Bài giảng Vi sinh thực phẩm - Chương IV: Dinh dưỡng và nuôi cấy vi sinh vật

81 CHƯƠNG IV. DINH DƯỠNG VÀ NUÔI CẤY VSV 4.1. Dinh dưỡng trong MT nuôi cấy vsv 4.2. Các dạng môi trường nuôi cấy 4.3. Các quy luật sinh trưởng của VSV 4.4. Phương pháp xác định số lượng VSV Thành phần dinh dưỡng trong môi trường 4.1. Dinh dưỡng trong MT nuôi cấy vsv Cacbon Ni tơ Khoáng Vitamine Hữu cơ Vô cơ Hữu cơ Vô cơ 82 Thành phần của hệ thống enzyme và coenzyme.vi lượng Thành phần quan trọng của nhiễm sắc thể trong hơ hấp nội bào. Là cofactor của một vài loại enzyme Sắt Có thể bổ sung vào cấu trúc vách tế bào. Là thành phần chính của vi khuẩn nội bào tử Canxi Đòi hỏi duy trì cấy trúc vững chắc của màng tế bào, ribosome, DNA, RNA. Hoạt động là 1 cofactor ở một vài loại enzyme Magne Là 1 loại cation chính của tế bào có vai trò quan trọng trong việc duy trì áp suất thẩm thấu bên trong của tế bào. Có vai trò như cofactor của enzyme Kali Được tìm thấy trong acid nucleic, DNA và RNA. Hiện diện trong phospholipid là 1 phần của màng tế bào. Tìm thấy trong các coenzyme Phospho Được tìm thấy trong cystein và methionine - vì vậy, là thành phần quan trọng của nhiều protein. Có mặt trong các coenzyme, ví dụ như co-carboxylase Lưu huỳnh Thành phần của các amino acid nên là thành phần của các protein. Hiện diện trong các nucleotide tạo nên acid nucleic, các coenzyme và ATP Nito Thành phần của các phân tử chất hữu cơ trong tế bàoCarbon Thành phần nước của tế bào và nhiều phân tử hữu cơ. Chất nhận điện tử cuối cùng của hô hấp hiếu khí Oxigen Thành phần của nước tế bào và các phân tử hữu cơ trong tế bàoHydro Chức năngNguyên tố Vai trò của các nguyên tố hóa học đối với tế bào vi sinh vật • Carbohydrate: – Đường: glucose, fructose, lactose, galactose, maltose – Tinh bột: ngũ cốc, các loại củ • Một số VSV sử dụng trực tiếp tinh bột (amylase) VD: Aspergillus niger, Rhizopus, 1 số nấm men – Rỉ đường: 30% saccharose – Huyết thanh sữa (whey): • 50% chất khô, 20-25% protein, vitamin, khoáng – Cellulose: • Ví dụ: Trichoderma viride, Asp. niger • Để sinh tổng hợp cellulase 4.1.1.Thành phần dinh dưỡng trong môi trường - cacbon  Tùy thuộc vào nhóm VSV mà nguồn carbon cung cấp có thể là vô cơ hay hữu cơ 83 4.1.1.Thành phần dinh dưỡng trong MT – cacbon (tt) Căn cứ vào nguồn thức ăn C, chia VSV thành: a) Nhóm tự dưỡng (autotroph): Tự dưỡng quang năng (photoautotroph, photolithotrophs): Vd: tảo, 1 số vi khuẩn quang hợp lưu huỳnh Tự dưỡng hóa năng (chemoautotroph, chemolithotrops): Tự dưỡng hóa năng: dùng C vô cơ CO2 và năng lượng từ các hc vô cơ ở trạng thái khử: H2S, S, NH3, Fe2+ b) Nhóm dị dưỡng (heterotroph): Dị dưỡng quang năng (photoheterotroph): VD: VK quang hợp không chứa lưu huỳnh, 1 số tảo Dị dưỡng hóa năng (chemoautotroph): Hoại sinh: Kiểu dinh dưỡng của VSV 84 4.2. Các dạng môi trường nuôi cấy  MT nuôi nhiều loại VSV thuộc một nhóm đặc biệt. Duy trì VSV trong các môi trường nuôi cấy Phân biệt giữa các nhóm VSV khác nhau Phân lập các nhóm VSV đặc biệt hoặc các dạng VSV từ một môi trường nào đó, như từ thực phẩm. Giúp định danh VSV Xét nghiệm các chất dinh dưỡng hoặc các hợp chất chống VSV Các bước chuẩn bị môi trường nuôi cấy 85 4.3. Các quy luật sinh trưởng của VSV • Sinh trưởng: sự tăng lên về kích thước, khối lượng của tế bào gắn liền với sự tổng hợp các hợp chất cao phân tử dẫn đến sự hình thành cấu tạo mới trong tb. • Nếu chỉ tăng về kích thước, và khối lượng nhưng ko có sự tổng hợp các hợp chất cao phân tử dẫn đến sự hình thành cấu tạo mới  sự trương nở • Nếu mt thiếu dinh dưỡng, tb sử dụng chất dự trữ, giảm khối lượng  ko gọi là sinh trưởng • Sinh sản: sự tăng lên về số lượng tb. 4.3. Các quy luật sinh trưởng của VSV (tt) Đường cong sinh trưởng của VSV trong nuôi cấy tĩnh Nuôi cấy tĩnh: trong thời gian nuôi không thêm chất dinh dưỡng, không loại bỏ các SP trao đổi chất. 86 Pha lag – Pha tiềm phục 4.3. Các quy luật sinh trưởng của VSV (tt) Pha lag là gì? Nguyên nhân tồn tại pha lag? Độ dài của pha lag = f (Tuổi của giống, thành phần môi trường, lượng giống cấy ban đầu) 4.3. Các quy luật sinh trưởng của VSV (tt) Pha log: Tb bắt đầu phân chia. Vk sinh trưởng và phát triển theo lũy thừa, sinh khối và số lượng tb tăng theo phương trình: N= No* 2n N: tổng số tế bào n: số lần phân chia No: số tế bào ban đầu Đường biểu diễn sinh trưởng theo lũy thừa của vi khuẩn sẽ là đường thẳng.  Hoạt tính sinh lý của tb trong pha log như thế nào? 87 Thời gian thế hệ T: thời gian phân chia thế hệ T2: thời gian cuối T1: thời gian đầu Hằng số tốc độ phân chia 4.3. Các quy luật sinh trưởng của VSV (tt) 4.3. Các quy luật sinh trưởng của VSV (tt) Pha ổn định: Quần thể ở trạng thái cân bằng động. Số tb mới sinh = số tb cũ chết nên sinh khối không tăng cũng không giảm. Lượng tb & sinh khối = max Nguyên nhân tồn tại pha ổn định: Sự cạn về cơ chất dinh dưỡng. Mật độ quá lớn của quần thể vi khuẩn. Sự tích lũy các sản phẩm trao đổi chất, các chất độc Hoạt động sống, trạng thái sinh lý tb: Tb sử dụng chất dự trữ, phân hủy một phần ribosom và tổng hợp một số enzim bổ sung. Tb nào mẫn cảm với các tác nhân MT bị chết trước, tb mới vẫn được tạo ra (ít), một số không chết cũng không sinh sản do đó tạo thành trạng thái cân bằng động. 88 4.3. Các quy luật sinh trưởng của VSV (tt) Pha suy vong: Số tế bào sống giảm theo lũy thừa. Các tb tự phân nhờ các enzim của bản thân. Ở các vi khuẩn sinh bào tử sẽ hình thành bào tử. Sự chết của tế bào có thể diễn ra nhanh hay chậm có liên quan đến sự tự phân hay không tự phân của tế bào. Do sức sống lớn bào tử bị chết chậm nhất. Nguyên nhân tử vong: •Nồng độ chất dinh dưỡng giảm thấp làm giảm hoạt tính trao đổi chất, phân hủy dần dần các chất dự trữ và cuối cùng dẫn đến sự chết hàng loạt tế bào. •Đặc tính của bản thân chủng vi sinh vật. •Tính chất của các sản phẩm trao đổi chất 4.3. Các quy luật sinh trưởng của VSV (tt) Hiện tượng sinh trưởng kép Nguyên nhân: VK sinh trưởng kép khi môi trường chứa nguồn C gồm 2 chất hữu cơ khác nhau. VSV đồng hóa nguồn C nào mà nó ưa thích nhất, đồng thời cơ chất thứ 1 này kìm hãm sự tổng hợp các enzim để đồng hóa cơ chất thứ 2. Khi nguồn C thứ 1 hết, nguồn C thứ 2 cảm ứng tổng hợp nên các enzim cần cho việc chuyển hóa nó. Quá trình tổng hợp này đòi hỏi một thời gian nhất định. Đó là lí do có pha log thứ 2.  Hiện tượng sinh trưởng kép không chỉ giới hạn ở nguồn carbon mà còn thấy ở nguồn nito và phospho 89 4.3. Các quy luật sinh trưởng của VSV (tt) Sinh trưởng & phát triển VSV trong nuôi cấy liên tục Cơ sở của phương pháp: Cung cấp cho vsv điều kiện ổn định để trong thời gian dài chúng vẫn sinh trưởng trong pha log. MT dinh dưỡng mới được đưa liên tục vào bình nuôi cấy đồng thời loại khỏi bình một lượng dịch tương ứng. PP đếm trực tiếp: Đếm trực tiếp bằng buồng đếm hồng cầu PP đo độ đục PP đo mật độ quang . PP đếm gián tiếp: Nuôi cấy trên thạch đĩa Nuôi cấy trên màng petrifilm . 4.4. Phương pháp xác định số lượng VSV 90 ĐỊNH LƯỢNG BẰNG PP ĐẾM TẾ BÀO TRÊN BĐHC Đếm trực tiếp bằng BĐHC: vsv đơn bào có kích thước lớn như nấm men, mốc, tảo có thể được xác định trực tiếp bằng BĐHC trên KHV. Pha loãng mẫu sao cho trong mỗi ô nhỏ của buồng đếm có khoảng 5 - 10 tế bào ĐỊNH LƯỢNG BẰNG PP ĐẾM TẾ BÀO TRÊN BĐHC Pha loãng mẫu Đưa dịch mẫu vào BĐHC Tính kết quả Quan sát trên KHV 10x Đếm tế bào (KHV 40x) N = a/80 x 4000 x 103 (tb/ g (ml) 91 ĐỊNH LƯỢNG BẰNG PP ĐẾM TẾ BÀO TRÊN BĐHC(tt) Quan sát BĐHC trên KHV 10x Chuyển sang vk 40x và đếm tế bào ở 5 ô vuông lớn theo vị trí đường chéo góc trong khu vục “middle square” ĐỊNH LƯỢNG BẰNG PP ĐẾM TẾ BÀO TRÊN BĐHC(tt) VK 10x VK 40x 92 ĐỊNH LƯỢNG BẰNG PP ĐẾM TẾ BÀO TRÊN BĐHC(tt) Tính kết quả sau khi đếm tế bào ở BĐHC trên KHV 40x N = a/80 x 4000 x 103 x 10n (tb/ g (ml) N: số tế bào/ml (g) a: tổng số tế bào đếm được trong 5 ô theo vị trí đường chéo góc tại “middle square” (tế bào) 80: tổng số ô vuông nhỏ/ ô vuông lớn 1/4000: thể tích ô vuông nhỏ (mm3) 103: hệ số chuyển đổi từ mm3 sang ml (g) 10 –n: nồng độ pha loãng được đếm PP nuôi cấy trên thạch bằng (thạch đĩa) 93 PP nuôi cấy trên thạch bằng (PP MPN) Colifrom Tổng số VK hiếu khí Nhỏ mẫu (1 ml) Dễ thao tác Tiết kiệm không gian ủ Không phải khử trùng môi trường 4.4. PP xđ số lượng VSV – nuôi trên petrifilm 94 Sample preparation Sample Plating Incubation Result CHƯƠNG V. CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN SỰ PHÁT TRIỂN CỦA VSV 5.1. Nhiệt độ 5.2. Nước và hoạt độ nước 5.3. pH 5.4. Oxy và quá trình oxy hóa khử 5.5. Ánh sáng, tia chiếu xạ 5.6.Các yếu tố hóa học 5.7. Các yếu tố sinh học