Bài giảng Nuôi cấy tế bào động vật, kĩ thuật và ứng dụng - Bài 8: Kĩ thuật sản xuất kháng thể đơn dòn

KĨ THUẬT SẢN XUẤT KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG Ths. Lê Thị Hạnh Trường ĐH Khoa học Tự Nhiên – ĐHQG.TP.HCM Viện Tế Bào Gốc 11/2018 [email protected] Nội dung u Giới thiệu u Các bước tạo kháng thể đơn dòng u Ứng dụng [email protected] Kháng nguyên-kháng thể u Kháng nguyên (antigen – Ag): một chất phản ứng với các sản phẩm của một đáp ứng miễn dịch đặc hiệu Bản chất là protein (glycoprotein/lipoprotein), polysaccharid/lipopolysaccharid, acid nucleic hoặc lipid Kháng nguyên không phụ thuộc T (polysaccharid) và Kháng nguyên phụ thuộc T (protein) u Kháng thể (antibody - Ab): là một protein được hệ miễn dịch sử dụng để nhận diện và trung hoà những tác nhân xâm nhiễm ngoại lại Mỗi kháng thể chỉ nhận diện duy nhất một kháng nguyên mục tiêu của nó Kháng thể đơn dòng (Monoclonal antibody – mab): là kháng thể được xác định bởi một loại tế bào miễn dịch, bắt nguồn từ một dòng tế bào duy nhất Kháng thể đa dòng bắt nguồn từ nhiều dòng tế bào khác nhau [email protected] Đáp ứng miễn dịch dịch thể [email protected] Kháng thể đơn dòng (monoclonal antibody) u Là kháng thể kháng môt kháng nguyên nào đó được tạo ra từ một dòng tế bào B trong điều kiện in vitro u Là kháng thể chỉ nhận diện 1 vị trí epitope duy nhất trên kháng nguyên Fa b D om ain Fc Domain [email protected] Kháng thể đơn dòng – đa dòng Kháng thể đa dòng - Polyclonal antibodies Kháng thể đơn dòng - Monoclonal antibodies ØDễ sản xuất ØTương tác kháng nguyên – kháng thể không chuyên biệt ØGiới hạn số lượng (động vất) ØTiết kiệm thời gian ØĐòi hỏi kĩ thuật cao ØTương tác kháng nguyên – kháng thể chuyên biệt ØKhông giới hạn số lượng (sx trên tế bào) ØCần nhiều thời [email protected] Nobel y học 1984 Niels K. Jerne, George Kohler, César Milstein Hybridoma technology for production of monoclonal antibodies Georges J.F. Köhler, César Milstein (1975) Niels K. Jerne and his theories Theory 1: Specificity is predetermined Theory 2: Reactivity against self-antigens creates diversity Theory 3. Antibodies, [email protected] Kháng thể đa dòng và kháng thể đơn dòng [email protected] Các bước tạo kháng thể đơn dòng 1. Chọn động vật gây nghiễm, chọn kháng nguyên 2. Gây đáp ứng miễn dịch 3. Thu nhận tế bào miễn dịch và dung hợp với tế bào myelom, tạo tế bào lai hybridoma 4. Sàng lọc, dòng hóa hybridoma 5. Thu nhận, tinh chế và kiểm tra kháng thể đơn dòng [email protected] Kháng nguyên (antigen) u Được nhận diện bởi một kháng thể mục tiêu u Có tính gây đáp ứng miễn dịch mạnh u Có cấu trúc càng giống với kháng nguyên tự nhiên càng tốt (Hiện nay kháng nguyên thường được tạo ra bằng kĩ thuật protein tái tổ hợp) u Có thể là vi khuẩn gây bệnh, virus gây bệnh, các hapten phối hợp với protein, vaccine thương phẩm hay một phân tử protein nào đó [email protected] Chọn kháng nguyên u Quyết định sự thành công của quy trình u Quyết định hiệu quả ứng dụng của sản phẩm tạo thành u Quyết định quy trình sản xuất sản phẩm (Mab gắn đặc hiệu với KN tiêm vào) [email protected] Chọn động vật gây nhiễm u Chuột nhắt là mô hình lý tưởng do: • Đáp ứng miễn dịch mạnh • Thời gian ngắn tạo ra kháng thể u 2 dòng chuột trong công nghệ sản xuất kháng thể đơn dòng (Mab) là BALB/c và C57BL/6 • Lai cùng dòng • 6-8 tuần tuổi • Chuột cái • “sạch tuyệt đối” BALB/c C57BL/6 u Động vật thường được sử dụng để gây đáp ứng miễn dịch là chuột nhắt (Mouse), chuột lớn (Rat, Hamster), thỏ [email protected] Các vị trí tiêm Ag Intramuscular (i.m.) tiêm vào cơIntraperineal (i.p.) tiêm khoang bụng Subcutaneous (s.c.) tiêm dưới daIntradermal (i.d.) tiêm vào da Intravenous (i.v.) tiêm tĩnh mạch [email protected] [email protected] Gây đáp ứng miễn dịch u Phải gây đáp ứng miễn dịch khác loài (VD: động vật gây nhiễm là mouse thì kháng nguyên có nguồn gốc từ rat/hamster) u Dòng tế bào myeloma phải có nguồn gốc từ cùng một loài với đối tượng gây đáp ứng miễn dịch (VD: tế bào lách từ mouse thì dòng myeloma là SP2/0 hoặc X63/Ag.8654, nếu là rat thì chọn dòng Y3.Ag1.2.3 u Có chất bổ trợ (tá dược - adjuvant) • CFA (Complete Freud’s Adjuvant) gồm nước, nhũ tương dầu, xác vi khuẩn Mycobacteium • IFA (incomplete Freud’s Adjuvant) gồm nước, nhũ tương dầu • ALUM (aluminum hydroxide gel) [email protected] Liều lượng sử dụng Kháng nguyên là protein Kháng nguyên là tế bào Ø Tiêm 10-100 µg/chuột/lần Ø Tá dược thường được dùng là CFA Tiêm 5x10^6 - 5x10^7 tế bào /chuột/lần Tá dược thường được dùng là ALUM [email protected] Quy trình gây đáp ứng miễn dịch ở chuột nhắt Ngày Thao tác Tá dược Vị trí tiêm 0 Tiêm mũi cơ bản CFA s.c 14 Tiêm nhắc lại lần 1 IFA s.c 28 Tiêm nhắc lại lần 2 IFA s.c 36 Thu serum 42 Nghỉ hoặc Tiêm nhắc lại lần 3 IFA s.c 52 Tiêm nhắc lại lần cuối i.v 55 Thu tế bào lách sau khi xác định hiệu giá Ig trong huyết thanh [email protected] Quy trình gây đáp ứng miễn dịch ở rat Ngày Thao tác Tá dược Vị trí tiêm 0 Tiêm mũi cơ bản CFA i.p 21 Tiêm nhắc lại lần 1 IFA i.p 42 Tiêm nhắc lại lần 2 IFA i.p 52 Thu serum kiểm tra 63 Tiêm nhắc lại lần 3 IFA i.p 73 Thu serum kiểm tra 84 Tiêm nhắc lại lần 4 IFA i.p 94 Thu serum kiểm tra 98 Tiêm nhắc lại lần cuối i.v 101- 110 Thu tế bào lách [email protected] Xác định hiệu giá kháng thể [email protected] Dung hợp tạo tế bào lai [email protected] Tế bào lai - hybridoma u Được Kohler và Milsten (1975) khám phá khi nuôi cấy liên tục những tế bào tiết kháng thể u Hybrid là lai tạo giữa tế bào lympho B và tế bào ung thư dòng tủy của cùng 1 loài – oma là khối u u Môi trường chọn lọc HAT – hypoxanthine, aminopterin, thymidine u HGPRT – hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase [email protected] [email protected] [email protected] Quá trình sinh tổng hợp nucleotid Tế bào tổng hợp purine và pyrimidin bằng 2 con đường: u Con đường De novo cần hoạt động của enzyme dihydrofolate reductase (DHFR) u Con đường Salvage cần enzyme HGPRTase (hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase) để tổng hợp purine u Aminopterin có trong HAT ức chế hoạt tính của DHFR à tế bào phải tổng hợp nucleotide bằng con đường Salvage u Tế bào HGPRT(-) không có khả năng tổng hợp purine (hypoxanthine hay guanine) bằng con đường Salvage [email protected] Chuẩn bị tế bào myeloma [email protected] [email protected] Chọn lọc hybridoma [email protected] Các dòng myeloma thường được sử dụng [email protected] Các phương pháp tạo tế bào lai u Kết dính tự nhiên u Hóa chất (PEG) u Các yếu tố vật lý (xung điện, sóng siêu âm) u Virus (Sendai) u Vi tiêm [email protected] Dung hợp tế bào bằng xung điện Máy tạo xung điện Buồng dung hợp [email protected] Tiến trình dung hợp tế bào bằng xung điện [email protected] [email protected] Sàng lọc hybridoma [email protected] Dòng hóa hybridoma [email protected] Enzyme-Linked Immunosorbent Assay ELISA [email protected] Western Blotting [email protected] Immunoflorescent assay [email protected] Nhân sinh khối Mab [email protected] Sản xuất Mab in vitro u Hybridoma được nuôi trong môi trường phát triển nhân tạo (bioreactor, bình Roux) u MAb được tiết vào nước nổi của dịch nuôi cấy tế bào (supenatant cell culture) u Nhược điểm: Nồng độ MAb thu được tương đối thấp (0,01-0,5mg/mL dịch nuôi cấy) u Ưu điểm: Có thể sản xuất với số lượng lớn bằng hệ thống bioreactor [email protected] Hệ thống bioreactor nhân sinh khối tế bào [email protected] Sản xuất Mab in vivo u Hybridoma được tiêm vào khoang bụng của vật chủ (ascites) u MAb được tiết vào dịch nước báng (ascites fluid) u Ưu điểm: Nồng độ MAb thu được khá cao (1-15mg/mL nước báng) u Hạn chế: Đạo lí xã hội về sử dụng động vật thí nghiệ[email protected] Mồi chuột bằng pristane Tiêm hybridoma vào khoang bụng (peritoneal cavity) Thu thập nước báng (ascites fluid) [email protected] Pristane u 2,6,10,14 - tetramethylpentadecane u Tách chiết từ dầu gan cá mập u Gây ra bệnh viêm khớp ở Rat, là mô hình nghiên cứu bệnh viêm khớp mãn tính ở người u Gây ra bệnh lao da ở chuột, là mô hình nghiên cứu bệnh tự miễn u Là yếu tố quan trọng kích thích tạo nước báng trong khoang bụng của chuột, kích thích sự tạo MAb [email protected] Tinh chế protein u Sắc ký ái lực (affinity chromatography) u Sắc ký trao đổi ion (ion exchange chromatography) u Lọc gel (gel filtration) u Sắc ký cao áp u Kết tủa với muối ammonium sulfate hay acid caprylic [email protected] Hệ thống sắc kí lỏng cao áp HPLC (High pressure liquid chromatography) [email protected] Tinh sạch kháng thể [email protected] Ứng dụng kháng thể đơn dòng [email protected] [email protected] Human-mouse chimeric monoclonal antibodies Phage display cycle [email protected] [email protected] [email protected]