Bài giảng Sản xuất kháng thể đơn dòng - Nguyễn Thị Kiều Oanh
Giới thiệu
• Kháng thể là protein được hệ miễn dịch sử dụng để nhận diện và trung hòa những tác nhân xâm nhiễm ngoại lai như vi khuẩn, virus, tế bào, Mỗi kháng thể chỉ nhận diện duy nhất một kháng nguyên mục tiêu của nó.
• Kháng thể đơn dòng (Monoclonal antibody - mab) là kháng thể được xác định bởi một loại tế bào miễn dịch, bắt nguồn từ một dòng tế bào duy nhất.
• Kháng thể đa dòng là kháng thể bắt nguồn từ nhiều dòng tế bào khác nhau.
55 trang |
Chia sẻ: Tiểu Khải Minh | Ngày: 17/02/2024 | Lượt xem: 148 | Lượt tải: 0
Bạn đang xem trước 20 trang tài liệu Bài giảng Sản xuất kháng thể đơn dòng - Nguyễn Thị Kiều Oanh, để xem tài liệu hoàn chỉnh bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
• Kháng thể là protein được hệ miễn dịch sử
dụng để nhận diện và trung hòa những tác
nhân xâm nhiễm ngoại lai như vi khuẩn, virus,
tế bào,Mỗi kháng thể chỉ nhận diện duy
nhất một kháng nguyên mục tiêu của nó.
• Kháng thể đơn dòng (Monoclonal antibody -
mab) là kháng thể được xác định bởi một loại
tế bào miễn dịch, bắt nguồn từ một dòng tế
bào duy nhất.
• Kháng thể đa dòng là kháng thể bắt nguồn từ
nhiều dòng tế bào khác nhau.
Kháng thể đa dòng
• Dễ sản xuất
• Tương tác KN-KT
không chuyên biệt
• Giới hạn số lượng
• Tiết kiệm thời gian
Kháng thể đơn dòng
• Đòi hỏi kĩ thuật
cao
• Tương tác KN-KT
chuyên biệt
• Không giới hạn số
lượng
• Tốn thời gian
George Kohler và César Milstein – Nobel Y-Sinh học 1984
Chọn động vật gây nhiễm, chọn kháng nguyên (Ag)
Gây đáp ứng miễn dịch
Dung hợp, tạo tế bào lai hybridoma
Sàng lọc, dòng hóa và tăng sinh hybridoma
Thu nhận, tinh chế và kiểm tra MAb
• Được nhận diện bởi MAb mục tiêu
• Có tính gây đáp ứng miễn dịch
(antigenic) mạnh
• Có cấu trúc càng giống với kháng
nguyên tự nhiên càng tốt. Hiện nay, Ag
thường được tạo ra bằng kỹ thuật
protein tái tổ hợp
• Có thể là vi khuẩn gây bệnh, virus gây
bệnh, các hapten phối hợp với protein,
vaccine thương phẩm hay là một phân
tử protein nào đó.
• Quyết định sự thành công của
quy trình
• Quyết định hiệu quả ứng dụng
của sản phẩm tạo thành
• Quyết định quy trình sản xuất
sản phẩm
(mab gắn đặc hiệu với Ag tiêm
vào)
Rabbit Rat Hamster
BALB/C
Đức, 1967
C57BL/6
Mỹ, 1982
✓ Lai cùng dòng
✓ Chuột cái
✓ 6-8 tuần tuổi
✓ “sạch tuyệt
đối”
Intravenous (i.v.): into a
vein (tiêm tĩnh mạch)
Intradermal (i.d.): into the
skin (tiêm vào da)
Subcutaneous (s.c.): beneath
the skin (tiêm dưới da)
Intramuscular (i.m): into
a muscle (tiêm cơ)
Intraperitoneal (i.p.): into the
peritoneal cavity (tiêm khoang bụng)
Phải gây đáp ứng miễn dịch khác loài
Dòng tế bào myeloma phải có nguồn gốc từ cùng
một loài với đối tượng gây ĐƯMD
Phải đi kèm tá dược (adjuvant)
▪ Với kháng nguyên là protein
▪ Tiêm 10-100 μg/chuột/ lần
▪ Tá dược thường được sử dụng là
CFA (Complete Freund’s
Adjuvant)
▪ Với kháng nguyên là tế bào
▪ Tiêm 0,5 - 5x107 tb/chuột/lần
▪ Tá dược thường được sử dụng là
ALUM (Aluminum hydroxide
gel)
Ngày Thao tác Tá dược Vị trí tiêm
0 Tiêm mũi cơ bản CFA s.c.
14 Tiêm nhắc lại lần 1 IFA s.c.
28 Tiêm nhắc lại lần 2 IFA s.c.
36 Thu serum
42 Nghỉ trước khi dung hợp (hay tiêm nhắc
lần 3)
IFA s.c.
52 Tiêm nhắc lần cuối i.v.
55 Thu tế bào lách sau khi đã xác định hiệu
giá của Ig trong huyết thanh
Ngày Thao tác Tá dược Vị trí tiêm
0 Tiêm mũi cơ bản CFA i.p.
21 Tiêm nhắc lần 1 IFA i.p.
42 Tiêm nhắc lần 2 IFA i.p.
52 Kiểm tra serum
53 ELISA
63 Tiêm nhắc lần 3 IFA i.p.
73 Kiểm tra serum
74 ELISA
84 Tiêm nhắc lần 4 IFA i.p.
94 Kiểm tra serum
95 ELISA
98 Tiêm nhắc lần cuối I,v,
101-110 Thu lách
HYBRIDOMA
• Được Köhler và Milsten (1975) khám phá khi nuôi cấy liên
tục những tế bào tiết kháng thể.
• Hybrid = lai tế bào lympho B x tế bào ung thư dòng tủy
myeloma
-oma = tumor (khối u)
• Môi trường chọn lọc HAT - hypoxanthine, aminopterin,
thymidine
• HGPRT - hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase
• TK – Thymidine kinase
Cell line Ig produced
P3-X63Ag8 (Ag8) γ1, κ
NS1/1-Ag4.1 (NS1) κ (not secreted)
Sp2/0-Ag14 (Sp2/0) None
X63-Ag8.653 (Ag8.653) none
Y3-Ag1.2.3 (Y3) - rat κ
•Kết dính tự nhiên
•Hóa chất (PEG)
•Các yếu tố vật lý (xung
điện, sóng siêu âm)
•Virus (sendai)
•Vi tiêm
• Tế bào tổng hợp purine và pyrimidin bằng 2 con đường:
• Con đường de novo cần hoạt động của enzyme dihydrofolate
reductase (DHFR)
• Con đường salvage cần enzyme HGPRTase (hypoxanthine
guanine phosphoribosyl transferase) để tổng hợp purine
• Thành phần môi trường HAT gồm Hypoxanthine, Aminopterin và
Thymidine
Cơ chế
chọn lọc
•Hybridoma được nuôi trong môi trường phát triển nhân
tạo (Bioreactor, bình roux.
•mAb được tiết bào nước nổi của dịch nuôi cấy tế bào
(supernantant cell culture)
•Nhược điểm: Nồng độ Mab thu được tương đối thấp
(0.01 – 0,5 mg/ml dịch nuôi cấy)
•Ưu điểm: Có thể sản xuất với số lượng lớn bằng hệ
thống bioreactor.
•Hybridoma được tiêm vào khoang bụng của vật
chủ (ascites)
•mAb được tiết vào dịch báng (fluid ascites)
•Ưu điểm: Nồng độ Mab thu được khá cao (1-15
mg/ml nước bang)
•Hạn chế: Đạo lí xã hội về sử dụng động vật thí
nghiệm
• 2,6,10,14 – tetramethylpentadecane
•Tách chiêt từ dầu gan cá mập
•Gây ra bệnh viêm khớp ở Rat, là mô hình nghiên cứu
bệnh viêm khớp mãn tính ở người.
•Gây ra bệnh lao da ở chuột. Là mô hình nghiên cứu
bệnh tự miễn
•Là yếu tố quan trọng trong kích thích tạo nước báng
trong khoang bụng của chuột, kích thích sự tạo MAb
•Sắc kí ái lực (affinity chromatography)
•Sắc kí trao đổi ion (ion exchange chromatography)
•Lọc gel (gel filtration)
•Sắc kí cao áp
•Kết tủa với muối ammonium sulfate hay acid caprylic
Các file đính kèm theo tài liệu này:
- bai_giang_san_xuat_khang_the_don_dong_nguyen_thi_kieu_oanh.pdf