Bài giảng Nuôi cấy tế bào động vật, kĩ thuật và ứng dụng - Bài 5: Bảo quản đông lạnh tế bào - Lê Thị Ngân Hà

NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT: KĨ THUẬT VÀ ỨNG DỤNG BẢO QUẢN ĐÔNG LẠNH TẾ BÀO TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TPHCM KHOA SINH HỌC – CÔNG NGHỆ SINH HỌC TPHCM 03/2018 CRYOPRESERVATION VIỆN TẾ BÀO GỐC Lê Thị Ngân Hà ltnha@hcmus.edu.vn "I want to live and live longer and I think that in the future they may find a cure for my cancer and wake me up," the 14-year-old wrote to a British judge before her recent death. She said "being cryopreserved gives me a chance to be cured and woken up — even in hundreds of years' time.” o Tái lưu thông máu o Thuốc hỗ trợ bảo vệ tế bào o Thay máu và dịch lỏng trong cơ thể bằng chất chống đông o Giảm nhiệt với tốc độ 0,5/giờ đến nhiệt độ nito lỏng o Bảo quản trong các tủ đông hình trụ. Lịch sử 1776 1866 1949 1953 1970s 1987 now Spallanzani: tinh trùng người vẫn di chuyển khi gặp nhiệt độ thấp Mantagazza: ngân hàng tinh trùng cho tinh trùng người đông lạnh Polge: glycerol – tinh trùng gà Sherman: đông lạnh tinh trùng người – rã đông 1959 Lovelock, Bishop: DMSO – red blood cell Phát triển các nghiên cứu về đông lạnh tinh trùng người. Tạm dừng các bảo quản trứng. Bảo quản đông lạnh là gì? Bảo quản: là quy trình sinh học nhằm đảm bảo nh ổn định về mạt̆ di truyền và cấu trúc nguyên vẹn củ a các tế bào sống; đảm bảo các thành phần như nucleic acid và protein của tế bào không thay đổi. Bảo quản lạnh là việc sử dụng nhiệt độ rất thấp để bảo vệ tế bào và mô sống còn nguyên vẹn trong một thời gian dài Vì sao phải bảo quản đông lạnh tế bào? Thuận lợi bảo tồn gen Thuận lợi phân loại, tạo dòng Thuận lợi vận chuyển Dòng tế bào quý hiếm Tiết kiệm thời gian nguyên vật liệu Ngân hàng tế bào Giảm rủi ro nhiễm Ngăn cản sự biệt hoá / lão hoá Đáp ứng của tế bào với các stress khi đông lạnh Tác nhân stress Phản ứng của tế bào Giảm nhiệt độ Biến đổi lớp màng lipid, khử polymer hoá bộ xương tế bào Tăng nồng độ các chất hoà tan Giảm áp suất thẩm thấu Tăng nồng độ ion Phản ứng trực tiếp trên màng bào gồm tính tan của màng protein Khử nước Mất ổn định lớp đôi phospholipid Kết tủa muối Không rõ Hình thành bọt khí Tổn thương cơ học lên màng và bộ xương tế bào Thay đổi pH Biến tính protein Tế bào bị chèn xếp khít lại Tổn thương màng Tính nhớt của môi trường tăng Quá trình khuếch tán/thẩm thấu bị hạn chế NGUYÊN TẮC Giảm thiểu sự hình thành tinh thể băng trong tế bào (1) Đông lạnh “chậm” (2) Sử dụng chất bảo quản đông lạnh (3) rữ các tế bào ở mức nhiệt độ thấp nhất có thể để giảm thiểu tác động của nồng độ muối cao lên sự biến đổi protein trong TB. (4) tan băng nhanh chóng để giảm thiểu sự phát triển của tinh thể băng (tái kết tinh) Nhiệt độ CPA Tốc độ làm lạnh Quy trình Yếu tố ảnh hưởng đến TB Tae Hoon Jang, Cryopreservation and its clinical applications, 2017 CHẤT BẢO QUẢN ĐÔNG LẠNH – CRYOPROTECTANTS AGENT Là các loại hoá chất tan được trong nước, có khả năng xâm nhập vào bên trong tế bào, được sử dụng với mục đích giúp tế bào ngăn ngừa các tổn thương tế bào do đông lạnh. Nguyên tắc: (1) Thay thế nước trong tế bàoà giảm hình thành tinh thể đá nội bàoà giảm tổn thương do tinh thể đá gây ra. (2) Hạn chế tăng nồng độ các chất hoà tan nội bào (3) Kết lên màng bào tươngà bảo vệ tế bào. Hoạt động: “khử nước” trong quá trình đông lạnh, “bù nước” trong quá trình giải đông VD: DMSO, glycerol, glycols, một vài amino acid (proline), Permeating Non-permeating Sucrose, dextran CPA Ảnh hưởng của CPA lên Tế bào Nồng độ? QUY TRÌNH BẢO QUẢN ĐÔNG LẠNH TẾ BÀO NUÔI TĂNG SINH GIẢI ĐÔNG - PHỤC HỒI LƯU TRỮ LÀM LẠNH BỔ SUNG CHẤT BẢO QUẢN CHUẨN BỊ TẾ BÀO Thiết bị Dụng cụ – hoá chất Kính hiển vi đảo ngược • Tủ thao tác an toàn sinh h ọc cấp II • Máy ly tâm • Tủ ủ nuôi tế bào (370C, 5% CO2) • Tủ mát 2-80C • Tủ âm 00C đến -200C • Bình chứa nito lỏng Bể ổn nhiệt Dụng cụ nuôI cấy tế bào phù hợp Trypsin/EDTA 0,25% PBS không Ca2+ và Mg 2+ (PBS-) Môi trường đông lạnh tế bào Ống bảo quản đông lạnh (cryovial) 1,5-2 ml Ống ly tâm 15ml hoặc 50 ml vô trùng Môi trường giải đông CHUẨN BỊ CHUẨN BỊ CHUẨN BỊ TẾ BÀO ü Tình trạng tế bào: pha log ü Số lượng tế bào? ü Nhiễm? ü Xác định tỷ lệ tế bào sống chết ü Dán nhãn cryotube BỔ SUNG CHẤT BẢO QUẢN Thành phần môi trường đông lạnh tế bào: ✓ môi trường cơ bản: RPMI, DMEM/F12, IMDM ✓ huyết thanh thai bò (FBS): 40-50% ✓ CPA: dimethylsulphoxide (DMSO): 5-10% LÀM LẠNH Đông lạnh chậm Đông lạnh nhanh 3 bước Đông lạnh cực nhanh Đông lạnh insitu Đông lạnh theo chương trình, giảm nhiệt theo set up trên máy. 4 -20 -80 -196 Chuyển TB trực tiếp vào -196 Đông lạnh khi tế bào vẫn giữ trạng thái tăng sinh lúc nuôi cấy LƯU TRỮ Thời gian lưu trữ: Bất kỳ một gián đoạn nào trong thời gian trữ đông đều ảnh hưởng đến khả năng sống của Tb sau giải đông. Nhiệt độ lưu trữ: Nhiệt độ Thời gian 4 độ Vài giờ -20 độ Vài ngày -80 độ Vài tháng -196 độ Vài thế kỷ GIẢI ĐÔNG - PHỤC HỒI NUÔI TĂNG SINH + MTGĐ Ly tâm 5p Tốc độ thấp Thu cặn TB Kiểm tra sống/chết Thao tác? MTGĐ: môi trường cơ bản (RPMI, DMEM/F12, IMDM...) bổ sung 20- 30% huyết thanh thai bò (FBS), 1% kháng sinh-kháng nấm Cryopreservation Thawing Giảm nhiệt ↓p/u sinh hoá CPA Chết TB Tăng nhiệt Loại CPATốc độ làm lạnh