Bảo quản tế bào gốc tủy răng chuột

20 TCNCYH 83 (3) - 2013 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC by inversion - PCR. Five severe Hemophilia A patients were selected for this study; we use Inver- sion - PCR to analyse intron 22 inversion in F8 gene. 1/5 patients were found to have intron 22 inversion. In conclusion, intron 22 inversion was successfully identified in Vietnamese severe He- mophilia A patients by I - PCR technique. Keywords: Hemophilia A, inversion intron 22, inversion - PCR BẢO QUẢN TẾ BÀO GỐC TỦY RĂNG CHUỘT Tô Minh Quân1, Lê Thị Ngọc Hương1, Hoàng Đạo Bảo Trâm2 1Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh 2Trường Đại học Y - Dược Thành phố Hồ Chí Minh Tế bào gốc tủy răng chuột nhắt trắng Mus musculus var albino được bảo quản trong môi trường DMEM/ F12 bổ sung DMSO 10%, FBS 20% theo 2 quy trình giảm nhiệt: (1) để trong điều kiện 4oC/20 phút, -20oC/30 phút, sau đó chuyển sang bảo quản ở -80oC; (2) để trong điều kiện -20oC/30 phút và bảo quản ở -80oC. Tế bào đông lạnh được giải đông trong môi trường nuôi cấy DMEM/F12 bổ sung FBS 20% ở 370C. Các tế bào được tiếp tục nuôi cấy trong môi trường DMEM/F12, bổ sung FBS 10%, Peniciline 100UI/ml, Streptomycine 100µg/ml, ở điều kiện 37oC, CO2 5%. Tỷ lệ tế bào sống sau quá trình bảo quản đông lạnh ở thời điểm 1 ngày, 2 tuần, 4 tuần và 8 tuần được đánh giá bằng phương pháp nhuộm Trypan Blue. Sự biểu hiện các marker bề mặt tế bào được kiểm tra bằng phương pháp Flow Cytometry. Thử nghiệm cho thấy tế bào tủy răng chuột được bảo tốt trong thời gian 4 tuần theo quy trình đông lạnh -20oC/20 phút và bảo quản ở -80oC. Sau khi giải đông, các tế bào có khả năng bám, tăng trưởng và biểu hiện các marker của tế bào gốc trung mô CD73, CD90, CD105 và không biểu hiện các marker của tế bào máu CD19, CD34, CD45. Từ khóa: tế bào gốc tủy răng, bảo quản tế bào, nuôi cấy tế bào Địa chỉ liên hệ: Hoàng Đạo Bảo Trâm, Đại học Y Dược Tp Hồ Chí Minh, 217 Hồng Bàng, Quận 5, TpHCM email: hoangdaobaotram@gmail.com Ngày nhận: 13/03/2013 Ngày được chấp thuận: 20/6/2013 I. ĐẶT VẤN ĐỀ Tế bào gốc là những tế bào chưa biệt hóa trong mô sống, có khả năng trở thành các tế bào chuyên biệt với các chức năng đặc trưng [1]. Trong điều kiện in vivo hoặc in vitro, mỗi tế bào gốc có thể tự làm mới với các tính năng riêng biệt mới. Ngày nay, tế bào gốc được tách và thu nhận từ rất nhiều nguồn (phôi giai đoạn tiền làm tổ, thai, cơ thể trưởng thành,..). Tủy răng là vùng tế bào giúp răng sống và duy trì chức năng. Tương tự như tủy xương, tủy răng chứa các tế bào gốc trung mô. Ngoài ra, tủy răng còn chứa tế bào tiền nguyên bào ngà, tế bào tạo máu. Tế bào tủy răng là nguyên liệu quan trọng cho những nghiên cứu trong lĩnh vực tái tạo răng. Sau thành công của Gronthos năm 2000 trong việc phân lập và nuôi cấy tế bào gốc tủy răng người [2], trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu tiếp tục phát triển theo hướng này. Tại Việt Nam, một số nghiên cứu đã cho kết quả nuôi cấy thành công tế bào từ mảnh mô tủy răng người [3; 4]. Song song với việc phân lập tế bào gốc, kỹ thuật bảo quản tế bào gốc động vật cũng phát triển và mở ra một kỷ nguyên mới trong công nghệ tế bào động vật. Với mục tiêu xuyên suốt TCNCYH 83 (3) - 2013 21 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC là lưu giữ tế bào trong trạng thái nguyên vẹn theo thời gian và có thể sử dụng sau này cho các mục đích nghiên cứu hay điều trị, việc bảo quản tế bào gốc động vật bao hàm nhiều ý nghĩa thực tiễn: giảm thiểu sự biến đổi gen, ngăn cản biệt hóa tế bào, giảm nguy cơ nhiễm khuẩn và chết tế bào, giảm nhiễm chéo các dòng tế bào, giảm nguy cơ biến đổi cấu trúc và thay đổi hình thái, giảm chi phí nuôi cấy [1]. Về lý thuyết, tế bào gốc có khả năng phân chia vô hạn, song nhiều nghiên cứu cho thấy khi các tế bào phân chia nhiều lần trong những khoản thời gian dài, có thể xảy ra các bất thường về nhiễm sắc thể. Trong khi đó, kỹ thuật phân lập các dòng tế bào gốc rất khó khăn, do vậy việc bảo quản tế bào gốc là rất cần thiết nhằm phục vụ các mục đích nghiên cứu và ứng dụng. Một số kỹ thuật bảo quản tế bào gốc được áp dụng phổ biến là kỹ thuật đông lạnh và kỹ thuật đông khô [1]. Nghiên cứu này được tiến hành nhằm mục tiêu: bảo quản tế bào gốc của tủy răng chuột áp dụng quy trình nhiệt. II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP Tế bào gốc tủy răng chuột nhắt trắng Mus musculus var. albino được thu nhận bằng phương pháp nuôi cấy mảnh mô tủy răng trong môi trường DMEM/F12 (Sigma) bổ sung huyết thanh bào thai bò (FBS) 10% (Sigma), Peniciline 100UI/ml (Sigma), Streptomycine 100 µg/ml (Sigma) ở điều kiện 37oC, CO2 5%. Tế bào gốc tủy răng được thu nhận bằng phương pháp tách với Trypsin/EDTA 0,25%; 0,02%. Tế bào gốc tủy răng được bảo quản trong môi trường DMEM/F12 bổ sung DMSO (Dimethyl Sulfoxide) 10%, FBS 20%. Tế bào được đông lạnh theo 2 quy trình nhiệt: Quy trình 1: mẫu lần lượt trải qua các giai đoạn ở điều kiện 4oC trong 20 phút và -20oC trong 30 phút, sau đó chuyển sang bảo quản ở điều kiện -80oC; Quy trình 2: mẫu trải giai đoạn ở điều kiện -20oC trong 20 phút, sau đó chuyển sang bảo quản ở điều kiện -80oC. Sau thời gian đông lạnh 1 ngày, 2 tuần, 4 tuần, 8 tuần, tế bào được tiến hành giải đông trong môi trường nuôi cấy DMEM/F12 bổ sung FBS 20%. Tỷ lệ sống chết tế bào được xác định bằng phương pháp nhuộm Trypan Blue, sự biểu hiện marker CD73, CD90, CD105, CD19, CD34, CD45 được đánh giá bằng phương pháp Flow Cytometry. III. KẾT QUẢ Tỷ lệ tế bào sống khi giải đông và nuôi cấy sau bảo quản Tỷ lệ tế bào sống sau bảo quản đông lạnh 1 ngày theo hai quy trình đều cao (> 90%), không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) (bảng 1). Các tế bào đông lạnh sau khi giải đông được tiếp tục nuôi cấy trong môi trường có bổ sung huyết thanh. Bảng 1. Tỷ lệ tế bào sống khi giải đông sau bảo quản một ngày Quy trình 1 4oC/20’ -20oC/30’ -80oC Quy trình 2 -20oC/30’ -80oC Tỷ lệ tế bào sống 95% 94% 97% 97% 97% 98% 22 TCNCYH 83 (3) - 2013 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Sau 1 ngày, quan sát được hiện tượng các tế bào bám trên bề mặt đĩa nuôi cấy, tế bào có hình dạng tương tự tế bào trước khi đưa vào bảo quản đông lạnh (hình 1). Các tế bào này tiếp tục tăng sinh trong những ngày nuôi cấy tiếp theo. Hình 1. Hình ảnh qua hiển vi quang học đảo ngược: tế bào giải đông sau bảo quản đông lạnh một ngày (a: x40; b: x200) Hình 2. Hình ảnh qua hiển vi quang học đảo ngược: tế bào giải đông sau bảo quản hai tuần (a: x40; b: x200) Kết quả thu nhận được sau 1 ngày cho thấy hai quy trình đông lạnh có hiệu quả tương đương nhau. Tuy nhiên, quy trình 2 đơn giản hơn và tiết kiệm thời gian, do đó được tiếp tục áp dụng và đánh giá với thời gian bảo quản dài hơn, ở các thời điểm sau 2 tuần, 4 tuần và 8 tuần. Tỷ lệ tế bào sống trung bình sau 2 tuần, 4 tuần, 8 tuần bảo quản lần lượt là 95,2%, 65,6%, 17,3%. Sau 2 tuần bảo quản đông lạnh ở -80oC, trung bình tỷ lệ tế bào sống giảm từ 96,3% còn 95,2%. Sau 4 tuần, tỷ lệ tế bào sống trung bình là 65,6%. Sau 8 tuần, tỷ lệ tế bào sống giảm còn dưới 20% (bảng 2). Kết quả cho thấy hiệu quả đông lạnh tế bào giảm dần theo thời gian. Sự biểu hiện marker bề mặt tế bào sau giải đông Sau khi giải đông và nuôi cấy tế bào đã được bảo quản đông lạnh trong thời gian 4 tuần, tế bào bám trên bề mặt đĩa nuôi cấy sau 1 ngày, các tế bào có hình thái tương tự tế bào trước bảo quản, với dạng hình thoi, dài 100 - 120 µm, rộng 10 - 30 µm. Các tế bào tăng trưởng tốt, thời gian đạt được mật độ TCNCYH 83 (3) - 2013 23 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC hợp dòng là 7 ngày. Khi tiến hành đánh giá đặc tính của tế bào bằng phương pháp Flow Cytometry, các tế bào có biểu hiện marker bề mặt của tế bào gốc trung mô, tiêu chuẩn của Hiệp hội Quốc tế về tế bào gốc [5]. Tế bào có biểu hiện dương tính với các marker CD73 (98,08%), CD90 (91,3%), CD105 (98,76%) và âm tính với các marker CD19 (0,72%), CD34 (0,56%), CD45 (7,65%), tương tự như các tế bào nuôi cấy trước bảo quản đông lạnh (hình 3). Bảng 2. Mật độ và tỷ lệ tế bào sống khi giải đông sau bảo quản 2, 4 và 8 tuần Thời gian bảo quản Mẫu Mật độ tế bào (tb/ống) Tỷ lệ tế bào sống 2 tuần 1 4,88 x 106 95,7% 2 4,57 x 106 93,2% 3 4,34 x 106 96,6% 4 tuần 1 4,39 x 106 62,9% 2 4,06 x 106 63,5% 3 4,25 x 106 70,3% 8 tuần 1 5,01 x 106 15% 2 4,16 x 106 20% 3 5,19 x 106 17% Hình 3. Kết quả đánh giá marker bề mặt tế bào tủy răng chuột P4 sau bảo quản 4 tuần 24 TCNCYH 83 (3) - 2013 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Trong điều kiện nghiên cứu, chúng tôi nhận thấy, đối với quy trình bảo quản ở -80oC, thời gian bảo quản tốt nhất là trong vòng 4 tuần. IV. BÀN LUẬN Tế bào gốc trưởng thành là các tế bào được thu nhận từ cơ thể trưởng thành. Tế bào gốc trung mô (Mesenchymal Stem Cells - MSC) là những tế bào có nguồn gốc trung mô có khả năng tự phân chia và biệt hóa thành nhiều dòng tế bào như tế bào tạo sụn, xương, mỡ, cơ và mô liên kết đệm. Do đó, MSC được xem là nguồn tế bào gốc nhiều triển vọng cho các phương pháp điều trị bằng liệu pháp tế bào. MSC được thu từ nhiều nguồn như tủy xương, máu cuống rốn, mô mỡ, răng... Trong đó, MSC từ răng là nguồn tế bào tự thân được thu nhận dễ dàng, ít gây xâm lấn bệnh nhân và có tiềm năng biệt hóa thành các loại tế bào răng. Quần thể tế bào gốc trong tủy răng rất ít; xấp xỉ 1% tổng số tế bào và quá trình tích tuổi làm giảm dần khả năng tham gia tạo mô và làm lành thương của tế bào [6]. Trong các nghiên cứu in vitro hay các nghiên cứu tiền lâm sàng hoặc trong các ứng dụng lâm sàng, lượng tế bào gốc cần sử dụng thường rất lớn. Việc nuôi cấy cho tế bào gốc tủy răng tăng sinh có vai trò rất cần thiết trong liệu pháp tế bào; tuy nhiên, trong quá trình được nuôi cấy và tăng sinh, các tế bào có nguy cơ mất tính gốc, cảm ứng tự biệt hóa Do đó, tế bào gốc cần được nuôi cấy để đạt được số lượng tế bào cần thiết trong khoảng thời gian ngắn nhất với số lần cấy chuyền ít nhất. Đối với những tế bào đã đạt tới thời điểm tối ưu nhằm sử dụng trong những nghiên cứu sau hoặc cho những ứng dụng lâm sàng, việc kéo dài thời gian nuôi cấy sẽ làm gia tăng khả năng mất tính gốc tế bào và gia tăng khả năng xuất hiện tế bào sinh ung thư. Bảo quản nhằm lưu giữ tế bào và duy trì các đặc tính của tế bào giúp chúng ta có thể có được một nguồn tế bào gốc có sẵn với số lượng lớn, phục vụ cho nghiên cứu và các liệu pháp điều trị khi cần. Bên cạnh đó, quá trình nuôi cấy tế bào đạt đến giai đoạn tối ưu thường không dễ dàng, thường bao qua nhiều giai đoạn như nuôi cấy sơ cấp từ mảnh mô, nuôi cấy thứ cấp qua nhiều thế hệ. Do đó, việc lưu trữ các dòng tế bào giúp tiết kiệm công sức, tiền bạc và thời gian trong nghiên cứu. Trong nghiên cứu của Ding và cộng sự, các tế bào nhú chóp răng (SCAP) đã được bảo quản đông lạnh 6 tháng trong nitrogen lỏng. Các tác giả nhận thấy rằng quy trình đông lạnh đã thực hiện không ảnh hưởng tới các đặc điểm hình thái, khả năng tăng sinh và các đặc tính về kiểu hình của tế bào. Trong 4 loại dung dịch bảo quản bao gồm DMSO 1% + trehalose 9% + FBS 90%, DMSO 4% + treha- lose 6% + FBS 90%, DMSO 8% + trehalose 2% + FBS 90%, DMSO 10% + FBS 90%, dung dịch DMSO 4% + trehalose 6% + FBS 90% là loại dung dịch bảo quản ưu việt nhất, cho mức độ tế bào sống cao, nâng khả năng biệt hóa và giảm tác hại của DMSO [7,8]. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh khả năng nuôi cấy lại tế bào gốc tủy răng sau bảo quản, các tế bào này duy trì được các đặc tính hình thái chức năng và khả năng biệt hóa đa dòng (multi l ineage differentiation) [9; 10; 11]. Nghiên cứu này hướng tới thiết lập quy trình đông lạnh, giải đông đơn giản, phù hợp với điều kiện của hầu hết các đơn vị nghiên cứu và đơn vị lâm sàng. Đối với quá trình bảo quản, trong môi trường đông lạnh, quy trình hạ nhiệt, quy trình giải đông đóng vai trò rất quan trọng trong tính chất tế bào. Môi trường đông lạnh được sử dụng là môi trường DMSO 10%. DMSO (Dimethyl Sulfoxide) có những TCNCYH 83 (3) - 2013 25 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC đặc tính như có thể thấm qua màng tế bào một cách thụ động, giảm tổn thương tế bào do hạn chế hình thành tinh thể đá nội bào để bảo vệ tế bào, chỉ độc với tế bào ở nồng độ cao. Do đó, DMSO thường được sử dụng trong bảo quản tế bào ở nồng độ thấp 5 - 10%. Quy trình giảm nhiệt trong nghiên cứu là quy trình thường được sử dụng trong các phòng nghiên cứu: 4oC trong 20 phút, -20oC trong vòng 30 phút, bảo quản lâu dài trong -80oC. Việc giảm nhiệt độ từng bước nhằm hạn chế hình thành tinh thể đá phá vỡ tế bào. Tuy nhiên, qua quá trình khảo sát, quy trình đông lạnh có thể giảm xuống là -20oC trong 30 phút, sau đó bảo quản ở âm 80oC. Hai quy trình trên có hiệu quả tương tự nhau nên việc rút ngắn thời gian là cần thiết. Do mục đích hướng tới quy trình đơn giản, thuận tiện cho những đơn vị nghiên cứu lẫn lâm sàng, nhiệt độ bảo quản sử dụng là -80oC, không phải là nhiệt độ -196oC mặc dù nhiều tài liệu chỉ ra rằng bảo quản ở - 196oC thích hợp bảo quản thời gian dài. Kết quả nghiên cứu cho thấy tỷ lệ tế bào sống giảm dần theo thời gian từ 2 tuần (95,2%), đến 4 tuần (65,6%) và 8 tuần (17,3%). Ngoài ra, quá trình bảo quản đông lạnh có khả năng gây tổn thương tế bào, do đó chất lượng tế bào sau rã đông cũng được khảo sát. Sau 4 tuần bảo quản, tế bào vẫn duy trì được dạng hình thoi đặc trưng. Thời gian tế bào đạt mật độ hợp dòng tương tự với tế bào trước khi đông lạnh. Các kết quả khảo sát sự biểu hiện các marker bề mặt tế bào giải đông cho thấy tế bào giải đông vẫn biểu hiện những marker tương tự như tế bào nuôi cấy trước khi đông lạnh: dương tính với marker của tế bào trung mô như CD73, CD90, CD105 và âm tính với những marker không phải của tế bào trung mô như CD19, CD34, CD45. Kết quả thử nghiệm cho thấy tế bào gốc tủy răng đã được bảo quản thành công trong thời gian 4 tuần theo quy trình nhiệt ở -80oC. V. KẾT LUẬN Thử nghiệm thực hiện quy trình bảo quản tế bào gốc tủy răng chuột nhắt trắng Mus musculus var. albino. Kết quả thử nghiệm cho thấy khả năng bảo quản tế bào tủy răng chuột trong thời gian 8 tuần theo quy trình để trong điều kiện -20oC trong 20 phút và bảo quản ở - 80oC; các tế bào được nuôi cấy sau quá trình bảo quản đông lạnh vẫn duy trì được tính gốc. Lời cảm ơn Đề tài được thực hiện bằng nguồn kính phí của chương trình khoa học và công nghệ trọng điểm cấp nhà nước “Nghiên cứu ứng dụng và phát triển công nghệ tiên tiến phục vụ bảo vệ và chăm sóc sức khỏe cộng đồng”, mã số KC.10/11-15, Bộ Khoa học và Công nghệ. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Phan Kim Ngọc, Phạm Văn Phúc, Trương Định (2010). Công nghệ tế bào gốc. Nhà xuất bản giáo dục Việt Nam, 30 - 35. 2. Gronthos S., Makani M., Brahim J. et al (2000). Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo. Proc Natl Acad Sci USA, 97,(25), 13625 - 13630. 3. Đoàn Nguyên Vũ, Phạm Trần Hương Trinh, Nguyễn Thị Nhật Uyên và cộng sự (2011). Nuôi cấy tế bào gốc từ tủy răng người. Tạp chí công nghệ sinh học, 9(3), 297 - 301. 4. Trần Lê Bảo Hà, Đoàn Nguyên Vũ, Tô Minh Quân và cộng sự (2011). Study on culture of human dental pulp stem cells to apply in tissue engineering Journal of Biomimetics. Biomaterials & Tissue Engineering 11, 13 - 20. 5. Domicini M., Le Blanc K., Mueller I et al (2006). Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy, 8(4), 315 - 317. 6. Smith AJ, Patel M., Graham L et al 26 TCNCYH 83 (3) - 2013 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC (2005). Dentine regeneration: key roles for stem cells and molecular signalling. Oral Biosciences and Medicine, 2, 127 - 132. 7. Ding G., Wang W., Liu Y et al (2010). Effet of cryopreservation on biological and immunological properties of stem cells from apical papilla. Journal of Cellular Physiology 223, 415 - 422. 8. De Rosa A., De Francesco F., Tirino V. et al (2009). A new method for cryopreserving adipose-derived stem cells: an attractive and suitable large-scale and long-term cell banking technology. Tissue Eng Part C Methods, 15(4), 659 - 667. 9. Papaccio G., Graziano A., d'Aquino R. et al (2006). Long - term cryopreservation of dental pulp stem cells (SBP - DPSCs) and their differentiated osteoblasts: a cell source for tissue repair, J Cell Physiol, 208(2), 319 - 25 10. Perry B.C., Zhou D., Wu X. Et al (2008). Collection, cryopreservation, and characterization of human dental pulp-derived mesenchymal stem cells for banking and clinical use. Tissue Eng Part C Methods, 14 (2), 149 - 156. 11. Zhang W., Walboomers X.F., Shi S. et al (2006). Multilineage differentiation potential of stem cells derived from human dental pulp after cryopreservation. Tissue Eng, 12(10), 2813 - 2823. Summary CRYOPRESERVATION OF DENTAL PULP STEM CELLS OF MICE Dental pulp stem cells of mice (Mus musculus var. albino) (DPSCs) were preserved by 2 procedures: (1) 4oC/20mins, then -20oC/30mins, and stored at -80oC; (2) -20oC/30mins, and stored at -80oC. Dental pulp fragments were cultured in 35mm-dish with DMEM/F12, supplement- ed with 10% FBS, 100UI/ml Peniciline and 100µg/ml Streptomycine, at 37oC and 5% CO2. The cell viability was measured by trypan blue exclusion method after 1 day, 2 weeks, 4 weeks and 8 weeks. Dental pulp stem cells were identified using flow cytometry method. Cultured population of cells (P4) expressed in high level of mesenchymal stem cells as CD73, CD90, CD105 and low level of endothelial hematopoietic cells as CD19, CD34, CD45. The result showed that mice DPSCs were sucessfully cryopreserved by the following procedure: 20oC/30mins, and stored at -80oC in 4 weeks. After thawing, cells adhered, developed and expressed some of the markers of the mesenchymal stem cells such as CD73, CD90, CD105 and did not express some of the markers of the hematoeic stem cells such as CD19, CD34, CD45. Keywords: dental pulp stem cells (DPSC), cell cryopreservation, cell culture