Báo cáo Di truyền - Một số kỹ thuật phổ biến trong công nghệ di truyền - Lê Công Phúc

MỘT SỐ KỸ THUẬT PHỔ BIẾN TRONG CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN Thành viên nhóm 1) Lê Công Phúc 2) Trần Văn Phong 3) Nguyễn Thiện Phước 4) Nguyễn Thị Thùy Phương Giảng Viên TS. Nguyễn Phương Với sự phát triển mạnh mẽ của các nghành khoa học khác như vật lý học, toán học, hóa học, di truyền học đã và đang khám phá rất nhiều quy luật về sự tồn tại và lưu truyền sự sống và trở thành một mũi nhọn trong nghiên cứu sinh học Những thành tựu rực rỡ của di truyền học đã đem lại những nhận thức mới về cấu tạo và sự vận hành bộ máy di truyền của cơ thể sống. Cùng với sự phát triển mạnh mẽ của di truyền học, một lĩnh vực nghiên cứu mới của di truyền học ra đời, đó là kỹ thuật di truyền hay còn gọi là công nghệ gen hoặc công nghệ di truyền. Và đây là hai kỹ thuật phổ biến trong công nghệ di truyền tạo vecto chuyển gen và kỹ thuật nhân đoạn DNA_PCR Giới Thiệu Khái niệm vector chuyển gen: Vector là phân tử DNA nhỏ (ngắn) dạng thẳng hoặc dạng vòng, trong đó, người ta sẽ cài một mảnh DNA (gen quí) cần nghiên cứu. Những mảnh DNA đã được cài gọi là đoạn cài (insert) hoặc DNA ngoại lai hoặc DNA lạ. Các phân tử DNA nhỏ này thường là những thực khuẩn thể hoặc các plasmid mà trong bộ gen của chúng có tín hiệu cần thiết cho chúng tái bản, nhưng chúng lại không biết tái bản (sinh sôi nẩy nở) một mình. Chúng cần đưa vào trong các tế bào chủ (ví dụ như tế bào vi khuẩn chẳng hạn). 1.Tạo vecto chuyển gen 1. 1 Công nghệ tạo thực vật chuyển gen nhờ vi khuẩn agrobacterium) A.tumefaciens là loại vi khuẩn gây bệnh khối u ở thực vật sống trong đất, trong lĩnh vực biến nạp gen nó được sử dụng làm vectơ đặc biệt để chuyển các gen ngoại lai vào thực vật nhằm tạo ra những thực vật mang gen có các đặc tính mong muốn. Bản chất tự nhiên của vi khuẩn A.tumefaciens là xâm nhập vào chỗ vết thương, kích thích hình thành các chất độc có bản chất phenolic, chất này có tác dụng làm lành vết thương, vừa là kết hợp chất dẫn dụ vi khuẩn xâm nhập, lại có vai trò như một chất kích hoạt vùng gen vir thuộc Ti-plasmid kích thích cho sự cắt đoạn T-DNA (tại vùng bờ trái và bờ phải) để gắn vào genom thực vật. Ti-plasmid đã chuyển một đoạn DNA của Ti-plasmid nhập vào gen của cây. • Để khai thác và sử dụng Agrobacterium như một vector chuyển gen, các nhà khoa học đã loại bỏ các gen gây khối u và gen mã hóa opine của T_DNA và thay vào đó là các marker chọn lọc, trong khi vẫn duy trì các vùng bờ phải và bờ trái của T_DNA với các gen vir, Gen chuyển được xen vào giữa các vùng bờ của T_DNA, nó sẽ được chuyển vào tế bào và trở nên hợp nhất với NST của tế bào. Tuy nhiên một vài yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả biến nạp là loại mô được biến nạp, giai đoạn phát triển của mô, mức độ khởi đầu của vi khuẩn Agrobacterium sử dụng, môi trường để nuôi cấy mô sau biến nạp, marker được sử dụng để chọn lọc thể biến nạp, loại vector sử dụng và kiểu gen của thực vật. Chọn lọc các mô, tế bào được biến nạp thành công. Tái sinh mô, tế bào biến nạp thành cây biến nạp hoàn chỉnh. Sau đó, từ những cây chuyển gen thu được, cần đánh giá sự ổn định di truyền qua các thế hệ, sử dụng phương pháp lai hữu tính để thu được con cái mang gen mong muốn. Đồng thời đánh giá tác động của môi trường đối với cây chuyển gen để đưa ra sản xuất và cung cấp cho thị trường. 1.2 Một số ứng dụng của vector chuyển gen - Một ứng dụng đầu tiên là để tiến hành một quá trình được gọi là sự tách dòng nhằm khuếch đại lượng lớn bản sao DNA xác định. - Nghiên cứu sự biểu hiện của một đoạn DNA chưa biết. - Đưa gen mà con người cần nghiên cứu vào tế bào chủ. - Sản xuất protein từ gen được tạo dòng. - Sản xuất RNA với khối lượng lớn từ DNA tạo dòng. 2. Kỹ thuật nhân đoạn DNA_PCR 2.1 Định nghĩa Phương pháp PCR (polymerase chain reaction) Là phương pháp khuếch đại nhanh nhiều bản sao các đoạn DNA mà không qua tạo dòng. Phương pháp PCR được thực hiện hoàn toàn trong các eppendoff và trong thời gian ngắn ta có thể thu nhận rất nhiều bản sao DNA. Kỹ thuật PCR có thể được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực: chẩn đoán, xét nghiệm các tác nhân vi sinh vật gây bệnh, xác định giới tính của phôi, giải mã di truyền, tạo giống mới với các đột biến định hướng, nghiên cứu sự tiến hoá của sinh vật ở mức độ phân tử,. 2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR 2.2.1. DNA mẫu Phản ứng khuếch đại tối ưu xảy ra trên DNA thật tinh sạch. Nhiều kỹ thuật chẩn đoán bằng PCR vẫn đạt kết quả tốt với DNA thu nhận được trực tiếp từ dịch chiết tế bào. Lượng DNA mẫu sử dụng cũng có xu hướng giảm (1µg xuống còn 100ng) với việc sử dụng các DNA polymerase có hiệu quả cao. 2.2.2. Primer và nhiệt độ lai Primer là chìa khóa quan trọng cho sự thành công hay thất bại của một thí nghiệm PCR. Nếu primer được thiết kế một cách chính xác thì thí nghiệm sẽ mang lại kết quả về sự khuếch đại của một mảnh DNA đơn. Kết luận: việc đề xuất ra phương pháp PCR đã tạo ra một bước tiến mang tính cách mạng trong sinh học phân tử nói riêng và sinh học nói chung vì nhờ việc cho phép phân lập, xác định các gen, đi sâu nghiên cứu chức năng cũng như biển hiện của gen trong quá trình phát triển hoặc phản ứng của gen đối với các điều kiện môi trường, nó cho phép chúng ta tiến hành các nghiên cứu mà trước đây không thực hiện được. Kỹ thuật này đã được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực của sinh học phân tử cho kết quả cao.