Bài giảng Sản xuất kháng thể đơn dòng mAb

Định nghĩa - Là kháng thể kháng một kháng nguyên nào đó được tạo ra từ một dòng tế bào lymphocyte B trong điều kiện in vitro - Là kháng thể với một đặc hiệu duy nhất cho một vị trí epitope duy nhất của kháng nguyên (Milstein)

pdf54 trang | Chia sẻ: Tiểu Khải Minh | Ngày: 17/02/2024 | Lượt xem: 86 | Lượt tải: 0download
Bạn đang xem trước 20 trang tài liệu Bài giảng Sản xuất kháng thể đơn dòng mAb, để xem tài liệu hoàn chỉnh bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
SẢN XUẤT # KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG# mAb# Là kháng thể kháng một kháng nguyên nào đó được tạo ra từ một dòng tế bào lymphocyte B trong điều kiện in vitro ! Định nghĩa# Là kháng thể với một đặc hiệu duy nhất cho một vị trí epitope duy nhất của kháng nguyên (Milstein)# George Kohler và César Milstein # Nobel Y-Sinh học 1984# : Kháng thể đa dòng# Kháng thể đơn dòng# Tương tác KN-KT# không chuyên biệt# Giới hạn về số lượng# Tương tác KN-KT chuyên biệt # Không giới hạn về số lượng # Dễ sản xuất# Đòi hỏi kỹ thuật cao# Kháng thể đơn dòng# 1# 2# 3# 4# epitope# Huyết thanh # Kháng thể đa dòng# Kháng thể đơn dòng# 8 bước tạo mAb # •  Chọn động vật gây nhiễm, chọn Ag# •  Gây đáp ứng miễn dịch# •  Thu TB lách và TB myeloma# •  Dung hợp TB lách với TB myeloma# •  Sàng lọc, dòng hóa hybridoma# •  Nhân sinh khối mAb bằng phương pháp # in vitro hay in vivo# •  Tinh chế mAb# •  Thu nhận, kiểm tra mAb# (1a) Chọn động vật gây nhiễm# •  Động vật thường được sử dụng để tạo hybridoma: mouse (chuột nhắt), Sprague Dawley rat (chuột lớn), Armenian hamster, thỏ# •  Mouse là mô hình lý tưởng nhất:# đáp ứng miễn dịch mạnh# tổng hợp kháng thể nhanh# # •  2 dòng mouse lý tưởng trong công nghệ sản xuất mAb: BALB/c và C57BL/6# •  Lai cùng dòng# •  Chuột cái# •  6-8 tuần tuổi# •  “sạch tuyệt đối”# BALB/c C57BL/6# Lai tạo 1913 tại Mỹ# # Lai tạo1921 tại Mỹ# # Rat Hamster # Hệ thống chuồng chuột sạch# (1b) Chọn Ag# •  Quyết định sự thành công của quy trình# •  Quyết định hiệu quả ứng dụng của sản phẩm tạo thành # •  Quyết định quy trình sản xuất sản phẩm (mAb gắn đặc hiệu với Ag tiêm vào)# •  Được nhận diện bởi mAb mục tiêu# # •  Có tính gây đáp ứng miễn dịch (antigenic) mạnh# # •  Có cấu trúc càng giống với Ag tự nhiên càng tốt# Hiện nay, Ag thường được tạo ra bằng kỹ thuật protein tái tổ hợp.# # •  Có thể là vi khuẩn gây bệnh, virus gây bệnh, các hapten phối hợp với protein, vaccine thương phẩm hay là một phân tử protein nào đó# # # # Antigen# Các vị trí tiêm Ag# Intravenous (i.v.): into a vein (tiêm vào tĩnh mạch) # Intradermal (i.d.): into the skin (tiêm vào da)# Subcutaneous (s.c.): beneath the skin (tiêm dưới da) # Intramuscular (i.m.): into a muscle (tiêm vào cơ) # Intraperitoneal (i.p.): into the peritoneal cavity (tiêm vào khoang bụng)# (2) Gây đáp ứng MD# Phải gây ĐƯMD khác loài# Nguyên tắc 1 # Sử dụng động vật gây nhiễm là mousethì phải dùng kháng nguyên có nguồn gốc từ rat hay hamster để gây đáp ứng miễn dịch# (2) Gây đáp ứng MD# Dòng tế bào myeloma phải có nguồn gốc từ cùng một loài với đối tượng gây ĐƯMD để đảm bảo khả năng dung hợp của nó với tế bào lách# Nguyên tắc 2 # -  Tế bào lách được thu nhận từ mouse thì nên chọn dòng myeloma mouse như SP2/0 hay X63/Ag.8653# -  Tế bào lách được thu nhận từ rat thì nên chọn dòng myeloma rat như Y3/Ag1.2.3# (2) Gây đáp ứng MD# Phải có chất bổ trợ (adjuvant) đi kèm# # Nguyên tắc 3 # •  CFA (Complete Freud’s Adjuvant): nước, nhũ tương dầu, xác vi khuẩn Mycobactericum# # •  IFA (incomplete Fleud’s adjuvant): nước, nhũ tương dầu# •  ALUM (Aluminum hydroxide gel)# Tiêm 10-100µg/1 chuột/1 lần# Tá dược thường được sử dụng là CFA # Với kháng nguyên là protein# Tiêm 0,5 - 5 x107 tb/1 chuột/ 1 lần # Tá dược thường được sử dụng là ALUM # Với kháng nguyên là tế bào# Ngày# Thao tác# Tá dược# Vị trí tiêm # 0# Tiêm mũi cơ bản# CFA# s.c.# 14# Tiêm nhắc lại lần 1# IFA# s.c.# 28# Tiêm nhắc lại lần 2# IFA# s.c.# 36# Thu serum# 42# Nghỉ trước khi dung hợp # (hay tiêm nhắc lần 3)# IFA# s.c.# 52# Tiêm nhắc lại lần cuối# i.v.# 55# Thu tế bào lách sau khi đã xác định hiệu giá của Ig trong huyết thanh# Quy trình gây ĐƯMD ở mouse# Ngày# THAO TÁC# Chất bổ trợ# Vị trí tiêm# 0# Tiêm mũi cơ bản# CFA# i.p.# 21# Tiêm nhắc lần 1 # IFA# i.p.# 42# Tiêm nhắc lần 2 # IFA# i.p.# 52# Kiểm tra serum# 53# ELISA# 63# Tiêm nhắc lần 3# IFA# i.p.# 73 # Kiểm tra serum# 74 # ELISA # 84 # Tiêm nhắc lần 4# IFA# i.p.# 94 # Kiểm tra serum# 95 # ELISA # 98 # Tiêm nhắc lần cuối# i.v.# 101-110# Thu lách# Quy trình gây ĐƯMD ở rat# Xác định hiệu giá kháng thể # Pha loãng huyết thanh theo từng bậc# (1)# Bổ sung một lượng nhất định KN vào mỗi tube#(2)# Ủ - xác định độ pha loãng cao nhất vẫn cho phản ứng (trong trường hợp này là 1/16)# (3)# Undiluted serum 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 Negativecontrol Undiluted serum 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 Negativecontrol Huyết thanh ban đầu# Chứng âm # # Huyết thanh ban đầu# Chứng âm # # Chọn lọc hybridoma# Tổng hợp nucleotide# Con đường de novo (bị ức chế bởi môi trường HAT)# Con đường dự trữ (sử dụng enzyme HGPRT)# B cell# de novo# Salvage (HGPRT+)# Hybridoma# de novo # Salvage (HGPRT+)# Myeloma# de novo# Salvage # (HGPRT-)# Chết# Chết#Sống# Môi trường chọn lọc HAT# Môi trường chọn lọc HAT # Tế bào tổng hợp purine và pyrimidin bằng 2 con đường: # –  Con đường De novo cần hoạt động của enzyme dihydrofolate reductase (DHFR) # –  Con đường Salvage cần enzyme HGPRTase (hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase) để tổng hợp purine # –  Aminopterin có trong HAT ức chế hoạt tính của DHFR à tế bào phải tổng hợp nucleotide bằng con đường Salvage # –  Tế bào HGPRT(-) không có khả năng tổng hợp purine (hypoxanthine hay guanine) bằng con đường Salvage# Dung hợp tế bào lách với myeloma# Chuột đã được gây MD # Lympho B# Chuột# Dầu khoáng# Plasmacytoma (Bào tương ung thư)# Myeloma# Hybridoma# Dung hợp # Không sản xuất Ig# Có bộ máy tiết Ig# “Bất tử” trong in vitro # Sản xuất Ig# Không tồn tại lâu dài trong in vitro# Sản xuất Ig # Có bộ máy tiết Ig# “Bất tử” trong in vitro # # Immortal Tumor Of Lymphocytes# + 8 - Azaguanine# Myeloma Cells# #HGPRT-# Myeloma Cells# # Kiểm tra myeloma# (4) Các kĩ thuật dung hợp tế bào# • Kết dính tự nhiên# • Hóa chất (PEG)# • Các yếu tố vật lý (xung điện, sóng siêu âm)# • Virus (Sendai)# • Vi tiêm # Máy tạo xung điện Buồng dung hợp Tế bào trong buồng dung hợp (5a) Sàng lọc hybridoma# Dung hợp # Lympho B# Myeloma # Hybridoma# Sàng lọc # Ag# Dòng hóa# Hybridoma sản xuất Ig mục tiêu# Enzyme-Linked Immunosorbent Assay ELISA Western Blotting Immunoflorescent essay # (5b) Dòng hóa Hybridoma# (6) Nhân sinh khối MAb # •  Hybridoma được nuôi trong môi trường phát triển nhân tạo (bioreactor, bình Roux) # •  MAb được tiết vào nước nổi của dịch nuôi cấy tế bào (supenatant cell culture)# •  Nhược điểm: Nồng độ MAb thu được tương đối thấp (0,01-0,5mg/mL dịch nuôi cấy)# •  Ưu điểm: Có thể sản xuất với số lượng lớn bằng hệ thống bioreactor# (6a) Sản xuất MAb in vitro# Hệ thống bioreactor nhân sinh khối tế bào# •  Hybridoma được tiêm vào khoang bụng của vật chủ (ascites)# •  MAb được tiết vào dịch nước báng (ascites fluid)# # •  Ưu điểm: Nồng độ MAb thu được khá cao (1-15mg/ mL nước báng) # # •  Hạn chế: Đạo lí xã hội về sử dụng động vật thí nghiệm# (6b) Sản xuất MAb in vivo# Mồi chuột bằng pristane# Tiêm hybridoma vào khoang bụng (peritoneal cavity)# Thu thập nước báng (ascites fluid)# Pristane# •  2,6,10,14 - tetramethylpentadecane# •  Tách chiết từ dầu gan cá mập# •  Gây ra bệnh viêm khớp ở Rat, là mô hình nghiên cứu bệnh viêm khớp mãn tính ở người# •  Gây ra bệnh lao da ở chuột, là mô hình nghiên cứu bệnh tự miễn# •  Là yếu tố quan trọng kích thích tạo nước báng trong khoang bụng của chuột, kích thích sự tạo MAb# (7) Tinh chế protein# •  Sắc ký ái lực (affinity chromatography)# •  Sắc ký trao đổi ion (ion exchange chromatography)# •  Lọc gel (gel filtration)# •  Sắc ký cao áp # # •  Kết tủa với muối ammonium sulfate hay acid caprylic# Hệ thống sắc kí lỏng cao áp HPLC # (High pressure liquid chromatography) # Sắc ký ái lực# Mab trong liệu pháp chữa trị ung thư# Tế bào khối u# Ag ung thư# Mab kháng Ag ung thư # NK cells, Mf# ADCC # MAC # Bổ thể# Kháng thể đơn dòng gắn hạt nano (quantum dot) # Kháng thể đơn dòng gắn hạt nano (quantum dot) ứng dụng trong in vitro # KTĐD gắn quantum dot phát huỳnh quang trong nhận diện thụ thể bề mặt tế bào ung thư đại tràng# Kháng thể đơn dòng gắn hạt nano (quantum dot) ứng dụng trong in vivo # Mouse MAb Chimeric MAb Humanized MAb # Mouse Mab: toàn bộ phân tử kháng thể có nguồn gốc từ chuột# Chimeric MAb: vùng Fab từ chuột, vùng Fc từ người# Humanized MAb: 3 vùng hypervariable từ chuột, các vùng còn lại từ người # Humanization of therapeutic antibodies has reduced their immunogenicity. Ian N. Foltz et al. Circulation. 2013;127:2222-2230 Copyright © American Heart Association, Inc. All rights reserved.

Các file đính kèm theo tài liệu này:

  • pdfbai_giang_san_xuat_khang_the_don_dong_mab.pdf
Tài liệu liên quan