Bài giảng Phân tích thực phẩm - Chương 5: Phân tích protein trong thực phẩm

Vai trò của protein cho cơ thể Phân tích định lượng protein Nhóm các phương pháp xác định Protein thô Nhóm các phương pháp xác định protein hòa tan Nhóm các phương pháp xác định phi Protein CHƯƠNG 5:PHÂN TÍCH PROTEIN TRONG THỰC PHẨM TẦM QUANG TRỌNG CỦA PROTEIN Vai trò sinh học của Protein Vai trò dinh dưỡng của Protein VAI TRÒ SINH HỌC CỦA PROTEIN Protein là thành phần không thể thiếu được của tất cả các cơ thể sống. Protein là nền tảng về cơ thể và chức năng của cơ thể sinh vật. Dưới đây là một số chức năng quan trọng của protein: + Xúc tác + Vận tải + Chuyển động + Bảo vệ + Truyền xung thần kinh + Điều hòa + Kiến tạo chống đỡ cơ học + Dự trữ dinh dưỡng VAI TRÒ VÀ GIÁ TRỊ CỦA PROTID TRONG DINH DƯỠNG + Protein là hợp phần chủ yếu quyết định toàn bộ các đặc trưng của khẩu phần thức ăn. Khi thiếu protein trong chế độ ăn hàng ngày sẽ dẫn đến nhiều biểu hiện xấu: - Sức khỏe bị suy dinh dưỡng, sút cân mau, chậm lớn đối với trẻ em - Giảm khả năng miễn dịch, khả năng chống đở của cơ thể đối với một số bệnh - Gây ảnh hưởng xấu đến hoạt động bình thường của nhiều cơ quan chức năng như gan, tuyến nội tiết và hệ thần kinh - Làm thay đổi thành phần hóa học và cấu tạo hình thái của xương (lượng calci giảm, lượng magie tăng cao). - Do đó mức protein cao chất lượng tốt (protein chứa đủ các acid amin không thay thế) là cần thiết trong khẩu phần ăn cho mọi lứa tuổi. Protein là thành phần nguyên sinh chất của tế bào Protein tham gia cân bằng năng lượng của cơ thể Protein là chất kích thích ngon miệng VAI TRÒ VÀ GIÁ TRỊ CỦA PROTID TRONG DINH DƯỠNG ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN THÔ Phương pháp KjelDahl Phương pháp Dumas Nhà hóa học người Đan mạch; X Johan G.C.T. Kjeldahl (1883). Mục đích: Xác định hàm lượng nitơ tổng PHƯƠNG PHÁP KJELDAHL (1883) Phân hủy Chưng cất Chuẩn độ 8 Quy Trình PHƯƠNG PHÁP KJELDAHL (1883) Các yếu tố: + Điều kiện vô cơ hóa mẫu + Thứ tự cho mẫu và hóa chất vào bình Kjeldalh + Thiết lập nồng độ cho NaOH + Thử quá trình chưng cất là hoàn toàn + Làm mẫu trắng để loại bỏ ảnh hưởng của môi trường PHƯƠNG PHÁP KJELDAHL (1883) PHƯƠNG PHÁP DUMAS CẢI TIẾN A sample of known mass Combustion (900  o C) CO 2 , H 2 O and N 2 Nitrogen Thermal conductivity detector The nitrogen content is then measured 10 PHƯƠNG PHÁP DUMAS CẢI TIẾN + Đầu dò TCD chứa một dây tóc được đốt ở một nhiệt độ nhất định. + Trong điều kiện bình thường có một dòng nhiệt ổn định từ dây tóc đến detector. Tạo ra thế ổn định. + Khi có một chất được rữa giãi từ cột, thì lập tức độ dẫn nhiệt của cột bị giảm, dây tóc nóng lên làm điện trở thay đổi. Detector TCD + Sự t hay đổi điện trở này thường được cảm nhận bởi một mạch cầu Wheatstone mà từ đó sinh ra một sự thay đổi điện áp . + Để xác định hàm lượng khí Nito của mẫu người ta so sánh mức độ thay đổi điện áp của nó với sự thay đổi điện áp của mẫu thực phẩm có chứa hàm lượng nito xác định (chất chuẩn). Từ đó tính ra hàm lượng protein. PHƯƠNG PHÁP DUMAS CẢI TIẾN 13 CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH PROTEIN HÒA TAN Phương pháp Lowry Phương pháp BCA Phương pháp Braford Phương pháp phổ UV Nồng độ protein được xác định, trong đó có chứa các gốc phenol như tyrosine bằng cách cho phản ứng với hợp chất màu phenol Folin-Ciocalteu, phản ứng kép tạo phức đồng. Phản ứng gồm hai bước: Cu 2+ tạo phức với các liên kết peptide trong protein ở pH kiềm. Phức hợp protein-Cu 2+ sẽ xúc tác cho phản ứng oxy hóa các nhóm phenol có trong tyrosine hay trytophan bằng thuốc thử Folin-phenol : (Na 2 MoO 4 + Na 2 WO 4 + H 3 PO 4 trong phenol) tạo phức hợp có màu xanh dương đậm hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 750nm Nguyên Tắc: PHƯƠNG PHÁP LOWRY (1951) PHƯƠNG PHÁP LOWRY (1951) + Các acid mạnh và muối ammonium sulphat ảnh hưởng lên phản ứng. + Thường dùng BSA làm chất chuẩn + Thành phần acid amin ảnh hưởng đến sự phát triển màu trong phản ứng LOWRY (để dựng đường chuẩn nên dùng các protein có cấu trúc tương tự để có kết quả chính xác.) + Những biến đổi của hóa chất, nhiệt độ, và thời gian đòi hỏi phải dựng đường chuẩn mỗi lần khi tiến hành. + Độ nhạy cao: cho phép xác định từ 10 - 200 µg of protein, bước sóng hấp thụ trong khoảng : 500 - 750 nm PHƯƠNG PHÁP LOWRY (1951) + Sự hiện hiện của 5 acid amin có tính khử (tyrosine, tryptophan, cysteine , histidine, and asparagine) trong chuổi peptide hay trong mạch protein sẽ làm tăng cường độ màu của sản phẩm khử, làm cho cần bằng chuyển dịch về phía phải. PHƯƠNG PHÁP LOWRY (1951) Thuốc thử Lowry A  21,2 g natri cacbonat (2% w / v)40 ml 1 N NaOH (hoặc 4,0 g NaOH; dung dịch 0,1N )Thêm nước cất hoặc nước khử i-on vào 1 lít . Pha ngay khi dung Thuốc thử Lowry B  0,5 g CuSO 4 .5 H 2 O (0,5% V ) 1 g Natritartrate (1% V ) Pha định mức 100ml  Lowry thuốc thử C (1 N Folin thuốc thử phenol)Pha loãng 2 N Folin phenol (Sigma, Fisher, hoặc VWR) với một lượng nước tương đương .Chuẩn bị ngay trước khi sử dụng. Lowry thuốc thử D (thuốc thử A và B kết hợp)Trộn 1 thể tích thuốc thử B và 50 thể tích thuốc thử A . Chuẩn bị ngay trước khi sử dụng. T huốc thử Lowry D ’ Thêm 2 ml dung dịch 10% sodium dodecyl sulfate vào nước khử ion định mức 100ml. C huẩn bị ngay khi dùng  PHƯƠNG PHÁP LOWRY (1951) 0 1 2 3 4 M 1 M 2 DD chuẩn 0,1 mg/ml 0 0,5 1 1.5 2 Maul 0,5 0,5 DD thuốc thử D 1 1 1 1 1 1 1 Lắc kỹ - để yên 10 phút ở nhiệt độ phòng DD thuốc thử C 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 Lắc kỹ - để yên 30 phút ở nhiệt độ phòng Nước cất khử ion 3.5 3 2.5 2 1.5 3 3 C mg/ml 0 0.01 0.02 0.03 0,04 ? ? PHƯƠNG PHÁP LOWRY (1951) * BCA = 2,2'-Bicinchoninic Acid or 4,4'-Dicarboxy-2,2'-biquinoline . Cu 2+ bị khử bởi các liên kết peptide cho ra Cu + . Hai phân tử BCA sẽ tạo phức Bicinchoninic acid với Cu + , phức màu tím, hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 562nm * Nguyên Tắc: PHƯƠNG PHÁP BCA (1985) + Phương pháp này có độ nhạy gấp 100 lần so với phương pháp biure, ngưỡng phát hiện tương đối lớn từ 20- 2000 µg. + Các hợp chất như đường khử và amoniac có ảnh hưởng đến quá trình PHƯƠNG PHÁP BCA (1985) PHƯƠNG PHÁP BCA (1985) 0 1 2 3 4 M 1 M 2 DD chuẩn 0,1 mg/ml 0 0,5 1 1.5 2 Mẫu 0,5 0,5 DD thuốc thử BCA 2 2 2 2 2 2 2 Lắc Vortex Nước cất khử ion 3 2.5 2 1.5 1 2.5 2.5 Để yên 30 phút ở nhiệt độ 37 0 C, làm lạnh ở nhiệt độ phòng C mg/ml 0 0.01 0.02 0.03 0,04 ? ? Đo độ hấp thụ ở bước sóng 562nm PHƯƠNG PHÁP BCA (1985) PHƯƠNG PHÁP BRADFORF (1976) Nguyên tắc: Trong môi trường H+ Protein kết hợp với Coomassie (Coomassie Brilliant Blue G - 250) tạo ra phức màu xanh, có khả năng hấp thu bức xạ ở bước sóng 595nm. Cường độ màu tỷ lệ với nồng độ protein trong dung dịch. Từ phương trình đường chuẩn ta tính được hàm lượng protein. Chuẩn protein 2mg/ml BSA (Bovine serum albumin) Mẫu protein Vật liệu và cách tiến hành Thuốc nhuộm Coomassie + 100mg Coomassie Brilliant blue G-250 + 50ml etanol 95% + 100ml acid phosphoiric 85% Thuốc thử được hòa tan bằng etanol sau đó pha loãng bằng nước khử ion PHƯƠNG PHÁP BRADFORF (1976) 0 1 2 3 4 5 M 1 M 2 DD chuẩn 1000µg/ml 0 1 2 3 4 5 Mẫu 2 2 DD Coomassie 5 5 5 5 5 5 5 5 Nước 5 4 3 2 1 0 3 3 Thời gian lên màu là 10 phút và đo ở λ = 595nm PHƯƠNG PHÁP BRADFORD(1976) Đo phổ hấp thụ (A) cực đại ở bước sóng 275 - 280 nm. (nhân thơm) Nguyên tắc: Một số các acid amin hấp thụ ánh sáng tia cực tím (UV): Tryptophan, tyrosine và phenylalanine . Nồng độ protein tối đa có thể xác định 20-3000µg/ml. Không nhạy bằng các phương pháp đo phổ hấp thụ của các hợp chất màu. PHƯƠNG PHÁP PHỔ UV (Đo ở bước sóng 280nm) + Dung dịch 3 mg / ml dung dịch protein tiêu chuẩn BSA và protein mẫu+ Quang phổ với đèn UV1. Sử dụng 3 mg/ml dung dịch protein tiêu chuẩn để chuẩn bị dãy chuẩn gồm các nồng độ 20 , 50, 100, 250 , 500 , 1000, 2000 , và 3000 µg / ml trong cùng dung môi . Mẫu Blank chỉ chứa dung môi . 2. Bật đèn tia cực tím của quang phổ kế và thiết lập ở bước sóng 280 nm.Nên khởi động 30 phút trước khi đo . 3 . Setting mẫu blank có A = 0 4 . Đo độ hấp thụ của dãy dung dịch chuẩn và dung dịch protein mẫu cần đo . Nếu A, , của protein mẫu là > 2.0, pha loãng mẫu hơn nữa trong cùng dung môi và đo lường A, , , một lần nữa .5. Tạo một đường cong chuẩn bằng các dự liệu từ nồng độ và độ hấp thu A của dãy chuẩn. Từ phương trình đường chuẩn tình hàm lượng protein trong mẫu Vật liệu và cách tiến hành Nguyên tắc: dựa trên khả năng hấp thu của liên kết peptide ở bước sóng 205nm. Phương pháp có thể xác định nồng độ protein trong khoảng từ 10- 100µg PHƯƠNG PHÁP PHỔ UV (Đo ở bước sóng 205nm) + Dung dịch brij 35 0,01% (Sigma): Dung dịch dùng để hòa tan hay pha loãng dịch protein.  C 12 H 25 (OCH 2 CH 2 )46OH - M: 1225 Bao gồm các chỉ tiêu Hàm lượng TVB (Total vapor basis) Hàm lượng TMA (Trimetylamin) Hàm lượng tổng axid amin PHÂN TÍCH PHI PROTEIN Ý nghĩa : TVB là tổng hàm lượng base dể bay hơi bao gồm: chủ yếu TMA, DMA, NH 3 và một số amin mạch ngắn khác. TVB là một trong những chỉ số dùng để xác định độ tươi của thủy hải sản. Nguyên tắc: Các nitơ bazơ bay hơi có trong mẫu được chiết bằng dung dịch axit percloric. Sau khi được kiềm hóa, dịch chiết được chưng cất bằng hơi nước và các thành phần nitơ bazơ bay hơi được hấp thụ trong bình chứa axit. Chuẩn độ các nitơ bazơ đã hấp thụ bằng dung dịch axit clohydric chuẩn. Phương pháp này áp dụng cho các mẫu có tổng hàm lượng nitơ bazơ bay hơi từ: 5 mg/100g đến 100 mg/100 g HÀM LƯỢNG TVB ( TCVN 9215 : 2012 ) HÀM LƯỢNG TVB ( TCVN 9215 : 2012 ) T rong đó: V 1 là số ml HCl chuẩn ở mẫu thử V 0 là số ml HCl chuẩn ở mẫu trắng a là số mg N ứng với 1ml chuẩn axit clohydric: - Với HCl 0,01 mol/l, a = 0,14 mg/ml; - Với HCl 0,05 mol/l, a = 0,70 mg/ml; m là khối lượng mẫu thử, tính bằng gam V đm là thể tích sau k hi định mức tính bằng mililit (ml) V xđ là thể tích dịch lọc được lấy để chưng cất Công thức tính: HÀM LƯỢNG TVB ( TCVN 9215 : 2012 ) HÀM LƯỢNG TMA + Sự phân cắt TMAO tạo ra TMA, trimetylamin là một amin dễ bay hơi có mùi khó chịu, đặc trưng cho mùi thủy sản ươn hỏng. + Nhiều công trình nghiên cứu đã quan tâm đến chỉ số TMA và TVB trong đánh giá độ tươi của thủy sản. + TMA được xem là một chỉ số đánh giá độ tươi của thủy sản. Giới hạn cho phép là nhỏ hơn 15mg/100g Ý nghĩa HÀM LƯỢNG TMA Quy trình phân tích: 0 1 2 3 4 M 1 M­ 2 TMA 0,01 mg/ml 0 1 2 3 4 Dịch xác định 3 3 H 2 O 4 3 2 1 0 1 1 HCHO 1 1 1 1 1 1 1 Toluen 10 10 10 10 10 10 10 K 2 CO 3 ( 1g/1ml) 3 3 3 3 3 3 3 Lắc – hút 8-9 ml lớp trên cho vào ống nghiệm có chứa 0,1 gam Na 2 SO 4 Lắc đều, hút 5 ml cho vào ống nghiệm Acid Picric 5 5 5 5 5 5 5 Lắc đều đo ở bước song λ = 410nm HÀM LƯỢNG TMA Nguyên tắc: Các axit amin tự do được chiết với dung dịch axit clohydric loãng. Các chất có phân tử lượng lớn chứa nitơ được kết tủa với axit sulfosalicylic và được loại bằng cách lọc. Dịch lọc được điều chỉnh pH tới 2,20. Axit amin được tách bằng sắc ký trao đổi ion và xác định bằng phản ứng với ninhydrin sử dụng detector UV-Vis đo ở bước sóng 570 nm. HÀM LƯỢNG ACID AMIN TỰ DO TCVN 8764:2012 HÀM LƯỢNG ACID AMIN TỰ DO TCVN 8764:2012 Phản ứng xãy ra Sắc ký đồ của mẫu Sắc ký đồ chuẩn axit amin (570 nm) HÀM LƯỢNG ACID AMIN TỰ DO TCVN 8764:2012