Bài giảng Nuôi cấy tế bào động vật: Kĩ thuật và ứng dụng - Bài 2: Sinh học của tế bào nuôi cấy - Vũ Bích Ngọc

10/1/17 TS. Vũ Bích Ngọc-vbngoc@hcmus.edu.vn 1 SINH HỌC CỦA TẾ BÀO ĐỘNG VẬT Đặc điểm sinh học của tế bào Các yếu tố ảnh hưởng đến sự thành công của nuôi cấy tế bào 10/1/17 TS. Vũ Bích Ngọc- vbngoc@hcmus.edu.vn ĐẶC ĐIỂM CỦA TẾ BÀO ĐỘNG VẬT Tính cơ học yếu (dễ vỡ) Tăng trưởng, phân chia chậm (20-40 giờ) Hiệu suất sinh chất có hoạt cnh sinh học thấp 10/1/17 TS. Vũ Bích Ngọc- vbngoc@hcmus.edu.vn 4 Chu kì tế bào M Mitosis G1 Gap1 G2 Gap2 G0 S Synthesis G1 check point •  cell big •  environment suitable G2 check point •  DNA replicated •  cell big •  environment suitable Metaphase check point •  chromosome align on spindle 5 Chu kì tế bào •  Interphase: –  Nhìn chung kéo dài từ 12-14 giờ trong mô động vật có vú –  Tế bào đang tổng hợp RNA,tạo protein và phát triển về kích thước •  Gap 0 (G0): tế bào thoát ra khỏi chu kì tế bào và không phân chia •  Gap 1 (G1): tế bào gia tăng kích thước, tổng hợp RNA và protein, có 1 G1 Checkpoint •  S Phase: sự nhân đôi DNA xảy ra •  Gap 2 (G2): tế bào sẽ cếp tục phát triển và sản xuất các protein mới. Có 1 G2 Checkpoint •  Mitosis hay M Phase: –  Sự phát triển và tổng hợp protein –  Tế bào chia thành 2 tế bào giống nhau. –  Mitosis thường xảy ra từ 1-2 giờ –  Có Checkpoint trong giữa kì của Mitosis (Metaphase Checkpoint) để đảm bảo tế bào hoàn thành xong sự phân chia. •  Là điểm quan trọng quyết định sự phân chia của tê sbaof •  Khi tế bào vượt qua điểm này, đi vào phase S, quá trình phân chia không thể đảo ngược. Chu kì tế bào •  Đảm bảo tế bào phân chia thuận lợi •  Nếu tế bào bị lỗi hoặc tổn thương, G” checkpoint sẽ dừng lại để sửa chữa •  Nếu tổn thương không thể đảo ngược, tế bào đi vào quá trình apoptosis à đảm bảo DNA hư hỏng tế bào không truyền cho thế hệ sauà quan trọng trong ngăn ngừa ung thư Chu kì tế bào Chu kì tế bào 9 SỰ TĂNG SINH IN VITRO •  Sự TĂNG SINH của tế bào trong nuôi cấy phụ thuộc: –  Trạng thái tự nhiên của tế bào: •  Vai trò của bộ gen – Giới hạn Hayflick •  Vai trò của sự biểu hiện gen –  Môi trường nuôi cấy •  Cơ chất tế bào bám •  Thành sinh lí và sinh hoá của môi trường nuôi •  Thành phần của phase khí •  Nhiệt độ nuôi •  Tương tác tế bào-tế bào và tế bào-chất nền Thời gian nhân đôi của rBMMSC không thay đổi trong suốt quá trình nuôi trong khi ở hASC, rASC, hBMMSC thời gian này tăng gấp 2 Izadpanah R, Trygg C, Patel B, et al. Biologic ProperŠes of Mesenchymal Stem Cells Derived From Bone Marrow and Adipose Tissue. Journal of cellular biochemistry. 2006;99(5):1285 Thay đổi kiểu gen và kiểu hình Dung hợp, biến nạp, tải nạp à tế bào thay đổi kiểu gen và kiểu hình •  Ở mỗi tế bào phân chia, sự tự làm mới và biệt hoá được quyết định bởi tương tác của yếu tố bên trong và cn hiệu hướng dẫn hoặc cn hiệu chọn lọc bên ngoài Thay đổi kiểu gen và kiểu hình •  MSC của các loài có khả năng biệt hoá thành tế bào mỡ như nhau ở pass 5 (6-8 ngày) •  rASC và hBMMSC thời gian tạo giọt mỡ dài hơn ở pass10; không có khả năng tạo mỡ sau pass 15 •  rBMMSC và hASC: ít thay đổi khả năng biệt hoá, thời gian hình thành giọt mỡ không khác nhau cho đến pass 20 Thay đổi kiểu gen và kiểu hình •  hASC và rBMMSC biệt hoá thành dòng tế bào tạo xương trong suốt quá trình nuôi cấy •  rASC và hBMMSC mất khả năng biệt hoá thành dòng tế bào tạo xương sau pass 10 Thay đổi kiểu gen và kiểu hình •  Chiều dài telomere giảm theo tuổi •  Hoạt cnh của telomerase cao nhất ở các pass đầu Šên •  mức độ hoạt động của telomerase khác nhau giữa các loài và các nguồn thu: giảm nhiều nhất ở rASC và hBMMSC Yếu tố phiên mã •  chịu trách nhiệm điều hoà đặc cnh sinh học của tế bào –  POU được mã hoá bởi Oct-4 –  Oct-2 , Sox-2 và Rex 1 điều hoà chặt chẽ trong quá trình phát triển phôi à Duy trì cnh đa Šềm năng của tế bào •  Các yếu tố khác (bổ sung từ ngoài): định hướng sự biệt hoá của tế bào (BMP-6, TGF-β3, dexamethasone, ascorbate 2-phosphate, proline, pyruvate, insulin, transferrin, selenous acid, 5aza- cysŠdine) Tính chất cần giá đỡ -TB bám vào giá đỡ để có thể sống sót, phân chia - Ngoại trừ: hồng cầu, TB ung thư, 1 số dòng TB liên tục 10/1/17 TS. Vũ Bích Ngọc- vbngoc@hcmus.edu.vn 19 SỰ BÁM DÍNH IN VITRO •  Sự bám dính tế bào là cần thiết cho sự tăng sinh và biệt hóa •  Các phân tử bám dính tế bào: –  Tương tác tế bào-tế bào: CAMs, cadherins –  Tương tác tế bào-chất nền: integrin, transmembrame proteoglycan •  Phức hợp nối chặt (Tight juncŠonal complex) trong tế bào biểu mô cho sự tương tác tế bào-tế bào. Experimental Methods 2006 20 Các nhân tố ảnh hưởng đến sự bám dính •  Sự phân tách bằng enzyme Šêu hủy các phân tử bám dính và chất nền ngoại bào •  Hầu hết tế bào từ mô rắn phát triển dạng monolayer •  Bề mặt bao phủ với Matrix kích thích sự tăng sinh và biệt hóa` 21 KÌM HÃM TIẾP XÚC - ĐIỀU HOÀ SỰ TĂNG SINH •  Kìm hãm Šếp xúc •  Kích thích sự tăng sinh – Mật độ thấp – Các cn hiệu từ môi trường: các nhân tố tăng trưởng •  Ức chế sự tăng sinh – Giới hạn mật độ: mật độ tế bào cao – Kìm hãm Šếp xúc: tương tác tế bào – Các cn hiệu từ môi trường: p53 gene product Experimental Methods 2006 22 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự thành công của nuôi cấy tế bào •  Tế bào thích hợp •  Điều kiện thích hợp –  Phase rắn •  Cơ chất hay phase mà tế bào phát triển eg. glass, plasŠc, collagen, agar –  Phase lỏng •  Các đặc cnh sinh lí và lí hóa của thành phần môi trường nuôi –  Phase khí –  Nhiệt độ –  Độ vô trùng của môi trường Experimental Methods 2006 23 Pha rắn •  Tế bào cần bám dính vào một giá thể để sinh trưởng và di chuyển •  Dụng cụ phổ biến nâất là polystyrene plasŠc •  Những cơ chất khác như glass, filter wells •  Bề mặt có têể được xử lí với: –  Phủ với cơ chất nền như Collagen, poly-l- lysine, matrigel –  Lớp feeder: monolayer of supporŠng cells, perhaps promote cell growth and differenŠaŠon by cell contact and substance secreted •  Neurons on glial cell feeder layers Experimental Methods 2006 24 Phase lỏng •  Thành phần của môi trường –  Muối vô cơ •  Cân bằng áp suất thẩm thấu •  Điều hòa điện thế màng: sodium, potassium và calcium ions. •  Cần thiết cho sự bám dính như enzyme cofactor. –  Carbohydrate •  Hầu hết chứa 4-20 mM glucose •  Nguồn năng lượng: glycolysis Experimental Methods 2006 25 Phase lỏng –  Proteins and Pepcdes •  Được sử dụng để thay thế hiện diện trong huyết thanh eg. transferrin, fibronecŠn –  Amino acids •  Quan trọng cho sự tăng sinh và biệt hóa •  glutamine có thể đi vào chu trình Kreb’s cycle –  Fa€y Acids and Lipid •  Quan trọng trong môi trường serum free media e.g. cholesterol and steroids cần thiết cho các tế bào đặc biệt. Experimental Methods 2006 26 Phase lỏng –  Vitamin •  vitamins B cần thiết cho sự phát triển và sự tăng sinh •  Tiền chất cho các co-factors •  Vitamins thường sử dụng là thiamine, riboflavin and bioŠn –  Trace Element •  zinc, copper, selenium và tricarboxylic acid intermediates. •  Selenium is a detoxifier và giúp tách các gốc O2 tự do Experimental Methods 2006 27 Phase lỏng –  Hệ đệm •  Hầu hết các tế bào cần pH tối ưu: 7.2 - 7.4 •  Kiểm soát pH cần thiết cho nuôi cấy tối ưu: –  Hệ thống đệm bicarbonate/CO2 –  Hệ đệm hóa chất: HEPES •  Môi trường nuôi cấy thương mại như pH indicator –  vàng (acid) hay hồng (alkali) –  Áp suất thẩm thấu •  Tương tự áp suất thẩm thấu 290 mOsm Experimental Methods 2006 28 Phase lỏng –  Huyết thanh •  Nhân tố không xác định: albumins, growth factors và growth inhibitors •  Gia tăng khả năng đệm •  Tăng khả năng bám dính và trung hòa chất độc •  Quan trọng cho các tế bào phát triển chậm hay khi nuôi mật độ thấp •  Biến thiến từng mẻ •  Huyết thanh bất họat nhiệt (incubaŠon at 56ºC for 30 minutes) có thể giúp giảm rủi ro nhiễm Experimental Methods 2006 29 Phase khí –  Carbondioxide •  Quan trọng cho hệ đệm –  5-10% CO2 –  Sản xuất sản phẩm: pyruvate –  Oxy •  Hầu hết tế bào cần thiết phân áp oxy thấp •  anaerobic glycolysis •  Nồng độ oxy cao có thể gia tăng gốc O2 tự do H3C C C O − O O C S O H3C CoA HSCo A NAD+ NADH + CO2 Pyruvate Dehydrogenase pyruvate acetyl-CoA Experimental Methods 2006 30 Hình dạng tế bào khi nuôi •  Hình dạng tế bào khi nuôi cấy ở 2 dạng chính: –  Phát triển huyền phù (như một tế bào đơn hay các cụm nhỏ tế bào) •  Dòng tế bào thu từ máu (leukaemia, lymphoma) –  Phát triển dạng monolayer bám dính vào dụng cụ nuôi. •  Tế bào thu từ các mô rắn (lungs, kidney), endothelial, epithelial, neuronal, fibroblasts Hela-Epithelial MRC5-Fibroblast SHSY5Y-Neuronal BAE1-Endothelial Experimental Methods 2006 31 Nhiệt độ – Nhiệt độ tối ưu phụ thuộc vào loài •  Nhiệt độ cơ thể mà tế bào được thu nhận •  Nhiệt độ của của vùng mô thu nhận tế bào (skin temperature may be lower than the rest of the body) Experimental Methods 2006 32 Kĩ thuật vô trùng •  Vi sinh vật là vấn đề nguy hại chính trong nuôi cấy tế bào •  Ngăn ngừa sự nhiễm: –  Kháng sinh –  Cải thiện điều kiện PTN –  Kĩ thuật vô trùng •  Bề mặt sạch và gọn gàng •  Người “sạch” –  Rửa tay –  Nón, khẩu trang, găng tay •  Hóa chất và môi trường •  Dụng cụ nuôi cấy ------------HẾT--------