và mẫu máu của người bình thường, đoạn ADN được khuếch đại bằng PCR. Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 1,5% và nhuộm bằng Ethidium Bromide (hình 1). Kết quả điện di ở hình 1 cho thấy, đã thu được băng sản phẩm PCR có kích thước 335 bp như dự kiến. Các băng sáng rõ, không xuất hiện băng phụ, chứng tỏ không có hiện tượng bắt cặp không đặc hiệu. Chúng tôi đã khuếch đại thành công đoạn ADN của gen ND1 bằng PCR từ 101 cặp mẫu mô, 16 mẫu máu bệnh nhân và 100 mẫu máu của người bình thường. Để phát hiện được đột biến T4216C và biến đổi A4164G, sản phẩm PCR được cắt trực tiếp bằng enzyme NlaIII (hình 2). Trên hình 2, ở giếng 3 và giếng 5, sản phẩm PCR bị enzyme cắt làm 2 băng. Ở giếng 3 là mẫu mang đột biến T4216C với 2 băng 202 bp và 133 bp. Giếng 5 là mẫu mang biến đổi A4164G với 2 băng có kích thước 185 bp và 150 bp. Hình 1. Ảnh điện di sản phẩm PCR đoạn ADN của gen ND1 từ mẫu mô vú (gel agarose 1,5%, nhuộm ethidium bromide) Giếng 1-6: Sản phẩm PCR từ ADN tổng số mẫu mô u, mô lân cận u của bệnh nhân ung thư vú; Giếng 7: Thang chuẩn ADN 100 bp; Giếng 8: Đối chứng âm (phản ứng PCR được thực hiện với khuôn là nước). Hình 2. Ảnh điện di sản phẩm PCR được cắt bằng enzyme NlaIII từ mẫu mô vú (gel polyacrylamide 10%, nhuộm bạc) Giếng 1: Thang chuẩn ADN 100 bp; Giếng 2, 4, 6: Sản phẩm PCR trước khi cắt bằng enzyme NlaIII; Giếng 3, 5, 7: Sản phẩm PCR sau khi cắt bằng enzyme NlaIII. Hình 3: Ảnh điện di sản phẩm PCR cắt bằng enzyme NlaIII ở mẫu mô u, mô lân cận u, mẫu máu của một bệnh nhân (gel polyacrylamide 10%, nhuộm ethidium bromide) Giếng 1: Thang chuẩn ADN 100 bp; Giếng 2, 3: Mẫu mô u; giếng 4, 5: Mẫu mô lân cận u; giếng 6, 7: Mẫu máu; Giếng 3, 5, 7: Sản phẩm PCR sau cắt bằng enzyme NlaIII; Giếng 2, 4, 6: Sản phẩm PCR trước khi cắt bằng enzyme NlaIII. Hình 4. Ảnh điện di sản phẩm PCR cắt bằng enzyme NlaIII ở mẫu máu người bình thường (gel polyacrylamide 10%, nhuộm ethidium bromide) Giếng 1: Thang chuẩn ADN 100 bp; Giếng 2, 4, 6: Sản phẩm PCR trước khi cắt bằng enzyme; Giếng 3, 5, 7: Sản phẩm PCR sau khi cắt bằng enzyme. Phân tích trên 101 cặp mẫu mô vú, chúng tôi đã tìm thấy 18 bệnh nhân mang biến đổi A4164G và 1 bệnh nhân mang đột biến T4216C. Không có trường hợp nào xuất hiện đồng thời cả hai loại biến đổi. Biến đổi A4164G ở các mẫu mô u, mô lân cận u và mô máu trên cùng một bệnh nhân Kết quả hình 3 cho thấy ở giếng điện di sản phẩm PCR được cắt bằng enzyme của mẫu mô u và mẫu máu (giếng 3, 7) chỉ có 1 băng có kích thước 335 bp. Tuy nhiên, ở mẫu mô lân cận u (giếng 5) lại xuất hiện 2 băng có kích thước 185 bp và 150 bp. Như vậy, ở bệnh nhân này, biến đổi A4164G chỉ xuất hiện ở mẫu mô lân cận u và có sự khác nhau về sự xuất hiện biến đổi A4164G ở các mô khác nhau trong cơ thể của bệnh nhân. Tiếp tục phân tích trên 16 bệnh nhân có đủ mẫu mô và mẫu máu, chúng tôi nhận thấy có 5 bệnh nhân có sự khác biệt về sự xuất hiện biến đổi A4164G ở các mẫu mô khác nhau giống như trường hợp trên. Từ kết quả này, chúng tôi cho rằng biến đổi A4164G có thể là đột biến soma. Biến đổi A4164G ở mẫu máu người bình thường Bằng phương pháp PCR-RFLP, tiến hành phân tích ở 100 mẫu máu bình thường của người cho máu (đối chứng), kết quả đã cho thấy có 9/100 mẫu mang biến đổi A4164G. Như vậy biến đổi này xuất hiện ở cả người bình thường (hình 4). Phân tích trình tự đoạn ADN mang biến đổi A4164G và T4216C Để khẳng định sự tồn tại của đột biến T4216C và biến đổi A4164G, sản phẩm PCR đã được tinh sạch và giải trình tự trực tiếp. Kết quả giải trình tự được so sánh với trình tự ADN chuẩn của ADN ty thể người trên ngân hàng gen thuộc NCBI (NC_012920). Kết quả phân tích trình tự đã chứng tỏ sự có mặt của biến đổi T4216C (hình 5) và A4164G (hình 6) và việc phát hiện các mẫu có mang các biến đổi này theo phương pháp PCR-RFLP là đáng tin cậy. Phân tích trình tự ADN đối với mẫu mang biến đổi A4164G ở dạng dị tế bào chất (được xác định bằng phương pháp PCR-RFLP) đã chỉ rõ tại vị trí 4164, xuất hiện đồng thời hai đỉnh A và G rõ ràng, cân đối (hình 6). Điều này phù hợp với việc xuất hiện 3 băng có kích thước 335 bp, 185 bp, 150 bp trong kết quả phân tích PCR-RFLP. Có 2/101 bệnh nhân có hiện tượng dị tế bào chất tại vị trí 4164. Hình 5. Đoạn trình tự ADN thuộc gen ND1 của mẫu không mang đột biến (4216T) và mẫu có đột biến (4216C) Hình 6. Đoạn trình tự ADN ty thể thuộc gen ND1 có vị trí 4164 của các mẫu nghiên cứu. Dạng đồng tế bào chất 4164A hoặc 4164G và dạng dị tế bào chất A4164G Biến đổi A4164G xuất hiện ở cả người bệnh và người bình thường. Tuy nhiên, tỷ lệ biến đổi A4164G ở người bệnh (21,2%) cao hơn so với người bình thường (9%) (p<0,05). Như vậy, biến đổi A4164G tuy xuất hiện ở cả bệnh nhân ung thư vú và người bình thường, nhưng dạng biến đổi này gặp nhiều hơn ở bệnh nhân ung thư vú, chứng tỏ biến đổi A4164G có thể có liên quan đến bệnh. Biến đổi A4164G của gen ND1 cũng được tìm thấy với tần suất thấp hơn (4%) ở bệnh nhân LHON [5]. Trong nghiên cứu của Fang và cộng sự (2013) [4] ở bệnh nhân ung thư phổi, biến đổi A4164G cũng xuất hiện với tần suất thấp (3/30 mẫu bệnh nhân). Mặc dù vai trò của đột biến soma vẫn chưa rõ, nhưng khi xem xét tổng thể các đột biến soma có tần suất tương đối cao trong toàn bộ ADN ty thể có thể hữu ích khi chẩn đoán ung thư phổi ở một mức độ nhất định. Đột biến T4216C là đột biến có ý nghĩa quan trọng, làm thay đổi Tyrosine thành Histidine tại vị trí acid amin 304. Đột biến này đã được các nghiên cứu chỉ ra có liên quan đến nhiều bệnh khác nhau như bệnh LHON [9], bệnh đái tháo đường [3]. Theo nghiên cứu của Akouchekian và cộng sự (2011) [1], đột biến T4216C xuất hiện ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng với tần suất 27%, và có sự khác biệt đáng kể giữa mô ung thư và mô thường (p<0,05). Nghiên cứu của Grzybowska-Szatkowska & Slaska (2014) ở bệnh nhân ung thư vú, phát hiện đột biến T4216C ở 2/50 mẫu máu bệnh nhân ung thư vú [6]. Tuy nhiên, trong nghiêncứu này của chúng tôi, đột biến chỉ được tìm thấy ở một bệnh nhân trên tổng số 101 bệnh nhân được phân tích. Điều này chứng tỏ đây là một đột biến hiếm gặp ở bệnh nhân ung thư vú người Việt Nam. Sử dụng phương pháp giải trình tự trực tiếp, một số biến đổi khác của gen ND1 ty thể cũng đã được xác định (bảng 1). Bảng 1. Các biến đổi của gen ND1 làm thay đổi acid amin ở bệnh nhân ung thư vú STT Vị trí nucleotide Thay đổi nucleotide Thay đổi acid amin Vị trí acid amin Số mẫu có biến đổi Ghi chú 1 3338 T→C V→A 11 1 2 3412 G→A 1 Biến đổi mới 3 3472 T→C F→L 56 1 Bệnh LHON [8] 4 3497 C→T A→V 64 1 Bệnh LHON [7] 5 3571 C→T L→F 89 1 6 4048 G→A D→N 248 3 a Hình 7. Đoạn ADN thuộc gen ND1 chứa mẫu không có biến đổi 3497C (hình a) và mẫu có biến đổi 3497T (hình b). b Trong các biến đổi trên, biến đổi G3412A là biến đổi mới, cho đến nay, chúng tôi chưa tìm thấy biến đổi này trong các công trình đã được công bố. Một số biến đổi, gồm T3338C, T3472C, C3497T, C3571T và G4048A là những biến đổi có nghĩa, làm thay đổi acid amin. Một số biến đổi đã được công bố liên quan đến bệnh LHON (T3472C và C3497T). Đáng chú ý là biến đổi C3497T (hình 7), biến đổi này làm thay đổi acid amin Alanine thành Valine. Những biến đổi trên có thể làm thay đổi cấu trúc của sản phẩm protein mà gen ND1 mã hóa, từ đó ảnh hưởng đến chức năng của protein. Điều này mở ra các hướng nghiên cứu tiếp theo nhằm đánh giá ảnh hưởng của các biến đổi này với bệnh ung thư vú, qua đó phục vụ cho các nghiên cứu phát triển chỉ thị sinh học chẩn đoán ung thư sớm. KẾT LUẬN Bằng phương pháp PCR-RFLP, chúng tôi đã xác định thấy biến đổi A4164G và đột biến T4216C ở bệnh nhân ung thư vú. Biến đổi A4164G xuất hiện với tần suất 21,2% ở bệnh nhân ung thư vú, 9% ở người bình thường và có 2 bệnh nhân mang biến đổi ở dạng dị tế bào chất. Biến đổi này có thể là đột biến soma và có liên quan đến bệnh (p<0,05). Đột biến T4216C là đột biến hiếm gặp ở bệnh nhân ung thư vú người Việt Nam. Bằng phương pháp giải trình tự trực tiếp đã phát hiện thấy một số biến đổi gồm G3412A, T3338C, T3472C, C3497T, C3571T và G4048A. Trong đó, biến đổi G3412A là biến đổi mới, các biến đổi còn lại làm thay đổi acid amin. Lời cảm ơn: Công trình được thực hiện với kinh phí của đề tài KC.04.10/11-15 và sự giúp đỡ của bệnh viện K về việc cung cấp mẫu mô bệnh ung thư vú, giúp đỡ của viện Huyết học và Truyền máu Trung ương về mẫu máu của người bình thường. TÀI LIỆU THAM KHẢO Akouchekian M., Houshmand M., Akbari M. H., Kamalidehghan B., Dehghan M., 2011. Analysis of mitochondrial ND1 gene in human colorectal cancer. Journal of research in medical sciences, 16(1): 50-55. Anderson S., Bankier A. T.,  Barrell B. G., de Bruijin M. H. L.,  Coulson A. R., Drouin J., Eperon I. C., Nierlich D. P., Roe B. A., Sanger F., Schreier P. H., Smith A. J. H., Staden R., Young I. G., 1981. Sequence and organization of the human mitochondrial genome. Nature(5806), 290: 457-465. Crispim D., Canani L. H., Gross J. L., Tschiedel B., Souto K. E.,  Roisenberg I., 2006. The European-specific mitochondrial cluster J/T could confer an increased risk of insulin-resistance and type 2 diabetes: an analysis of the m.4216 T > C and m.4917 A > G variants. Annals of Human Genetics, 70(Pt4): 488-495. Fang Y., Huang J., Zhang J., Wang J., Qiao F., Chen H. M., Hong Z. P., 2013. Detectingthe somatic mutations spectrum of Chinese lung cancer by analyzing the whole mitochondrial DNA genomes. Mitochondrial DNA, DOI: 10.3109/ 19401736.2013.823168. Fujitake J., Mizuta H., Fujii H., Ishikawa Y., Sasamoto K., Goko Y., Nonaka I., Tatsuoka Y., 2002. Leber’s Hereditary Optic Neuropathy With Intracranial Arteriovenous Malformation: A Case Report, Acta neurologica belgica, 102(2): 82-86. Grzybowska-Szatkowska L., Slaska B., 2014. Mitochondrial NADH dehydrogenase polymorphisms are associated with breast cancer in Poland. Journal of Applied  Genetics, 55(2): 173-181. Matsumoto M., Hayasaka S., Kadoi C., Hotta Y., Fujiki K.,  Fujimaki T., Takeda M.,  Ishida N.,  Endo S., Kanai A.,1999. Secondary mutations of mitochondrial DNA in Japanese patients with Leber's hereditary optic neuropathy. Ophthalmic Genet, 20(3): 153-160. Martinez-Romeo I., Herrero-Martin M. D., Llobet L., Emperador S., Martin-Navarro A., Narberhaus B., Ascaso F. J., Lopez-Gallardo E., Montoya J., Ruiz-Pesini E., 2014. New MT-ND1 pathologic mutation for Leber hereditary optic neuropathy. Clinical and Experimental Ophthalmology, 42(9): 856-864. Povalko N., Zakharova E., Rudenskaia G., Akita Y., Hirata K., Toyojiro M., Koga Y., 2005. A new sequence variant in mitochondrial DNA associated with high penetrance of Russian Leber hereditary optic neuropathy. Mitochondrion, 5(3): 194-199. MITOCHONDRIAL ND1 GENE ALTERATION IN BREAST CANCER PATIENTS To Thi Van Anh1, Nguyen Thi Tu Linh1, Do Minh Ha1, Ta Van To2, Trinh Hong Thai1 1Hanoi University of Science, VNU 2Vietnam National Cancer Hospital, Ha Noi SUMMARY Mitochondrial ND1 gene encodes NADH dehydrogenase subunit 1 which is in the complex I of the respiratory chain. Alterations of ND1 gene in breast cancer have been reported worldwide, however, no studies have been conducted in Vietnam. In this work, we analyzed the alterations of ND1 gene, especially focusing on T4216C mutation and A4164G variant. Of all 101 breast cancer patients studied, the T4216C mutation was only found in one patient and it was a rare mutation in Vietnam. Meanwhile, the frequency of A4164G variant was 21.2% in patients with breast cancer and 9% in control. This variant has been shown to be related to breast cancer (p<0.05). Analysis of blood and breast tumor tissues in 16 cases showed that A4164G variant did not appear the same in different tissues of the same patient. Therefore, A4164G alteration might be a somatic mutation. In this study we identified some nucleotide alterations including G3412A variant, which was a new and unpublished alteration, and six nucleotide alterations that changed the amino acid sequence. Keywords: Mitochondrial DNA, ND1 gene, breast cancer, somatic mutation. Ngày nhận bài: 22-10-2014