Bài giảng Vi sinh thực phẩm - Chương 1: Giới thiệu về vi sinh trong thực phẩm

se | buihongquan@gbd.edu.vn Kết quả thử nghiệm Coagulase (+) khi xuất hiện khối đông tụ huyết tương (-) không xuất hiện khối đông tụ, dung dịch đồng nhất Thử nghiệm Coagulase 12/22/2017 277 | buihongquan@gbd.edu.vn  Mục đích: thử nghiệm khả năng phân giải gelatine bởi gelatinase.  Cơ sở sinh hóa: Gelatine polypeptide + acid amin Gelatine trong môi trường dinh dưỡng môi trường đông đặc Vi sinh vật phân hủy gelatine môi trường lỏng 12/22/2017 278 gelatinase Thử nghiệm gelatinase | buihongquan@gbd.edu.vn Thử nghiệm gelatinase  Đối chứng:  (+): Aeromonas hydrophila  (-): E. coli  Môi trường sử dụng Nutrient Gelatine  Dạng ống nghiệm thạch sâu  Cấy vi sinh vật và ủ ở nhiệt độ phòng. 12/22/2017 279 | buihongquan@gbd.edu.vn  Đọc kết quả (+) môi trường tan chảy (-) môi trường không tan chảy 12/22/2017 280 Thử nghiệm gelatinase | buihongquan@gbd.edu.vn TN KHẢ NĂNG LÊN MEN – ÔXI HÓA  Mục đích: thử nghiệm khả năng chuyển hoá glucose theo các con đường khác nhau  Cơ sở sinh hóa:  Lên men: là quá trình kỵ khí, tạo môi trường acid cao  Ôxi hóa: là quá trình hiếu khí 12/22/2017 281 | buihongquan@gbd.edu.vn  Môi trường sử dụng: Oxidation/Fermentation media (Hugh & Leifson media)  Chỉ thị pH: bromocresol purple 12/22/2017 282 pH 6,8 TN KHẢ NĂNG LÊN MEN – ÔXI HÓA | buihongquan@gbd.edu.vn Trực khuẩn gram âm O (oxidation) Pseudomonas aeruginosa F (fermentation) Serratia marcescens Cầu khuẩn gram dương O (oxidation) Micrococcus luteus F (fermentation) Staphylococcus aureus 12/22/2017 283 TN KHẢ NĂNG LÊN MEN – ÔXI HÓA | buihongquan@gbd.edu.vn  Đọc kết quả: 12/22/2017 284 A: đối chứng B: phản ứng OXH C: phản ứng lên men TN KHẢ NĂNG LÊN MEN – ÔXI HÓA | buihongquan@gbd.edu.vn Thử nghiệm nitratase (khử nitrate)  Mục đích: Thử nghiệm khả năng khử nitrate  Cơ sở sinh hóa: 12/22/2017 285 3 2 3 2 2, , , ,  nitrataseNO NO NH N NH OH NO NO2 + sulphanilamine/N-napthylethylenediamine hydrochloride  chất màu hồng NO3 + bụi kẽm  màu hồng | buihongquan@gbd.edu.vn  Phương pháp tiến hành:  Nuôi cấy chủng vi sinh vật trong môi trường chứâ nitrate  Bổ sung chất thử để kiểm tra sự hiện diện củâ nitrite  Phản ứng định tính nitrite (-) bổ sung lượng kẽm nhỏ để định tính nitrate 12/22/2017 286 Thử nghiệm nitrâtâsê (khử nitrâtê) | buihongquan@gbd.edu.vn Thử nghiệm nitrâtâsê (khử nitrâtê) 12/22/2017 287 | buihongquan@gbd.edu.vn Thử nghiệm oxydase  Mục tiêu: phát hiện vi sinh vật có hệ enzym oxydase (hệ cytochrome C)  Cơ sở sinh hoá Cytochrome C khử + H+ + O2 Cytochrome C OXH+ H2O Cytochrome C OXH+ TMPD khử  TMPD OXH(màu xanh) 12/22/2017 288 | buihongquan@gbd.edu.vn  Thuốc thử  TMPD (0,1%): N,N,N’,N’-tetramethyl-p-phenylenediamine  Bảo quản lạnh trong tối  Thời hạn bảo quản: 2 tuần  Đối chứng (+): Serratia marcescens (-) : Proteus rettgeri 12/22/2017 289 Thử nghiệm oxydase | buihongquan@gbd.edu.vn  Thực hiện:  Lấy vi sinh vật từ Nutrient Agar đặt lên giấy thấm  Nhỏ thuốc thử TMPD  Quan sát sau 30 giây Phản ứng (+): sinh khối chuyển màu xanh Phản ứng (-): sinh khối vẫn màu trắng 12/22/2017 290 Thử nghiệm oxydase | buihongquan@gbd.edu.vn Thử nghiệm oxydase 12/22/2017 291 | buihongquan@gbd.edu.vn Thử nghiệm ONPG  Mục đích: phát hiện các vi sinh vật có hệ enzyme ß- galactosidase – enzyme cảm ứng.  Cơ sở sinh hóa: ONPG o-nitrophenol 12/22/2017 292 Màu vàng Không màu | buihongquan@gbd.edu.vn Lactose agar Chủng VSV 2ml ONPG broth Pứ (+) Pứ (-) ủ quâ đêm 37oC Màu vàng Thử nghiệm ONPG 12/22/2017 293 | buihongquan@gbd.edu.vn Thử nghiệm khả năng lầ̀m tan huyết  Mục tiêu: phát hiện các vi sinh vật có khả năng làm tan hồng cầu  Máu sử dụng: cừu, bê non, thỏ  Cơ sở sinh hoá:  Các haemolysine là các tác nhân làm tan hồng cầu động vật  Vi sinh vật khác nhau  heamolysine khác nhau  cường độ và biểu hiện tan hồng cầu khác nhau 12/22/2017 294 | buihongquan@gbd.edu.vn  Phân loại: 3 kiểu tan huyết  Tan huyết hoàn toàn (ß): vòng tan huyết trong, rõ  Tan huyết không hoàn toàn (α): xung quanh và dưới khuẩn lạc chuyển đục và có màu khác  Không tan huyết (ɣ): hoàn toàn không tan huyết 12/22/2017 295 Thử nghiê ̣m khẩ nâ ng ̉ ̣ ̉ lầ̀m tân huyết | buihongquan@gbd.edu.vn Thử nghiệm CAMP  Mục tiêu: thử nghiệm khả năng cộng hưởng tan huyết giữâ các vi sinh vật, nhờ viê ̣c tậo thầnh yếu tố CAMP  Cơ sở sinh hóa:  S. aureus tiết β-lysin gây tan hồng cầu  Streptococcus nhóm B tiết CAMP gây tan huyết  β-lysin + CAMP  gây tan huyết mạnh, hoàn toàn  Ý nghĩa: dùng phân biệt Streptococcus nhóm B (+) với Streptococcus nhóm khác (-) 12/22/2017 296 | buihongquan@gbd.edu.vn Staphylococcus aureus Streptococcus agalactiae Streptococcus pyogenes (+) (-) 12/22/2017 297 | buihongquan@gbd.edu.vn Thử nghiệm tính di động  Mục đích: Xác định khả năng di động củâ vi sinh vật.  Cở sở: Vi sinh vật di động nhờ tiêm mao  Các tiến hành: Cấy đâm sâu vi sinh vật vào môi trường thạch mềm (0,5% agar).  Vi sinh vật di động sẽ làm môi trường đục, phát triển lan ra khỏi vết cấy.  Vi sinh vật không di động sẽ phát triển quanh đường cấy, môi trường không bị đục. 12/22/2017 298 | buihongquan@gbd.edu.vn (+) (+) (-) Thử nghiệm tính di động 12/22/2017 299 | buihongquan@gbd.edu.vn Ứng dụng thử nghiệm sinh hóa để định danh vi sinh vật  Mỗi loài vi sinh vật có những đặc tính sinh hóa khác nhau  Thực hiện kiểm tra các thử nghiệm sinh hóa có thể giúp xác định tên loài (định danh) vi sinh vật đó.  Bảng sinh hóa dùng định danh các loài vi sinh vật đường ruột 12/22/2017 300 | buihongquan@gbd.edu.vn 12/22/2017 301 | buihongquan@gbd.edu.vn 12/22/2017 302 Hệ thống xác định vi sinh vật API-20E (bioMerieux, Inc) | buihongquan@gbd.edu.vn 12/22/2017 303 | buihongquan@gbd.edu.vn Tổng số vi khuẩn hiếu khí  Định nghĩa:  Vi khuẩn hiếu khí: Vi khuẩn phát triển và hình thành khuẩn lạc trong điều kiện có ôxi phân tử.  Chỉ tiêu tổng vi khuẩn hiếu khí trong thực phẩm là tổng số khuẩn lạc mọc được trên đĩa petri chứa môi trường thạch chuẩn cho vi khuẩn như PCA, sau khi ủ ở thời gian và nhiệt độ xác định (tùy tiêu chuẩn, thường là ủ 72 giờ ở nhiệt độ 30oC). 12/22/2017 305 | buihongquan@gbd.edu.vn Tổng số vi khuẩn hiếu khí  Các tên gọi:  Tổng số vi khuẩn hiếu khí: theo TCVN  Tổng số (khuẩn lạc) đếm được trên đĩa (TPC:Total Plate Count)  Tổng số (khuẩn lạc) hiếu khí đếm được trên đĩa (APC: Aerobic Plate Count)  Tổng số vi sinh vật sống (TVC: Total Viable Count)  Số đếm đĩa chuẩn (SPC: Standard Plate Count) 12/22/2017 306 | buihongquan@gbd.edu.vn Tổng số vi khuẩn hiếu khí Ý nghĩa: • Là chỉ tiêu đánh giá mức độ vệ sinh thực phẩm. • Thực phẩm có đạt số tổng vi khuẩn hiếu khí dưới 1 mức cụ thể theo tiêu chuẩn thì mới được sử dụng. Còn không thì là thực phẩm không hợp vệ sinh,cần loại bỏ hoặc tái xử lý. • Có thể nhiễm trong nguyên liệu, chế biến, bảo quản. • Đánh giá chất lượng thực phẩm (khả năng hư hỏng, thời gian bảo quản). 12/22/2017 307 | buihongquan@gbd.edu.vn 12/22/2017 308 Chỉ tiêu tổng vi khuẩn hiếu khí trong một số sản phẩm sữâ (CFU/ml) Tên sản phẩm Sữâ bột cho trẻ êm dưới 12 tháng tuổi Sữâ bột Sữâ đặc có đường Sữâ tươi tiệt trùng Chỉ tiêu 104 5.104 104 101 Qui định của Bộ Y tế - 2002 Tổng vi khuẩn hiếu khí | buihongquan@gbd.edu.vn  Nguyên tắc:  Đếm số khuẩn lạc mọc trên môi trường dinh dưỡng từ 1 lượng mẫu xác định trên cơ sở xem mỗi khuẩn lạc được hình thành từ một tế bào.  Kết quả được biểu diễn dưới dạng số đơn vị hình thành khuẩn lạc (CFU: Colony Forming Unit) trong một đơn vị khối lượng (thể tích) thực phẩm (CFU/g hoặc CFU/ml). 12/22/2017 309 Tổng vi khuẩn hiếu khí | buihongquan@gbd.edu.vn  Môi trường:  Plate Count Agar (PCA)  Dịch pha loãng: Saline peptone water (SPW):  8,5 gam NaCl và 1 gam pepton trong 1000ml nước. Có tác dụng pha loãng mẫu và ít ảnh hưởng tới sinh lý tế bào vi sinh vật. 12/22/2017 310 Tổng vi khuẩn hiếu khí | buihongquan@gbd.edu.vn  Phương pháp thực hiện  Đồng nhất mẫu  Pha loãng mẫu  Chuyển mẫu vào môi trường nuôi cấy  Ủ (30oC trong 72 giờ)  Đếm khuẩn lạc 12/22/2017 311 Tổng vi khuẩn hiếu khí | buihongquan@gbd.edu.vn Đồng nhất mẫu Nếu là mẫu lỏng thì lắc trộn đều. Nếu là mẫu rắn thì cắt nhỏ bằng kéo, dao vô trùng trên khay vô trùng. 10g mẫu + 90ml Saline Peptone Water, đồng nhất mẫu bằng stomacher trong 30 giây, mục đích để trộn đều mẫu, phân bố vi sinh vật đều trong dịch mẫu  mẫu đã được pha loãng 10 lần (tới đậm độ 10-1) 12/22/2017 312 | buihongquan@gbd.edu.vn Máy đồng nhất mẫu 12/22/2017 313 | buihongquan@gbd.edu.vn Pha loãng mẫu 12/22/2017 314 Mẫu ban đầu, sau khi đồng nhất có nồng độ pha loãng 10-1 10-1 101 10-2 102 10-3 103 10-4 104 Pha loãng Độ pha loãng 10-5 105 Độ pha loãng cuối | buihongquan@gbd.edu.vn Đĩa petri vô trùng PCA 45oC Khoảng 15 ml Dung dịch mẫu đã pha loãng 1 ml Lắc đều đĩa petri Để nguội Ủ 30oC/3 ngày Đếm số khuẩn lạc và tính kết quả 12/22/2017 315 | buihongquan@gbd.edu.vn Mẫu lỏng: 100 10-1 10-2 10-3 1ml 1ml 1ml TNTC 456 178 10-4 1ml 19 1ml Đem ủ 12/22/2017 316 | buihongquan@gbd.edu.vn 100 10-1 10-2 10-3 1ml 1ml 1ml Đọc kết quả 1ml Đem ủ 12/22/2017 317 | buihongquan@gbd.edu.vn Đếm kết quả chỉ tiêu  Đếm tất cả khuẩn lạc mọc trên môi trường  Khuẩn lạc mọc loang dưới 1/3 đĩa tính là 1 khuẩn lạc  Chọn đĩa có số khuẩn lạc 25 – 250 để tính kết quả  N: Tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa  ni: số đĩa tại mỗi nồng độ  V: thể tích cấy vào đĩa (=1 ml)  fi: độ pha loãng  Đơn vị là CFU/g hoặc CFU/ml 12/22/2017 318 iii fVnfVn N A   ...111 | buihongquan@gbd.edu.vn Đếm kết quả  Ví dụ: trong một trường hợp tính mẫu cụ thể Nồng độ pha loãng Kết quả 10-3 10-4 Đĩa 1 235 26 Đĩa 2 246 36 Đĩa 3 198 14 12/22/2017 319 (CFU/g) ...111 iii fVnfVn N A   5102,3 0001,012001,013 3626198246235    A | buihongquan@gbd.edu.vn  Nếu ở nồng độ pha loãng cao nhất, số khuẩn lạc đếm được trên 1 đĩâ lớn hơn 250  ví dụ ở nồng độ 10-5 số đếm được lớn hơn 250, kết quả được ghi: >2,5x107 CFU/g.  Nếu ở độ pha loãng thấp nhất, số khuẩn lạc đếm được trên 1 đĩâ nhỏ hơn 25  ví dụ ở nồng độ 10-1 số đếm được nhỏ hơn 25, kết quả được ghi: <2,5x102 CFU/g. 12/22/2017 320 | buihongquan@gbd.edu.vn Coliforms và E.coli  Định nghĩa o Coliform là nhóm trực khuẩn Gram âm, không sinh bào tử, hiếu khí hoặc kị khí tùy nghi, lên men lactose sinh acid và sinh hơi ở 37oC trong 24 – 48 giờ o Coliform chịu nhiệt = coliform + lên men lactose và sinh hơi trên mt canh EC ở 44oC trong 24 giờ. o Coliform phân = coliform chịu nhiệt + sinh indole trong canh Tryptone ở 44,5oC trong 24 giờ o E.coli = coliform phân + IMViC (++--) 12/22/2017 321 | buihongquan@gbd.edu.vn Một số chỉ tiêu Chỉ tiêu coliform và E.coli trong một số loại thực phẩm Tên sản phẩm Xúc xích Chả cá Trứng tươi Sữâ tươi tiệt trùng Coliform (trong 1g) 50 10 102 0 E.Coli (trong 1g) 3 3 3 0 12/22/2017 322 Qui định của Bộ Y tế - 4/1998 | buihongquan@gbd.edu.vn TSA ở 45oC 5 ml Dịch pha loãng 10-1 1 ml Lắc để yên 1 – 2h VRB ở 45oC 10 ml Chờ môi trường đặc , lật ngược, đem ủ 37oC trong 24 – 48 giờ Phục hồi VSV Chọn lọc KL coliform 12/22/2017 323 | buihongquan@gbd.edu.vn Khuẩn lạc coliform đặc trưng trên môi trường VRB có màu đỏ đến đỏ đậm, có quầng tủa muối mật, đường kính ≥0,5mm Đếm số khuẩn lạc đặc trưng Tính: N = tổng số kl đặc trưng trên tất cả các đĩa cấy 12/22/2017 324 | buihongquan@gbd.edu.vn Chọn 5 KL đặc trưng cấy sang 5 ống BGBL Ủ 37oC/24 – 48h Kiểm tra khả năng lên men Lactose và sinh hơi Tỉ lệ xác nhận R = (Số KL sinh hơi trong BGBL) / (Số KL đã cấy) 12/22/2017 325 | buihongquan@gbd.edu.vn Tỉ lệ xác nhận R = (Số KL sinh hơi trong BGBL) / (Số KL đã cấy) Tổng số coliform (cfu/g) R nVf N C  Tính số lượng coliform 12/22/2017 326 | buihongquan@gbd.edu.vn ĐỊNH LƯỢNG FEACAL COLIFORM (PP ĐẾM KHUẨN LẠC)  Qui trình định lượng F. coliform tương tự như qui trình định lượng coliform, chỉ khác nhau ở những điểm sau: o Ủ đĩâ môi trường VRB ở 44,0 ± 0,5oC trong 24 – 48 giờ o Cấy khẳng định vào canh EC ủ 44,0 ± 0,5oC trong 24 – 48 giờ. o Các khuẩn lạc sinh hơi trên EC được cấy qua môi trường canh Tryptone để thử nghiệm indole o Khuẩn lạc dương tính khi sinh hơi trên EC và có pư indole dương tính. 12/22/2017 327 Tỉ lệ xác nhận R = (Số KL indol (+)) / (Số KL đã cấy) R nVf N C  | buihongquan@gbd.edu.vn ĐỊNH LƯỢNG F. COLIFORM BẰNG PP MPN 12/22/2017 328 10-1 10-2 10-3 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 2.1 2.2 2.3 2.4 2.5 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 10ml LSB 1ml 1ml 1ml | buihongquan@gbd.edu.vn ĐỊNH LƯỢNG F. COLIFORM BẰNG PP MPN 12/22/2017 329 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 2.2 2.3 3.3 10ml EC 1.1 1.2 1.5 2.2 1.1 1.2 Endo/EMB Indol Kết quả 2,0,0  MPN =4.5 | buihongquan@gbd.edu.vn ĐỊNH TÍNH E.COLI 12/22/2017 330 Lấy 1g (1ml) mẫu vào 10ml môi trường BGBL Ủ ở 44 ± 0,5oC trong 24 – 48 giờ Chọn các ống sinh hơi cấy sâng Endo âgâr Mẫu không sinh hơi được xêm là âm tính với E.coli Ủ ở 37 ± 0,5oC trong 24 giờ Chọn khuẩn lạc dẹt, có ánh kim, đường kính khoảng 1mm để cấy sâng TSA hây BHI | buihongquan@gbd.edu.vn ĐỊNH TÍNH E.COLI 12/22/2017 331 Ủ ở 37 ± 0,5oC qua đêm Cấy chuyển vào các môi trường thử nghiệm sinh hóa: Canh tryptone, MR-VP, Simmon Citrate, để thử nghiệm IMViC Indol (+), MR (+), VP (-), Citrate (-) Một trong những pư trên sai thì không phải là E.coli Kết luân: phát hiện (hây không phát hiện) E.coli trong 1g (1ml) mẫu. | buihongquan@gbd.edu.vn khuẩn lạc E. coli dạng dẹt, có ánh kim, đường kính khoảng 1mm 12/22/2017 332 | buihongquan@gbd.edu.vn Staphylococcus aureus STAPHYLOCOCCUS AUREUS 12/22/2017 333 Thuộc họ Staphylococcaceae Còn gọi là Tụ cầu vàng Sống hiếu khí tùy nghi | buihongquan@gbd.edu.vn Khóa phân loài củâ S. aureus (Biological classification) Giới (Kingdom): Bacteria Nghành (Phylum): Firmicutes Lớp (Class): Bacilli Bộ (Order): Bacillales Họ (Family): Staphylococcaceae Giống (Genus): Staphylococcus Loài (Species): S. aureus 12/22/2017 334 | buihongquan@gbd.edu.vn PƯ catalase, coagulase dương tính PƯ oxidase âm tính Hầu hết có khả năng gây tan huyết (95%) Lên men tạo acid từ mannitol 12/22/2017 335 | buihongquan@gbd.edu.vn Phát triển được trên môi trường chứâ 15% NaCl Trên môi trường không chọn lọc tậo sắc tố vàng Tạo độc tố Enterotoxin bền nhiệt 12/22/2017 336 | buihongquan@gbd.edu.vn Sự phân bố trong tự nhiên  Thường tìm thấy trên da, tóc hay các nơi ẩm thấp ở người và động vật máu nóng  Các vết trầy xước hay lở loét là nơi tập trung củâ S. aureus  Nhiễm vào thực phẩm chủ yếu qua việc chế biến và sản xuất không hợp vệ sinh  Nhiệt độ 10 – 45oC, pH 4,6 – 9,3, tối ưu 37oC và pH 7 12/22/2017 337 | buihongquan@gbd.edu.vn Dấu hiệu nhiễm và các bệnh do S. aureus 12/22/2017 338 | buihongquan@gbd.edu.vn Khả năng gây ngộ độc thực phẩm  Sinh 5 độc tố ruột: enterotoxin A, B, C, D, E bền nhiệt  Viêm dạ dày ruột: ăn thức ăn bị nhiễm độc tố  Viêm ruột non – đại tràng: ăn thức ăn bị nhiễm tụ cầu với số lượng lớn (>105 vi khẩn/1g thức ăn)  Sinh độc tố gây hội chứng sốc nhiễm độc 12/22/2017 339 | buihongquan@gbd.edu.vn ĐỊNH LƯỢNG S. aureus  Nguyên tắc  Sử dụng môi trường chọn lọc để bắt những khuẩn lạc đặc trưng củâ S. aureus  Môi trường Baird Parker Agar (BPA) hoặc Chapman Agar  Khuẩn lạc đặc trưng: đường kính 0,5 – 1 mm, lồi, đen bóng có vòng trắng đục hẹp, vòng sáng rộng  Thử nghiệm sinh hóa để khẳng định  S. aureus có phản ứng coagulase dương tính – làm đông huyết tương 12/22/2017 340 | buihongquan@gbd.edu.vn QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG S. aureus 12/22/2017 341 Cấy 0,1 – 0,3 ml dung dịch mẫu (10-1) lên bề mặt môi trường Baird Parker agar, trẩi đều bằng que tam giác Ủ ngược đĩâ ở 37 ± 0,5oC trong 48 giờ Đếm số khuẩn lạc đặc trưng (N ) và t số khuẩn lạc không đặc trưng (Na) Chuyển 5 kl đặc trưng và 5 kl không đặc trưng sang mt TSA Ủ ở 37 ± 0,5oC quâ đêm KL đặc trưng của S. aureus trên mt BPA | buihongquan@gbd.edu.vn Cấy chuyền vào ống chứâ 0,3ml huyết tương Ủ ở 37 ± 0,5oC và theo dõi sau 2, 4, 6, 8 giờ. Nếu không có kết quả dương tính sẽ ủ đến 24 giờ. Xác định tỉ lệ dương tính Rt (KL đặc trưng) và Ra(KL không đặc trưng) Kết quả: số S. areus (cfu/g) )( 1 aatt RNRN nVf S  12/22/2017 342 KL đặc trưng KL không đặc trưng | buihongquan@gbd.edu.vn Thử nghiệm coagulase Mức độ đông tụ huyết tương 12/22/2017 343 Âm tính Dương tính | buihongquan@gbd.edu.vn ĐỊNH TÍNH S. aureus Nguyên tắc  Tăng sinh trong môi trường chọn lọc • Môi trường MSB (Mannitol Salt Broth): salt 7.5% ức chế Staphylococcus có coagulase (-) • Ống (+) sẽ chuyển từ màu đỏ sang vàng (S.aureus lên men mannitol  phenol red (đo ̉  vầng)  Mẫu có biểu hiện dương tính được phân lập trên môi trường chọn lọc • Môi trường BPA, TGA, Chapman agar • KL đên nhánh, sáng, tròn, lồi, đường kính 0,5 – 1 mm, có vầng sáng xung quanh  Khẳng định các khuẩn lạc nghi ngờ • Phản ứng coagulase làm ngưng kết huyết tương 12/22/2017 344 | buihongquan@gbd.edu.vn QUY TRÌNH ĐỊNH TÍNH S. aureus 12/22/2017 345 Cấy 1g (ml) vào ống nghiệm chứâ 10ml MSB Chọn ống nghiệm dương tính (mt chuyển màu vàng) cấy chuyển sang Baird Parker agar hay Chapman agar Ủ ở 37 ± 0,5oC trong 24 - 48 giờ Ủ ở 37 ± 0,5oC trong khoảng 48 giờ Chọn kl đặc trưng cấy chuyển sâng TSA MSB (+) (-) BPA TSA KL đặc trưng | buihongquan@gbd.edu.vn TSA 1 ống (+) Tất cả (-) Phát hiện Không Phát hiện Ủ ở 37 ± 0,5oC qua đêm Cấy vào ON chứa 0,3ml huyết tương ́ Ủ ở 37 ± 0,5oC và theo dõi sau 2, 4, 6, 8 giờ. Nếu không có kết quả dương tính thi ̀ ủ đến 24 giờ. ̀ Kết quả: S. aureus (+) khi có ngưng kết huyết tương Kết luận: phát hiện/không phát hiện S. aureus ́ ̀ 12/22/2017 346 | buihongquan@gbd.edu.vn 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 2.1 2.2 2.3 2.4 2.5 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 10ml MSB 10-1 10-2 10-3 1ml 1ml 1ml ĐỊNH LƯỢNG S. aureus BẰNG PP MPN 12/22/2017 347 | buihongquan@gbd.edu.vn 1.1 1.2 1.3 2.1 2.4 1.1 1.2 1.3 2.2 BPA 2.4 MSB Chọn những ống MSB chuyển màu vàng 12/22/2017 348 | buihongquan@gbd.edu.vn 1.1 1.2 1.3 2.2 1.1 1.2 BPA Huyết tương 2.4 2.4 Bắt khuẩn lạc đặc trưng trên BPA Thử nghiệm Coagulase 12/22/2017 349 | buihongquan@gbd.edu.vn Đọc kết quả thử nghiệm coagulase 10-1 10-2 10-3 1 1 0 4 MPN/g Kết quả MPN 12/22/2017 350 | buihongquan@gbd.edu.vn Faecal Streptococcus  Định nghĩâ  Là các liên cầu khuẩn có nguồn gốc từ phân  Hình cầu hay hình oval kéo dài, gram dương  Không di động, không sinh bào tử, một số dòng có tạo vỏ nhầy  Hầu hết sống hiều khí tùy ý nhưng phát triển tốt trong điều kiện kỵ khí  Tiết bacteriocin trong quá trình tăng trưởng 12/22/2017 351 | buihongquan@gbd.edu.vn Chuẩn bị dịch pha loãng 10-1, 10-2, 10-3 Trải lên MT mEnterococcus agar (SLANETZ and BARTLEY agar) ủ 37oC, 48 giờ Đếm tất cả KL đặc trưng (đo ̉, hòng) ̉ ̀ Cấy 5 khuẩn lạc đặc trưng vào TSA ủ ở 37oC, 24 giờ Khẳng định (+): Chịu muối 6,5%, chịu pH ở 9,6 (+) Catalase (-); Oxydase (-) Tỉ lệ khẳng định Mật độ Streptococcus phân (CFU/g hay CFU/ml) ̉ ̀ Khuẩn lạc có màu hồng đến đỏ đậm Phương pháp đếm KL (màng lọc) 12/22/2017 352 | buihongquan@gbd.edu.vn Dịch pha loãng 10-1, 10-2, 10-3 canh Azide Glucose (9 ống) thạch Bilê Esculinê Thử nghiệm câtâlâsê AG (+), BE (+), Catalase (-) Trâ bảng MPN Mật độ Streptococcus phân (MPN/g hay MPN/ml) (+) (+) (-) (+): màu MT: tím → vàng có cặn (+) Không phân hủy H2O2 Phương pháp MPN 12/22/2017 353 | buihongquan@gbd.edu.vn Clostridium spp.  Trực khuẩn Gram (+)  Sinh bầo tử, ky ̣ khi ́  Hầu hết thuo ̣c nhóm ưâ nhiê ̣t vừa va ̀ ưâ nhiê ̣t, số ít ưâ lậnh  Khử sulfite thầnh sulfide tậo mầu đên  Mo ̣ t số gây bê ̣nh ở người, mo ̣ t số gây hư hỏng thực phẩm. 12/22/2017 354 | buihongquan@gbd.edu.vn Quy trình phaân tích Clostridium  Chọn 2 nồng độ phâ loãng thích hợp. Cho 1ml dung dịch phâ loãng (mỗi nồng độ 2 ống) vào ống nghiệm có chứâ môi trường Wilson Blâir cải tiến (Bismuth sulfite agar) làm nguội ở 45oC. Cho thêm 2ml dung dịch Nâ2SO3 và 5 giọt phèn sắt 5%. Tiếp tục làm như sâu:  Lắc đều  Đun cách thủy 75oC, 15 phút  Làm đông nhânh  Bổ sung thêm vào ống nghiệm một lớp môi trường Wilson Blâir cải tiến đa ̃ làm nguội ở 45oC. Làm đông nhânh.  Ủ 37oC, 18 – 24 giờ  Đọc kết quả:  Đếm tất cả các khuẩn lạc đặc trưng củâ Clostridium (tròn, đen). 12/22/2017 355 | buihongquan@gbd.edu.vn Môi trường Sulfite polymyxin sulfadiazin (SPS) agar Nhận biết Clostridium perfringens 12/22/2017 356 | buihongquan@gbd.edu.vn Nhận biết Clostridium perfringens Môi trường Sulfite polymyxin sulfadiazin (SPS) agar 12/22/2017 357 | buihongquan@gbd.edu.vn Nhận biết Salmonella spp. 12/22/2017 358 | buihongquan@gbd.edu.vn Cấy chuyển vào môi trường thử nghiệm sinh hoá: KIA, Mannitol Phenol Red Broth, Urea Broth, Lysine Decarboxylase Broth, Tryptone Broth (37.0  0.50C/24h) Cân 25g mẫu + 225g BPW, đồng nhất (Ủ ở 37.0  0.5oC trong 16 - 24 giờ) Cấy phân lập sâng XLD agar (37.0  0.50C/24h) Chọn KL hòng đo ̉ trong suót, có/không có tâm đên ̣ ̀ ̉ ́ ́ ́ Cấy 0.1ml sang ON chứâ 10ml Selenite Cystein Broth (37.0  0.50C/24 giờ) Cấy 0.1ml sang ON chứâ 10ml RV Broth (41.5  0.50C/24h) Cấy phân lập sâng SS agar (37.0  0.50C/24h) Chọn KL trong suót, có/không có tâm đên ̣ ́ ́ ́ ̣ ̀ ̉ ́ ́ ́ ̣ ́ ́ ́ 12/22/2017 359 | buihongquan@gbd.edu.vn Phát hiện (không phát hiện) Salmonella / 25g Biểu hiện củâ Sâlmonêllâ: trên KIA: đỏ/vàng / H2S (+) / gas (+); Urea (-); Mannitol (+); Indol (-); LDC (+); ̉ Mẫu có Salmonella khi:  Làm đục môi trường tăng sinh  Tạo khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường phân lập: khuẩn lạc tròn, hơi lồi trong, bờ đều có đường kính khoảng 2 – 4mm, đôi khi có tâm đên. Trực khuẩn Grâm âm  Có tính di động: Trên môi trường MIU Salmonella mọc lân khỏi đường cấy thẳng  Lactose (-): giữ nguyên màu đỏ củâ phần nghiêng  Glucose (+): phần đáy đổi màu từ đỏ sâng vàng  Dihydrosulfide (+): các khuẩn lạc Salmonella có màu đen  Urease (-): làm biến màu môi trường từ đỏ sâng vàng  Indole (-): không làm đỏ thuốc thử 12/22/2017 360 | buihongquan@gbd.edu.vn Nhận biết Salmonella spp. Môi trường Xylose Lysine Desoxycholate Agar (XLD) 12/22/2017 361 | buihongquan@gbd.edu.vn Nhận biết Salmonella spp. Môi trường Kligler Iron Agar (KIA) +  Đối chứng Salmonella 12/22/2017 362 | buihongquan@gbd.edu.vn Nhận biết Salmonella spp. Môi trường Urea Broth âm tính  Salmonella  + Salmonella Đối chứng +  12/22/2017 363 | buihongquan@gbd.edu.vn Nhận biết Salmonella spp. Môi trường Lysine Decarboxylase Broth + Salmonella Proteus 12/22/2017 364 | buihongquan@gbd.edu.vn Nhận biết Salmonella spp. Salmonella Phản ứng Indole âm tính  Salmonella Đối chứng +  12/22/2017 365 | buihongquan@gbd.edu.vn Phản ứng Voges-Proskauer (VP) âm tính  Salmonella Thuốc thử VP +  Đối chứng Đối chứng Nhận biết Salmonella spp. Đỏ tươi Đỏ đồng +  12/22/2017 366 | buihongquan@gbd.edu.vn Nhận biết Bacillus cereus 12/22/2017 367 | buihongquan@gbd.edu.vn Đặc điểm của Bacillus cereus  Trực khuẩn Gram (+)  Hiếu khí hay kị khí tùy nghi  Tậo no ̣ i bầo tử  Đi đo ̣ng  Lên men glucose sinh hơi  Nitratase (+), VP (+)  Sinh trưởng trong khoẩng 5-500 C, pH 4.5-9.3  Tiết 2 loậi toxin chińh: diarrhoeal toxin (gây tiêu chẩy) và emetic toxin (gây nôn mửa)  Hiê ̣n diê ̣n trong đất, bụi, sữa, thiṭ, rau quẩ, gia vi,̣ sp khô 12/22/2017 368 | buihongquan@gbd.edu.vn Quy trình phân tích B. cereus (MPN) Chọn khuẩn lạc có màu hồng eosin, lecithinase (+) cấy sang TSA hây BHI, ủ 30oC/24h Lấy 10g mẫu đồng nhất vào 90ml pêptonê đệm, được 10-1 Chọn ống (+), cấy PL sang MYP, ủ 37 0.5oC/24-48h Pha loãng mẫu 10-2, 10-3, 10-4 Cấy 1ml dd 10-2, 10-3, 10-4 vào 10ml TSP, mỗi nồng độ 3 ống lặp lại, ủ 30oC, 30h ́ XĐ số ống (+) (đục) ở mỗi độ phâ loãng ̣ Cấy thử sinh hoá: phenol red glucose broth, gram, nitrate broth, VP, Tyrosine agar, Lysozyme broth Kết luận B.cereus: glucose (+), nitratase (+), VP (+), tyrosine (+), lysozyme (+) ́ ̣ 12/22/2017 369 | buihongquan@gbd.edu.vn Nhận biết Bacillus cereus Môi trường Mannitol – Egg – Yolk polymyxin (MYP) 12/22/2017 370 | buihongquan@gbd.edu.vn Nhận biết Bacillus cereus Lên men glucose : dương tính  Bacillus +  Đối chứng + + 12/22/2017 371 | buihongquan@gbd.edu.vn Phản ứng Voges-Proskauer (VP) dương tính  Bacillus Thuốc thử VP + Đối chứng +  Nhận biết Bacillus cereus 12/22/2017 372 | buihongquan@gbd.edu.vn Nhận biết Bacillus cereus Môi trường nitrate broth 12/22/2017 373 | buihongquan@gbd.edu.vn Vibrio spp. Hình que/dấu phẩy, Gram (-) Di đo ̣ng, kỵ khí tùy nghi  Catalase (+), oxydase (+)  Lên men glucose nhưng ko sinh hơi, không sinh H2S  Tất cẩ cấc loầi đều cần muói để tăng trưởng (trừ V.cholerae) 12/22/2017 374 | buihongquan@gbd.edu.vn Nhận biết Vibrio  25g Mẫu + 225 mL nước APW (alkaline peptone water) 10-1 , ủ 35 ± 20C, 18-24h  Cấy phân lâ ̣p trên TCBS âgâr, ủ 35 ± 20C, 18-24h  Chọn KL đâ ̣c trưng:  V.cholerae: vầng, hơi dệt, bóng, 2-3mm, tâm đục, rìa trong  V. parahaemolyticus: tròn, xanh lấ, đục, 2-3 mm  V. alginolyticus: lớn, vầng, đục Cấy lên TSA, ủ 35C, 24h ròi mang thử phẩn ứng sinh hóa  khẩng điṇh Vibrio 12/22/2017 375 | buihongquan@gbd.edu.vn 12/22/2017 376 | buihongquan@gbd.edu.vn 1. Acid Nucleic 1.1. Cấu trúc Acid Nucleic:  Acid Nucleic là vật chất mang thông tin di truyền, có cấu tạo là một polymer với monomer là các Nucleotide. Acid Nucleic gồm hai loại là ARN và ADN.  Nucleotide: Là cấu trúc cơ bản của Acid Nucleic. Một Nucleotide gồm 3 thành phần:  Nhóm Phosphate  Đường pentose(5C)  Bazơ nitơ. 12/22/2017 378 | buihongquan@gbd.edu.vn 1. Acid Nucleic • Bâzơ nitơ gồm hâi nhóm: ▫ Nhóm Purin: gồm Adêninê (A), Guanine (G) ▫ Nhóm Pyrimidin: gồm Thyminê (T), Cytosine (C) và Uracil (U) • Các Nuclêotidê khác nhâu chỉ khác nhâu ở nhóm bâzơ nitơ, do đó có 5 loại Nuclêotidê sẽ mâng tên củâ 5 loại bâzơ nitơ • Trong phân tử Acid Nuclêic, các Nuclêotidê nằm kề nhâu liên kết với nhâu bằng liên kết photphodiêstêr tạo thành chuỗi dài. Trình tự chính xác củâ các bâzơ trong ADN và ARN đặc trưng cho thông tin di truyền củâ tế bào và cơ thể. 12/22/2017 379 | buihongquan@gbd.edu.vn 12/22/2017 380 | buihongquan@gbd.edu.vn 1. Acid nucleic 1.2. ADN (Acid Deoxyribonucleic) Cấu trúc:  Ptử ADN là một chuỗi xoắn kép, gồm hai sợi đơn. Mỗi sợi đơn là một chuỗi Nucleotide. Có 4 loại Nucleotide: A, T, G, C.  Hai sợi đơn lk với nhau bằng liên kết hydro theo nguyên tắc bổ sung: A – T =2 lk H2, G - C = 3 lk H2.  Mỗi sợi đơn có một trình tự định hướng: một đầu 5’ mang nhóm Phosphate tự do, một đầu 3’ mang nhóm OH tự do (quy ước là 5’ ->3’).  Hai sợi đơn hướng song song và ngược chiều nhau (antiparallel). Mỗi mạch đơn (ssDNA) mang trình tự các bâzơ khác nhau-> mang thông tin di truyền khác nhau 12/22/2017 381 | buihongquan@gbd.edu.vn Chuỗi xoắn kép DNA 12/22/2017 382 | buihongquan@gbd.edu.vn 12/22/2017 383 | buihongquan@gbd.edu.vn 12/22/2017 384 | buihongquan@gbd.edu.vn 1. Acid NUCLEIC 1.2. ADN (Acid Deoxyribonucleic) Đặc tính của DNA  Biến tính: là khả năng sợi kép DNA trong điều kiện nhiệt độ cao gần điểm sôi hoặc pH < 3 hay trên 10 có thể sẽ tách rời thành 2 sợi đơn  Hồi tính: Sau khi DNA bị biến tính, nếu điều kiện trên quay lại trạng thái ban đầu một cách từ từ thì 2 sợi đơn này lại có thể ghép bổ sung thành sợi kép ban đầu (hồi tính)  Ứng dụng: lai DNA và PCR. 12/22/2017 385 | buihongquan@gbd.edu.vn 1. Acid Nucleic 1.2. ADN (Acid Deoxyribonucleic) Cấu trúc ADN của sinh vật Eucaryote: • Dạng mạch thẳng (Prokaryote: mạch vòng) • ADN kết hợp chặt chẽ với Pr histone. • Nến châ ̣ t trong nhâ n ở nhiều mức độ: nucleosome -> NST • ADN gồm những trình tự mã hóa (exon) xen kẽ với những TT ko mã hóa (intron). Tùy mức độ hiện diện trong nhân -. Chia 3 loại ▫ Các TT lặp lại nhiều lần: chiếm 10-15% genome. Là những TT AND ngắn (10-200kb), ko mã hóa, tập trung ở những vùng chuyên biệt/NST (tâm động, đầu mút NST) ▫ Các TT lặp lại TB: 25-40%, là những đoạn AND có kt lớn hơn (100-1000kb). Không mã hóa hoặc mã hóa cho rARN, tARN, 5SARN ▫ Các TT duy nhất: là các gen mã hóa cho các Protein, có TT đặc trưng cho từng gen 12/22/2017 386 | buihongquan@gbd.edu.vn Vai trò của ADN:  ADN là nơi lưu trư các thông tin di truyền, thâm giâ vào cấu trúc nhiễm sắc thể.  Có khả năng truyền đạt thông tin di truyền cho thế hệ sâu thông quâ sự sâo chép (tái bản) và phân ly trong phân bào.  Có khả năng phiên mã tạo râ các phân tử ARN, từ đó dịch mã để tạo nên các Protêin đặc thù và tạo nên tính đâ dạng củâ sinh vật. 1. Acid Nucleic 1.2. ADN (Acid Deoxyribonucleic) 12/22/2017 387 | buihongquan@gbd.edu.vn 1.3. ARN (Acid Ribonucleic)  Phân tử ARN có cấu trúc tương tự như ADN, nhưng khác biệt với ADN ở 3 điểm: Phân tử ARN là một chuỗi đơn Đường pentose củâ phân tử ARN là đường ribose Thymin được thay bằng uracil trong phân tử ARN.  Các loại ARN: mARN, tARN, rARN 12/22/2017 388 | buihongquan@gbd.edu.vn 1.3.1. ARN thông tin (mARN) • Chiếm 2 – 5%/tổng lượng ARN trong TB • Là bản sao TT củâ gen. Có vai trò trung tâm chuyển TTDT mã hóa trên phân tử ADN đến bộ máy giải mã để tổng hợp Pr tương ứng. • Kích thước sợi mARN thường dài, từ 900 – 1200 Nucleotide • Thời giân tồn tại trong tế bào rất ngắn 12/22/2017 389 | buihongquan@gbd.edu.vn 1.3.1. ARN thông tin (mARN)  SV nhân sơ: mARN là bản sao nguyên vẹn củâ gen, sau phiên mã được sd ngay làm khuôn để dịch mã tổng hợp Pr.  SV nhân chuẩn: mARN sau phiên mã từ gen trong nhân phải trải qua 1 quá trình hoàn thiện trước khi ra tế bào chất tham gia vào dịch mã: gắn mũ m7G vào đầu 5’, đuôi poly A vào đầu 3’ và ghép nối các đoạn mã hóa với nhau 12/22/2017 390 | buihongquan@gbd.edu.vn 12/22/2017 391 | buihongquan@gbd.edu.vn 1.3.2. ARN vận chuyển (tARN)  Chiếm 10-15%/tổng ARN trong TB  Là 1 mạch polyNucleotide ngắn, khoảng 75-95 Nucleotide  Cấu trúc dạng lá trẽ 3-4 nhánh (do sợi đơn tự cuộn xoắn)  Một nhánh tiếp nhận aa: đầu tận cùng là CCA. Enzym Aminoacyl-tARN synthetaza xúc tác gắn chính xác từng loại aa vào ptử tARn tương ứng. 12/22/2017 392 | buihongquan@gbd.edu.vn  Nhánh đối mã(ânticodon): mâng bộ bâ đối mã phù hợp với bộ 3 mã hóa trên mARN.  Một hoặc hâi nhánh phụ: làm tăng tính ổn định củâ mARN  Vâi trò: Vận chuyển ââ đến bộ máy giải mã để tổng hợp Pro theo mã trên mARN tương ứng. 1.3.2. ARN vận chuyển (tARN) 12/22/2017 393 | buihongquan@gbd.edu.vn 1.3.3. ARN Ribosome (rARN) • Là thành phần chính củâ Rbx, tgia vào QT giải mã • Chiếm 80%/tổng số ARN TB, chủ yếu nằm ở TBC. • Có cấu trúc mạch đơn với nhiều khúc cuộn, chứâ khoảng 100-150 Nucleotide. • Theo hệ số lắng chia rARN thành nhiều loại: ▫ Eukaryote: 28S, 18S, 5,8S và 5S. ▫ Prokaryote: 23S, 16S và 5S • Rbx gồm: 1 tiều phần lớn và một tiểu phần nhỏ (Pr + rARN) • Nhiều rRNA còn có chức năng xúc tác như enzyme. 12/22/2017 394 | buihongquan@gbd.edu.vn 395 2. Hệ gen(Genome) Khái niệm:  Genome (hệ gen): chứâ toàn bộ vật chất chứâ TTDT trong cơ thể sinh vật được mã hóa trong AND (ở một số virut là ARN). Mỗi genome chứâ tất cả thông tin cần thiết để xây dựng và duy trì cơ thể đó. 12/22/2017 | buihongquan@gbd.edu.vn 2. Hệ gen(Genome) Genome của vi khuẩn:  Kích thước nhỏ, ở dạng vòng khép kín.  Chỉ chứâ các đoạn ADN không lặp lại.  Các gen trong genome phân bố sát nhau, ít bị gián đoạn bởi các đoạn ADN không chứâ mã di truyền (intron). Các gen đều tồn tại đơn bản. Trên DNA có chứa các gen mã hóa cho một protein đặc thù Một số chứâ thêm dạng ADN khác – plasmid: kích thước bé hơn, dạng vòng, có khả năng tự nhân bản, thường chứa một số gen có tính đặc thù cao (gen kháng kháng sinh, gen chỉ thị màu). 12/22/2017 396 | buihongquan@gbd.edu.vn 2. Hệ gen(Genome) Genome của eukaryote: 99% genome nằm trong nhân TB. Phần còn lại nằm trong một số cơ quan tử (ty thể, lạp thể). 12/22/2017 397 | buihongquan@gbd.edu.vn 2. Hệ gen(Genome) Genome của eukaryote: Genome nhân: Thường có kích thước lớn (12Mb đến 120.000Mb). Phân bố trên các NST dạng thẳng. Gồm các thành phần lặp lại và các thành phần không lặp lại. Các loại ADN trong genome:  Các TT lặp lại nhiều lần: chiếm 10-15% genome. Là những TT ADN ngắn (10-200kb), ko mã hóa, tập trung ở những vùng chuyên biệt/NST (tâm động, đầu mút NST)  Các TT lặp lại TB: 25-40%, là những đoạn ADN có kt lớn hơn (100-1000kb). Không mã hóa hoặc mã hóa cho rARN, tARN, 5SARN  Các TT duy nhất: là các gen mã hóa cho các Protein, có TT đặc trưng cho từng gen 12/22/2017 398 | buihongquan@gbd.edu.vn 2. Hệ gen(Genome) Genome của eukaryote:  Phần lớn các gen phân bố trong thành phần ADN không lặp lại. Các gen chỉ chiếm một tỷ lệ rất nhỏ so với toàn bộ genome (1-2% genome). Các gen thường phân bố xa nhau và trong gen chứâ nhiều intron.  Các gen có nhiều bản sao. Các bản sao củâ một gen được xếp vào một họ gen. Mỗi gen trong họ thường hoạt động ở một thời điểm nhất định trong quá trình phát triển cá thể hay trong mô riêng biệt. 12/22/2017 399 | buihongquan@gbd.edu.vn 2. Hệ gen(Genome) Genome của eukaryote:  Kích thước của genome (ở trạng thái đơn bội - C): đặc trưng cho loài, kích thước củâ genome không tỷ lệ với mức độ tiến hóa và tính phức tạp củâ cơ thể. 12/22/2017 400 | buihongquan@gbd.edu.vn 2. Hệ gen(Genome) Genome của eukaryote: Genome ty thể: dạng mạch vòng kép, chứâ các gên mã hóâ cho rARN củâ ty thể và một số ênzymê tgiâ vào chuỗi hô hấp. Ngoài râ, ty thể còn chứâ các gên mã hóâ tRNA, Rbsvà một số Pr liên quân đến quá trình phiên mã, dịch mã, và vận chuyển các Pr khác vào ty thể từ TBC. Genome lục lạp: chứâ DNA ở dạng kép, mạch vòng, chứâ khoảng 200 gen. Các gen mã hoá cho các rARNvà tARN và các Pr cần cho hoạt động quâng hợp. 12/22/2017 401 | buihongquan@gbd.edu.vn Kích thước của genome 12/22/2017 402 | buihongquan@gbd.edu.vn Số lượng gen trong genome Loài Kích thước Genome (Mb = 10^bp) (TT mã hóa Protein(%) Số lượng gen E. Coli 4.6 90 4.288 S. cerevisiae 12 70 5.885 C. elegans 97 25 19.099 Drosophila 180 13 13.600 Human 3000 3 100.000 12/22/2017 403 | buihongquan@gbd.edu.vn 3. Gene Khái niệm gen:  Gen là một đoạn ADN mã hóa cho một sản phẩm cần thiết đối với hoạt động sống của tế bào. Gen -> protein, rARN, tARN và các loại ARN khác tham gia kiểm soát hoạt động của genome Cấu trúc gen:  Gồm hai vùng:  Vùng ADN điều khiển  Vùng mang mã di truyền 404 12/22/2017 | buihongquan@gbd.edu.vn 405 Cấu trúc của gen Vùng DNA điều khiển: nằm trước các đoạn gen mang mã, bắt đầu từ -1, gồm các vị trí: Promoter: nhận biết và liên kết với enzim RNA polymerase. Promotêr thường nằm ngây trước vị trí +1 củâ gên (vị trí Nu đầu tiên được phiên mã sâng ARN). Ở Procâryotê: nằm khoảng từ -35 -> -10, ở Eucâryotê từ -25 (-30) -> - 75(-90). Vị trí hoạt hóa (A) hoặc vị trí ức chế (O): được nhận biết bởi các Pr điều khiển, chúng có thể liên kết với AND hoặc ARN pol làm tăng cường hoặc kìm hãm hoạt động củâ gen trong sao mã 12/22/2017 | buihongquan@gbd.edu.vn 406 2. Cấu trúc của gen (tiếp) Vùng DNA mang mã di truyền: Là đoạn ADN được phiên mã sang mRNA theo chiều 5’  3’ trên sợi đâng tổng hợp (bd từ +1). Gồm:  Vùng 5’ và 3’ không dịch mã: liên quan tính bền vững củâ mRNA; tham gia kiểm soát dịch mã.. +TT không dịch mã đầu 5’ (5’UTR): tính từ Nu phiên mã đầu tiên đến bộ 3 Nu khởi đầu dịch mã (AUG hoặc GUG). + TT không dịch mã đầu 3’ (3’ UTR): tính từ một trong 3 codon dừng dịch mã đến hết trình tự kết thúc phiên mã Khung đọc mở:  Phần DNA củâ gen mã hóa tạo chuỗi polypeptide  Bắt đầu bằng một codon khởi đầu (AUG hoặc GUG) và kết thúc bằng một trong 3 mã kết thúc là UAA/UAG/UGA.  Mỗi bộ 3 Nu củâ khung đọc mở tương ứng với một codon mã hóa cho một aa.  Đọc từ đầu 5’ -> 3’, đọc theo phân tử mRNA, đọc từng mã một, đọc không chồng chéo và đọc cho đến tận mã kết thúc thì dừng lại. 12/22/2017 | buihongquan@gbd.edu.vn Cấu trúc chung của một gen 12/22/2017 407 | buihongquan@gbd.edu.vn 12/22/2017 408 | buihongquan@gbd.edu.vn So sánh Gen Prokaryote và Eukaryote Prokaryote - Promoter có TT đặc trưng TTGACA (-35) và TATAT (-10) - Trong gen ko có hoặc có ít intron - Các gen nằm gần nhau và chịu sự điều khiển chung củâ một Promoter (operon) - Phiên mã và dịch mã xảy ra đồng thời. - mARN sau phiên mã là mARN trưởng thành. - Không có tín hiệu nhận poly A và mRNA không có đầu 5’ mang mũ 7 methyl Eukaryote - Promoter có TT đăc trưng - hộp CAAT (- 75) và TATA (-25) - Các đoạn exon xen lẫn intron. - Các gen nằm xa nhau, giữâ các gen có các đoạn không mã hoá. Mỗi gen chịu sự đk củâ 1 Promoter - Phiên mã và dịch mã không đồng thời: Phiên mã trong nhân, dịch mã ngoài tế bào chất . - Chịu những biến đổi trước khi dịch mã (cắt intron và nối exon, các biến đổi tại đầu 5’ và đầu 3’) - Các dấu hiệu gắn chuỗi poly A củâ mRNA có trình tự 5’- AAUAAA-3’. Vùng này nằm ở ngay trước đầu 3’nơi bắt đầu gắn polyA, dài từ 10 đến 30 nu, tiếp theo là vùng CA, rồi đến vùng giầu GU 409 12/22/2017 | buihongquan@gbd.edu.vn Cấu trúc gen của Eukaryote 12/22/2017 410 | buihongquan@gbd.edu.vn Cấu trúc gen của Eukaryote 12/22/2017 411 | buihongquan@gbd.edu.vn 412 Cấu trúc gen của Eukaryote 12/22/2017 | buihongquan@gbd.edu.vn Cấu trúc gen của Vi khuẩn – Operon Lac 12/22/2017 413 | buihongquan@gbd.edu.vn 414 Cấu trúc gen của Vi khuẩn – Operon Lac 12/22/2017 | buihongquan@gbd.edu.vn Chức năng của gen Chức năng củâ gen thể hiện ở 3 quá trình:  Tái bản DNA.  Phiên mã tạo ra mRNA, hoặc rRNA hay tRNA.  Dịch mã hoặc sinh tổng hợp protein dựâ trên khuôn mRNA xuyên qua ribosome để lắp ráp các amino Acid nhờ các tRNA vận chuyển đến. 415 12/22/2017 | buihongquan@gbd.edu.vn Taq polymerase Các bước PCR 1 phản ứng PCR Nguyên tắc máy PCR Làm thế nào để phân lập được gen 12/22/2017 416 | buihongquan@gbd.edu.vn Giới thiệu Kary Mullis 1985  công triǹh nghiên cứu vê ̀ PCR 1993  đoật gia ̉i Nobel hóa học 12/22/2017 417 | buihongquan@gbd.edu.vn Định nghĩa  PCR- polymerase chain reaction- phản ứng chuỗi trùng hợp  Là kỹ thuật nhân bẩn các đoạn DNA đích trong mo ̣ t mấy luân nhiê ̣t (thêrmo-cyclêr) mầ không cần sự hiện diện củâ tế bào  Phản ứng PCR cho phép khuếch đại một đoạn DNA nằm giữâ 2 mồi chuyên biệt, nhờ sự hoật đo ̣ng của men DNA polymerase va ̀ mo ̣ t vầi yếu tố khấc 12/22/2017 418 | buihongquan@gbd.edu.vn Nguyên tắc • Dựâ trên sự hoạt động củâ enzyme • Sự hiện diện củâ mồi chuyên biệt • Khả năng nối dài mồi củâ enzyme polymerase (tag polymerase, Pfu polymerase) • Các Nu tự do trong môi trường 12/22/2017 419 | buihongquan@gbd.edu.vn Điều kiện của phản ứng PCR  DNA (0.01–0.1 µ g)  Primer 1 (20 pmol)  Primer 2 (20 pmol)  Tris-HCl (20 mM, pH 8.0)  MgCl2 (2 mM)  KCl (25 mM) or KCl (10 mM)  Deoxynucleotide triphosphates (50 µM cho mõi loậi dATP, dCTP, dGTP, dTTP)  DNA polymerase chịu nhiê ̣ t  Tỏng thê ̉ tích phẩn ứng lầ 50–100 µ L. 12/22/2017 420 | buihongquan@gbd.edu.vn Máy PCR 12/22/2017 421 | buihongquan@gbd.edu.vn Các bước của PCR  Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ, mỗi chu kỳ gồm 3 bước  Bước 1: Biến tính (denaturation)  94-98oC  2-5 phút  Bước 2: Gắn mồi/Bất câ ̣p (annealing)  30-65oC  20s-2’  Bước 3: kéo dài (extending)  68-72oC  20s-5’ 12/22/2017 422 | buihongquan@gbd.edu.vn 12/22/2017 423 | buihongquan@gbd.edu.vn 12/22/2017 424 | buihongquan@gbd.edu.vn Mồi (primers) • Lầ cấc mậch oligonucleotide (dầi 18-30 Nu) bổ sung với 2 vùng trên trình tự DNA • Gòm: • Mòi xuôi (forward primer/sense strand primer): gấn với mậch antisense va ̀ khởi đo ̣ng tỏng hợp DNA tậo mậch sense mới • Mòi ngược (reverse primer/antisense strand primer): gấn với mậch sense va ̀ khởi đo ̣ng tỏng hợp DNA tậo mậch antisense mới 12/22/2017 425 | buihongquan@gbd.edu.vn Thiết kế mồi (primer design)  Nguyên tắc  Trình tự củâ mồi được thiết kế sâo cho không có sự bắt cặp giữâ mồi xuôi và mồi ngược, kể cả cấu trúc kẹp tóc (replication fork)  Nhiệt độ gắn mồi củâ mồi xuôi và mồi ngược không được chênh lệch quá xâ (Không nên quá nhiều G hoặc C nối tiếp nhâu thường tỷ lệ G, C nằm trong khoảng 30%< G+C<70%))  Không nên nhiều bắt cặp sâi với DNA khuôn  Các mồi được chọn phải đặc trưng cho trình tự DNA cần khuếch đại không trùng với các trình tự lặp lại trên DNA  Trình tự nằm giữâ mồi xuôi và mồi ngược không quá lớn (<3000 tốt nhất là dưới 1000) 12/22/2017 426 | buihongquan@gbd.edu.vn Cách thiết kế mồi:  Mòi xuo i: cùng trình tự với mậch mâng mẫ góc (coding/sense strand)  Mòi ngược: cùng trình tự với mậch khuôn (template DNA/antisense)  Cách tính Tm (nhiệt độ gắn mồi) Tm = 4(G+C) + 2(A+T) Thiết kế mồi (primer design) 12/22/2017 427 | buihongquan@gbd.edu.vn Polymerase chịu nhiệt Taq-polymerase : từ Thermus aquaticus Nhiệt độ tối ưu : 72C Có hoạt tính 5'->3' polymerase Có hoạt tính têrminâl trânsfêrâsê : thêm 1 Adênosinê ở đầu 3’ củâ mạch DNA mới. Không có hoật tińh 3’-5’ exonuclease  ko có khả năng sửâ sâi (2x10-5 , 0.25% sai sau 30 chu kỳ) Sao chép ~ 2000b/min. Không sâo chép được trên 3kb Pfu-polymerase : từ Pyrococcus furiosus Nhiệt độ tối ưu : 72C Có hoạt tính 5'->3' polymerase và 3’-> 5’ êxonuclêâsê Tỷ lệ chép sâi thấp (1.5x10-6) Sao chép ~ 500b/min 12/22/2017 428 | buihongquan@gbd.edu.vn Cấc loậi DNA polymerase từ cấc loầi VSV khấc nhau 12/22/2017 429 | buihongquan@gbd.edu.vn Buffers  Có nhiều loại buffer sử dụng riêng cho từng loại enzyme.  Một số buffer chứa chất hoạt động bề mặt có thể ảnh hưởng đến các phản ứng  Nhiều loại buffer đã có sẵn ion Mg2+ 12/22/2017 430 | buihongquan@gbd.edu.vn Mg2+ và dNTPs • Mg2+ cần thiết để DNA polymerase hoật đo ̣ng. Nồng độ ion Mg2+ phụ thuộc vào loại DNA polymerase, DNA mẫu và thành phần buffer  Nồng độ ion Mg2+ cao: tińh đâ ̣c hiê ̣u giẩm  xuất hiện thêm các sản phẩm không đặc hiệu.  Nồng độ ion Mg2+ thấp: không đu ̉ DNA polymerase hoật hóa  lượng sản phẩm PCR thấp.  dNTPs là loại hóa chất kém bền  Lượng dNTP tối ưu là 200 µM of mỗi loại dNTP. Việc tăng dNTP không làm tăng đáng kể lượng sản phẩm PCR so với việc hiệu chỉnh các yếu tố khác 12/22/2017 431 | buihongquan@gbd.edu.vn Chất khác  Đối với các DNA template lớn, giàu GC thì có thể sử dụng các chất biến tính như DMSO, formamide, glycerol, and betaine trong thành phần PCR.  Tăng lượng DMSO trong PCR sẽ cần giảm nhiệt bắt mồi xuống.  Dầu khoáng 12/22/2017 432 | buihongquan@gbd.edu.vn Các chỉ tiêu ảnh hưởng đến pứ PCR 1. DNA mẫu: (100ng-1g) 2. Enzyme 3. Mồi và nhiệt độ gắn mồi (nhiệt độ lai) 4. dNTP: 20-200M/ mỗi lọâi nu 5. Nồng độ Mg++ 6. Số lượng chu kỳ phản ứng 7. Thiết bị và dụng cụ cho phản ứng 12/22/2017 433 | buihongquan@gbd.edu.vn Điện di trên gel (gel eletrophoresis)  Lầ ky ̃ thuâ ̣ t được sử dụng để tấch cấc đoận DNA (hoâ ̣c cấc đậi phân tử khấc như RNA va ̀ protein) dựa vầo kích thước va ̀ điê ̣n tićh của chúng.  DNA được đưâ vầo cấc giếng tậi mo ̣ t đầu của khói gel, 1 dòng điê ̣n sễ được đưâ vầo khói gel để kếo cấc DNA di chuyển. 1 giếng được giữ để lầm thang DNA.  DNA tích điê ̣n âm nên sễ di chuyển đến đầu mang điê ̣n dương của khói gel. Cấc đoận DNA cầng ngấn di chuyển cầng nhanh  Khi gel được nhuo ̣m bầng 1 chất nhuo ̣m liên kết với DNA, cấc đoận DNA sễ được thể hiê ̣n dưới dậng cấc dẩi (bands), mõi dẩi nầy đậi diê ̣n cho 1 nhóm cấc DNA có cùng kích thước 12/22/2017 434 | buihongquan@gbd.edu.vn 12/22/2017 435 | buihongquan@gbd.edu.vn Đọc kết quả điện di  Nhuo ̣m gel bầng chất nhuo ̣m liên kết với DNA va ̀ đâ ̣ t gel dưới đền UV  DNA sễ phất sấng, biểu hiê ̣n lầ từng dẩi sấng phân bô ́ ở những vị trí khấc nhau trên gel  Bầng cấch đói chiếu vị trí của cấc dẩi với thang DNA, kích thước tương đói của cấc đoận DNA có thể được xấc định 12/22/2017 436 | buihongquan@gbd.edu.vn Một số vấn đề thường gặp  Không có sản phẩm hoặc lượng sản phẩm quá thấp  Kiểm tra lại DNA mẫu, thao tác  Tăng thời gian kéo dài, số chu kỳ, nhiệt độ biến tính  Hạ nhiêt độ gắn mồi  Primer, buffer 12/22/2017 437 | buihongquan@gbd.edu.vn  Vệt smear kích thước lớn hơn sản phẩm mong muốn  Giảm DNA, thời gian kéo dài, số chu kỳ  Tăng nhiệt độ gắn mồi  Thay đổi nồng độ Mg2+  Tăng thời gian kéo dài nếu sp mear có kt nhỏ Một số vấn đề thường gặp 12/22/2017 438 | buihongquan@gbd.edu.vn Một số vấn đề thường gặp  Băng sản phẩm phụ rõ nét với kích thước thấp hơn sản phẩm mong muốn  Tăng nhiệt độ bắt mồi 2°C và/hoặc tăng thời gian bắt mồi  Tăng thời gian kéo dài thêm 30s.  Giảm nồng độ DNA polymerase.  Tối ưu hóa nồng độ Mg2+.  Tinh sạch DNA template  Giảm nồng độ primer.  Thiết kế cặp primer mới. 12/22/2017 439 | buihongquan@gbd.edu.vn Real-time PCR 12/22/2017 440 | buihongquan@gbd.edu.vn  PCR cô ̉ điển: khuếch đậi đoận DNA đích  điê ̣n di  đọc kết quẩ  Realtime-PCR: kết quẩ khuếch đậi được hiển thi ̣ cùng lúc với mõi chu ky ̀ nhiê ̣t phẩn ứng 12/22/2017 441 | buihongquan@gbd.edu.vn  Moät maùy luaân nhieät  Moät heä thoáng phaùt vaø ñoïc tín hieäu huyønh quang  Chöông trình vi tính ñeå theo doõi vaø phaân tích keát quaû 12/22/2017 442 | buihongquan@gbd.edu.vn Quaù trình nhaân baûn sao ADN trong moät phaûn öùng PCR Theàm phaùt hieän Pha log Pha bình nguyeân Pha chaäm S o á l ö ô ïn g A D N Trong pha Log : Qn = Q0 (E) n Qn = Soá baûn sao sau n chu kyø Q0 = Soá baûn sao khôûi ñaàu E = Hieäu suaát PCR n = soá chu kyø 12/22/2017 443 | buihongquan@gbd.edu.vn PCR coå ñieån : keát quaû chæ ñöôïc bieát sau khi taát caû caùc voøng phaûn öùng ñaõ hoaøn thaønh . A-6 = 10-6 ng A-5 = 10-5ng A-4 = 10-4ng A-3 = 10-3ng A-2 = 10-2ng A-1 = 10-1ng A1 = 1ng A-6 A-5 A-4 A-3 A-2 A-1 A1 Real-Time PCR : quaù trình nhaân baûn sao ADN ñöôïc theo doõi tröïc tieáp theo töøng chu kyø. Vôùi kyõ thuaät naøy, ADN ban ñaàu ñöôïc ñònh löôïng moät caùch chính xaùc. 12/22/2017 444 | buihongquan@gbd.edu.vn Tín hieäu huyønh quang ñöôïc ño sau giai ñoaïn keùo daøi cuûa moãi chu kyø PCR Öu ñieåm : reû, ñôn giaûn Nhöôïc ñieåm : khoâng ñaëc hieäu Phöông phaùp taïo huyønh quang duøng SYBRGreen SYBRGreen phaùt huyønh quang khi cheøn giöõa 2 maïch cuûa ADN Kích thích 490nm Phaùt quang 530nm 12/22/2017 445 | buihongquan@gbd.edu.vn Ứng dụng của PCR Tạo dòng DNA Tìm hiểu mức biểu hiện củâ gen (Reverse Transcription PCR) Chẩn đoán bệnh (củâ người, súc vật, cây cối) Phát hiện đột biến Kiểm trâ chất lượng (thực phẩm, GMO, ô nhiễm nước)  Phát hiện khác biệt giữâ các bộ gên (Đâ dạng gen): Áp dụng trong nông nghiệp để chọn lọc cây, con Dấu ấn gên (Tìm châ mẹ, thủ phạm vụ án, giải đáp những bí mật lịch sử) 12/22/2017 446 | buihongquan@gbd.edu.vn Xác định VSV bằng pp PCR  Mẫu  ly trích DNA  khuếch đậi DNA (PCR)  KQ  Ly trićh DNA:  Pha ́ vỡ TB va ̀ giẩi phóng thầnh phần bên trong (lysozyme, SDS)  Lầm sậch DNA (loậi bỏ protêin, lipid - kết tủa phân đoận, DNA nầm trong pha nước)  Tủa DNA (còn, isopropanol)  thu hòi DNA 12/22/2017 447 | buihongquan@gbd.edu.vn TÓM TẮT QUY TRÌNH THỰC HIỆN MỘT PHẢN ỨNG PCR 1. Thiết kế mồi 2. Chuẩn bị mẫu DNA 3. Phâ mix với các thành phần thêo thứ tự sâu:  H2O tiệt trùng  Buffer  dNTP tổng số  mồi xuôi  mồi ngược  taq polymerase  DNA mẫu 4. Cho vào máy lập chương trình chạy phù hợp 5. Kiểm trâ sản phẩm PCR trên gêl âgârosê với sự có mặt củâ thâng chuẩn 6. Phân tích kết quả 12/22/2017 448 | buihongquan@gbd.edu.vn