Bài giảng Sinh học phân tử - Chương 9: Đột biến gen

ĐỘT BIẾN GENE Chương 9 Đột biến gene • Mở đầu • Các loại đột biến • Nguyên nhân đột biến • Các cơ chế chống lại đột biến • Các tính trạng đột biến và protein đột biến – Đột biến sinh dưỡng ở vi sinh vật: đột biến khuyết dưỡng – Đột biến và bệnh ở người: một số bệnh đột biến ở người • Đột biến gen và ung thư • Các hệ thống chọn lọc đột biến ở vi sinh vật 33 6 ĐỊNH NGHĨA ĐỘT BIẾN GEN (MUTATION) Đột biến gen: Sự thay đổi trình tự nucleotide của gen Phân loại theo cấu trúc 1. Mất nucleotide (deletion): frameshift hay in-frame? 2. Thêm nucleotide (insertion) 3. Thay thế nucleotide: + Đồng nghĩa/ im lặng (synonymous/ silent): Không thay đổi amino acid + Sai nghĩa (missense): Thay đổi amino acid + Vô nghĩa (nonsense): Tạo stop codon 4. Đột biến phức tạp Phân loại theo chức năng 1. Đột biến mất chức năng (loss-of-function) 2. Đột biến thêm chức năng (gain-of-function) 33 7 DANH PHÁP VỀ ĐỘT BIẾN GEN (den Dunnen JT, Human Mutation 2000;15:7-12) • Adenine đầu tiên của mã khởi đầu ATG mang số +1, • “c.” để chỉ cDNA (complementary DNA) • “g.” để chỉ genomic DNA • “IVS” chỉ intron: G của GT đầu tiên trong intron mang số +1, G của AG cuối cùng trong intron mang số -1 • “p.” để chỉ protein • “del” = deletion • “ins” = insertion 1. p.E746_A750del: Đột biến mất 5 amino acid (từ glutamate 746 đến alanine 750) 2. c.218T>C: Thay T bằng C tại vị trí 218 của cDNA 3. IVS2+1G>T: Thay G bằng T tại vị trí đầu tiên của intron 2 ĐỘT BIẾN VÙNG EXON 33 8 Đồng nghĩa (silent) Sai nghĩa (missense) Vô nghĩa (nonsense) ĐỘT BIẾN MẤT NUCLEOTIDE Đột biến gen KIT trong u mô đệm đường tiêu hóa (c.1669_1674del hoặc p.W557_K558del) Bảo tồn khung đọc (in-frame mutation) 33 9 ĐỘT BIẾN MẤT NUCLEOTIDE 23 Lệch khung đọc (frameshift mutation) Gen BRCA1 trong ung thư vú: c.5335delC ĐỘT BIẾN THÊM NUCLEOTIDE Gen KIT trong bệnh u mô đệm đường tiêu hóa: c.1509_1510insGCCTAT; p.Y503_F504insAY Bảo tồn khung đọc Nhân đoạn nội tại (internal tandem duplication) 34 1 ĐỘT BIẾN THÊM NUCLEOTIDE Gen ATP7B trong bệnh Wilson: c.525_526insA Lệch khung đọc 34 2 26 ĐỘT BIẾN IM LẶNG (Gen perforin (PRF1) trong hội chứng thực bào máu: c.630C>T) NSP (Single Nucleotide Polymorphism): > 1% dân số • Hầu hết không gây bệnh • Có thể ảnh hưởng tới tính mẫn cảm với bệnh (predisposition), tính đáp ứng với thuốc (IL28B: rs12979860 liên quan với đáp ứng điều trị bằng peg- interferon/ribavirin trong viêm gan mạn do HCV), ĐỘT BIẾN SAI NGHĨA Gen HBB trong β-thalassemia (HbE): c.79G>A , p.E27K • Các đột biến làm thay đổi các amino acid quan trọng có thể gây bệnh • Nhiều trường hợp là SNP Gen PFR1 trong hội chứng thực bào máu: c.10C>T, p.R4C 34 4 ĐỘT BIẾN VÔ NGHĨA Gen P53 trong ung thư khoang miệng: c.586C>T (p.R196X) Thường làm mất chức năng protein và gây bệnh 34 5 ĐỘT BIẾN PHỨC TẠP Gen EGFR trong ung thư phổi: p.T751_I759>N 29 30 ĐỘT BIẾN MẤT CHỨC NĂNG Đột biến surfactant protein C (SP-C) trong bệnh phổi mô kẽ ở trẻ em: c.218T>C (p.I73T) 31 ĐỘT BIẾN THÊM CHỨC NĂNG • Đột biến JAK2 trong rối loạn tăng sinh tủy (đa hồng cầu, tăng tiểu cầu nguyên phát, xơ tủy) • Các đột biến tiền gen sinh ung trong ung thư (proto-oncogene) • “hotspot”: Vùng thường tập trung đột biến của gen ĐỘT BIẾN VÙNG INTRON GÂY MẤT EXON ĐỘT BIẾN VÙNG INTRON GÂY CHÈN ĐOẠN Đột biến gen BTK trong suy giảm miễn dịch nguyên phát X- linked agammaglobulinemia (Fiorini M, Human Mutation 2004) • Các đột biến mất chức năng thường phân bố khắp chiều dài của gen. • Các đột biến thêm chức năng thường tập trung hơn nhưng cũng gồm nhiều kiểu đột biến đa dạng. PHỔ ĐỘT BIẾN CỦA MỘT GEN (MUTATION SPECTRUM) PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN GEN • Đột biến gen đã biết trước: Các kỹ thuật dựa trên PCR đơn thuần • Đột biến gen mới và cũ: PCR kèm giải trình tự chuỗi DNA (DNA sequencing) Bệnh phẩm Tách chiết DNA hoặc RNA PCR Giải trình tự chuỗi DNA 5’ 3’ 3’ 5’ Đoạn gen cần khuếch đại 1 Biến tính bằng nhiệt 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 2 3’ 5’ 5’ 3’ Cho mồi bắt cặp NGUYÊN TẮC PCR 3 Tổng hợp DNA 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 37 35 4 1. Khuôn mẫu (template DNA): đoạn gen mục tiêu được khuếch đại (beta-globin: 1,6 kb/3.300 Mb = 1/2.000.000) 2. Cặp mồi (primer): Khoảng 18 – 25 bp 3. Deoxynucleoside triphosphates (dNTPs): Nguyên liệu cho tổng hợp chuỗi DNA 4. Polymerase chịu nhiệt: Xúc tác phản ứng 5. Buffer: Tạo môi trường cho polymerase hoạt động (ổn định pH, nồng độ HCl và Mg++ phù hợp) CÁC THÀNH PHẦN QUAN TRỌNG CỦA PCR GENOMIC PCR VÀ RT-PCR (reverse transcriptase) 35 5 40 Genomic-PCR: • Khảo sát các exon và vùng nối exon – intron • Có thể sử dụng các bệnh phẩm bảo quản trong mô vùi nến RT-PCR (Reverse Transcriptase PCR, không phải real time PCR): • Chỉ khảo sát các exon, không khảo sát intron •Đặc biệt quan trọng trong khảo sát các gen tổ hợp (fusion gene) và biểu hiện gen •Bệnh phẩm phải được bảo quản đúng cách: Không nên dùng chống đông heparin (máu, tủy), không dùng chất bảo quản mô tươi,... Nếu muốn giữ mẫu lâu nên giữ đông lạnh từ -200C (mô đặc) hoặc trong sepasol (tế bào máu hoặc tủy) GENOMIC PCR VÀ RT-PCR 1. Tạo sản phẩm ngắn: Vài trăm bp, tối đa 5 kb 2. Thiếu “trung thực” (infidelity): Taq DNA polymerase không có hoạt tính proofreading • Phải sử dụng polymerase có hoạt tính sửa sai khi cần giải trình tự chuỗi DNA NHƯỢC ĐIỂM CỦA PCR Real-time PCR (Quantitative PCR, Q-PCR) Tinh sạch sản phẩm DNA sequencing W i l d - t y p e s e q u e n c e M u t a t e d s e q u e n c e A A A A G G T T G T T 5 5 8 5 5 9 5 6 0 L y s V a l V a l GAG GAG ATA AAT GGA AAC AAT TAT GTT TAC ATA GAC CCA ACA CAA CTT 5 6 1 G l u 5 6 2 G l u 5 6 3 I l e 5 6 4 Asn 5 6 5 G l y 5 6 6 Asn 5 6 7 A s n 5 6 8 T y r 5 6 9 V a l 5 7 0 T y r 5 7 1 I l e 5 7 2 A s p 5 7 3 P r o 5 7 4 T h r 5 7 5 G l n 576 Leu C C T T A T G A T A A G G T T G T T C C T T A T G A T C A C A A A T G G G A G T T T C C C A G A A A C A G G C T G A G T T T T G L y s V a l V a l P r o T y p A s p H i s L y s T r p G l u P h e P r o A r g A s n A r g L e u S e r P h e Điện di PHÂN TÍCH SẢN PHẨM PCR MÁY GIẢI TRÌNH TỰ DNA sequencing Vi sinh Khảo sát các đột biến kháng thuốc: 1.Virus: HBV, HCV, HIV,... 2. Vi khuẩn: lao, thương hàn, sốt rét,... Các lĩnh vực khác 1. Huyết học: CML: Kháng imatinib AML: FLT3, NPM1, RAS,... 2. Ung thư Vú: BRCA1, RAS, PI3KCA,... Phổi: EGFR Melanoma: BRAF GIST: KIT, PDGFRA Đại trực tràng: KRAS , p53,... 3. Tim mạch: Brugada syndrome (SCN5A) Idiopathic cardiac hypertrophy (sarcomere- gene mutations),Wafarin (CYP2C9, VKORC1) 4. Sản phụ khoa: Metformin/polycystic ovary syndrome (STK11) 5. Nội tiết: Tiểu đường type 2 (TCF7L2 polymorphisms) 6.Di truyền: Wilson, tăng cholesterol máu,.. 7. ... Chẩn đoán các đột biến gen •Nguy cơ bệnh: BRCA1/2 (ung thư vú), APC (đa polyp tuyến gia đình), VHL (ung thư thận), đột biến vùng precore của HBV (ung thư gan), LDLR (tăng cholesterol gia đình), • Chẩn đoán (thalassemia), bệnh: JAK2 (tăng sinh tủy), globine BTK (X-linked agammaglobulinemia), PCR VÀ DNA SEQUENCING: ỨNG DỤNG ATP7B (bệnh Wilson), khoảng 6000 bệnh đơn gen gây dị tật bẩm sinh • Tiên lượng bệnh: P53 (các loại ung thư); FLT3, NPM1 (bạch cầu cấp), IDH1 và IDH2 trong glioma, •Điều trị nhắm trúng đích phân tử: EGFR (ung thư phổi), KRAS (ung thư đại trực tràng), KIT (GIST), BRAF (melanoma) ... 45 46 ASO-PCR (Allele Specific Oligonucleotide): CHẨN ĐOÁN ĐỘT BIẾN ĐIỂM TTC Đột biến (Phe) GTC Bình thường (Val) 1 2 3 4 Băng wild-type (F-R1) Băng đột biến (F-R2) 1. 100-bp ladder 2. Mẫu bệnh nhân 3. Chứng âm 4. Chứng dương 47 ĐỘT BIẾN ĐIỂM JAK2 V617F TRONG RỐI LOẠN TĂNG SINH TỦY R2 AAG---- F R1 BỆNH THALASSEMIA ĐỘT BIẾN MẤT ĐOẠN GEN GLOBIN GÂY α-THALASSEMIA (Chong S, Clinical Chemistry 20 5 0 0 0) ĐỘT BIẾN GEN BETA-GLOBIN (HBB) TRONG β-THALASSEMIA Beta-thalassemia (c.79G>T) Beta-thalassemia: HbE (c.79G>A) Exon 1 Exon 2 Exon 3 51 Beta-thalassemia (c.124_127delTTCT) ĐỘT BIẾN GEN ATP7B TRONG BỆNH WILSON • Rối loạn di truyền lặn/ NST thường. • Lắng đọng đồng trong các mô. • Triệu chứng tâm thần, thần kinh và bệnh gan. • Đột biến trên 21 exon của gen ATP7B. p.S105X (exon 2) c.525_526insA (exon 2) p.R778L (exon 8) ĐỘT BIẾN GEN BTK TRONG X-LINKED AGAMMAGLOBULINEMIA • Rối loạn di truyền liên kết giới tính. • Không tạo được tế bào B trưởng thành, thiếu hụt kháng thể trong máu. • Dễ nhiễm trùng nặng. • Đột biến trên 19 exon của gen BTK. VAI TRÒ BTK TRONG DÒNG TẾ BÀO B ĐỘT BIẾN GEN PERFORIN (PRF1) TRONG HEMOPHAGOCYTIC LYMPHOHISTIOCYTOSIS (Weitzman S, Blood 2011) Exon 1 Exon 2 Exon 3 AT G (Voskoboinik I, Nat Rev Immunol 2006) ĐỘT BIẾN GEN UNC13D (MUNC13-4) TRONG HEMOPHAGOCYTIC LYMPHOHISTIOCYTOSIS (Gholam C, Clinical and Experimental Immunology 2011) CÁC VẤN ĐỀ VỀ ĐỘT BIẾN GEN 1. Phổ đột biến gen giữa các chủng tộc thường khác nhau • Cần nghiên cứu trên người Việt Nam • Kỹ thuật giải trình tự chuỗi DNA nên được sử dụng • Phát triển các bộ kit chẩn đoán phù hợp 2. Đột biến gây bệnh hay vô hại? • Dựa vào các nghiên cứu đã công bố (đột biến hay SNP) • Các biến thể mới (variant): Nghiên cứu chức năng • Chưa có cơ sở dữ liệu của người Việt 3. Chi phí nghiên cứu/ xét nghiệm cao 4. Vai trò quan trọng của bác sĩ lâm sàng trong chỉ định và tư vấn trước/sau xét nghiệm TÓM TẮT NHỮNG ĐIỂM CHÍNH 1. Đột biến gen gặp trong rất nhiều bệnh lý ở người. 2. Xác định đột biến gen có thể giúp cho chẩn đoán, tiên lượng, điều trị và đánh giá nguy cơ bệnh tật. 3. Đột biến gen có thể xảy ra ở exon và intron, không phải mọi đột biến đều gây bệnh. 4. Phổ đột biến mất chức năng thường phân tán, đột biến thêm chức năng nằm trong vùng “hotspot” của gen. 5. Đột biến gen thường khác nhau giữa các chủng tộc. 6. Giải trình tự DNA là phương pháp thích hợp cho việc phát hiện đột biến trên dân số nghiên cứu mới. 7. Các kỹ thuật dựa trên PCR đơn thuần không định danh được các đột biến mới.