Bài giảng Nuôi cấy tế bào động vật, kĩ thuật và ứng dụng - Bài 2: Sinh học của tế bào nuôi cấy

9/16/19 TS. Vũ Bích Ngọc-vbngoc@hcmus.edu.vn 1 SINH HỌC CỦA TẾ BÀO ĐỘNG VẬT Đặc điểm sinh học của tế bào Các yếu tố ảnh hưởng đến sự thành công của nuôi cấy tế bào 9/16/19 TS. Vũ Bích Ngọc- vbngoc@hcmus.edu.vn ĐẶC ĐIỂM CỦA TẾ BÀO ĐỘNG VẬT 9/16/19 TS. Vũ Bích Ngọc- vbngoc@hcmus.edu.vn Tăng trưởng và phân chia chậm Tính chất cần giá đỡ Tính cơ học yếu Thay đổi kiểu gen và kiểu hình Cơ chế kìm hãm ngược Có thể được bảo quản lâu dài bằng phương pháp lạnh sâu ..9/16/19 TS. Vũ Bích Ngọc- vbngoc@hcmus.edu.vn Phân chia chậm Tăng trưởng, phân chia chậm (20-40 giờ) Hiệu suất sinh chất có hoạt tính sinh học thấp 9/16/19 TS. Vũ Bích Ngọc- vbngoc@hcmus.edu.vn Chu kì tế bào M Mitosis G1 Gap1 G2 Gap2 G0 S Synthesis Điểm kiểm soát G2• cell big • environment suitable Điểm kiểm soát G2 • DNA replicated • cell big • environment suitable Điểm kiểm soát Metaphase • NST sắp xếp trên mặt phẳng thoi vô sắc Interphase: • Kéo dài từ 12-14 giờ trong mô động vật có vú • Tế bào đang tổng hợp RNA,tạo protein và phát triển về kích thước o Gap 0 (G0): tế bào thoát ra khỏi chu kì tế bào và không phân chia o Gap 1 (G1): tế bào gia tăng kích thước, tổng hợp RNA và protein, có 1 G1 Checkpoint o S Phase: sự nhân đôi DNA xảy ra o Gap 2 (G2): tế bào sẽ tiếp tục phát triển và sản xuất các protein mới. Có 1 G2 Checkpoint Mitosis hay M Phase: • Sự phát triển và tổng hợp protein • Tế bào chia thành 2 tế bào giống nhau. • Mitosis thường xảy ra từ 1-2 giờ • Có Checkpoint trong giữa kì của Mitosis (Metaphase Checkpoint) để đảm bảo tế bào hoàn thành xong sự phân chia. • Là điểm quan trọng quyết định sự phân chia của tế • Khi tế bào vượt qua điểm này, đi vào phase S, quá trình phân chia không thể đảo ngược. Điểm kiểm soát G1 • Đảm bảo tế bào phân chia thuận lợi • Nếu tế bào bị lỗi hoặc tổn thương, G2 checkpoint sẽ dừng lại để sửa chữa • Nếu tổn thương không thể đảo ngược, tế bào đi vào quá trình apoptosis à đảm bảo DNA hư hỏng tế bào không truyền cho thế hệ sauà quan trọng trong ngăn ngừa ung thư Điểm kiểm soát G2 Điểm kiểm soát thoi vô sắc Tính chất cần giá đỡ -TB bám vào giá đỡ để có thể sống sót, phân chia - Ngoại trừ: hồng cầu, TB ung thư, 1 số dòng TB liên tục 9/16/19 TS. Vũ Bích Ngọc- vbngoc@hcmus.edu.vn Tính cơ học yếu Không có vách tế bàoè tế bào dễ tổn thương 9/16/19 TS. Vũ Bích Ngọc- vbngoc@hcmus.edu.vn è Tế bào dễ biến đổi Thay đổi kiểu gen và kiểu hình Dung hợp, biến nạp, tải nạp à tế bào thay đổi kiểu gen và kiểu hình • Ở mỗi tế bào phân chia, sự tự làm mới và biệt hoá được quyết định bởi tương tác của yếu tố bên trong và tín hiệu hướng dẫn hoặc tín hiệu chọn lọc bên ngoài Thay đổi kiểu gen và kiểu hình 1 MSC của các loài có khả năng biệt hoá thành tế bào mỡ như nhau ở pass 5 (6-8 ngày) 2 rASC và hBMMSC thời gian tạo giọt mỡ dài hơn ở pass10; không có khả năng tạo mỡ sau pass 15 3 rBMMSC và hASC: ít thay đổi khả năng biệt hoá, thời gian hình thành giọt mỡ không khác nhau cho đến pass 20 Thay đổi kiểu gen và kiểu hình hASC và rBMMSC biệt hoá thành dòng tế bào tạo xương trong suốt quá trình nuôi cấy rASC và hBMMSC mất khả năng biệt hoá thành dòng tế bào tạo xương sau pass 10 KÌM HÃM TIẾP XÚC - ĐIỀU HOÀ SỰ TĂNG SINH • Kìm hãm tiếp xúc • Kích thích sự tăng sinh – Mật độ thấp – Các tín hiệu từ môi trường: các nhân tố tăng trưởng • Ức chế sự tăng sinh – Giới hạn mật độ: mật độ tế bào cao – Kìm hãm tiếp xúc: tương tác tế bào – Các tín hiệu từ môi trường: p53 gene product 14 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự thành công của nuôi cấy tế bào (tăng sinh invitro) 9/16/19TS. Vũ Bích Ngọc- vbngoc@hcmus.edu.vn SỰ TĂNG SINH IN VITRO CỦA TẾ BÀO – phụ thuộc vào trạng thái tự nhiên của tế bào: • Vai trò của bộ gen – Giới hạn Hayflick • Vai trò của sự biểu hiện gen – phụ thuộc Môi trường nuôi cấy • Cơ chất tế bào bám • Thành phần sinh lí và sinh hoá của môi trường nuôi • Thành phần của phase khí • Nhiệt độ nuôi • Tương tác tế bào-tế bào và tế bào-chất nền 1 6 Vai trò của bộ gen -giới hạn HayFlick Leonard Hayflick (1965) Tế bào phân chia 50- 70 lần Vai trò của bộ gen Chiều dài telomere giảm theo tuổi 1 Hoạt tính của telomerase cao nhất ở các pass đầu tiên 2 Mức độ hoạt động của telomerase khác nhau giữa các loài và các nguồn thu: giảm nhiều nhất ở rASC và hBMMSC 3 Thời gian nhân đôi của rBMMSC không thay đổi trong suốt quá trình nuôi trong khi ở hASC, rASC, hBMMSC thời gian này tăng gấp 2 Izadpanah R, Trygg C, Patel B, et al. Biologic Properties of Mesenchymal Stem Cells Derived From Bone Marrow and Adipose Tissue. Journal of cellular biochemistry. 2006;99(5):1285 Yếu tố phiên mã Chịu trách nhiệm điều hoà đặc tính sinh học của tế bào POU được mã hoá bởi Oct-4 Oct-2 , Sox-2 và Rex 1 điều hoà chặt chẽ trong quá trình phát triển phôi Duy trì tính đa tiềm năng của tế bào Các yếu tố khác (bổ sung từ ngoài): định hướng sự biệt hoá của tế bào BMP-6, TGF-β3, dexamethasone, ascorbate 2- phosphate, proline, pyruvate, insulin, transferrin, selenous acid, 5aza-cystidine 22 SỰ BÁM DÍNH IN VITRO • Sự bám dính tế bào là cần thiết cho sự tăng sinh và biệt hóa • Các phân tử bám dính tế bào: – Tương tác tế bào-tế bào: CAMs, cadherins – Tương tác tế bào-chất nền: integrin, transmembra me proteoglycan • Phức hợp nối chặt (Tight junctional complex) trong tế bào biểu mô cho sự tương tác tế bào-tế bào. Các nhân tố ảnh hưởng đến sự bám dính 23 • Sự phân tách bằng enzyme: tiêu hủy các phân tử bám dính và chất nền ngoại bào • Hầu hết tế bào từ mô rắn phát triển dạng lớp đơn (monolayer) • Bề mặt bao phủ với Matrix kích thích sự tăng sinh và biệt hóa của tế bào Experimental Methods 2006 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự thành công của nuôi cấy tế bào Experimental Methods 2006 24 Tế bào thích hợp Điều kiện thích hợp Phase rắn • Cơ chất hay phase mà tế bào phát triển eg. glass, plastic, collagen, agar Phase lỏng • Các đặc tính sinh lí và lí hóa của thành phần môi trường nuôi Phase khí Nhiệt độ Độ vô trùng của môi trường Pha rắn • Tế bào cần bám dính vào một giá thể để sinh trưởng và di chuyển • Dụng cụ phổ biến nâất là polystyrene plastic • Những cơ chất khác như glass, filter wells • Bề mặt có têể được xử lí với: • Phủ với cơ chất nền như Collagen, poly-l-lysine, matrigel • Lớp feeder: monolayer of supporting cells, perhaps promote cell growth and differentiation by cell contact and substance secreted • Neurons on glial cell feeder layers Phase lỏng • Thành phần của môi trường – Muối vô cơ • Cân bằng áp suất thẩm thấu • Điều hòa điện thế màng: sodium, potassium và calcium ions. • Cần thiết cho sự bám dính như enzyme cofactor. – Carbohydrate • Hầu hết chứa 4-20 mM glucose • Nguồn năng lượng: glycolysis Phase lỏng – Proteins and Peptides • Được sử dụng để thay thế hiện diện trong huyết thanh eg. transferrin, fibronectin – Amino acids • Quan trọng cho sự tăng sinh và biệt hóa • glutamine có thể đi vào chu trình Kreb’s cycle – Fatty Acids and Lipid • Quan trọng trong môi trường serum free media e.g. cholesterol and steroids cần thiết cho các tế bào đặc biệt. Phase lỏng – Vitamin • vitamins B cần thiết cho sự phát triển và sự tăng sinh • Tiền chất cho các co-factors • Vitamins thường sử dụng là thiamine, riboflavin and biotin – Trace Element • zinc, copper, selenium và tricarboxylic acid intermediates. • Selenium is a detoxifier và giúp tách các gốc O2 tự do Phase lỏng – Hệ đệm • Hầu hết các tế bào cần pH tối ưu: 7.2 - 7.4 • Kiểm soát pH cần thiết cho nuôi cấy tối ưu: – Hệ thống đệm bicarbonate/CO2 – Hệ đệm hóa chất: HEPES • Môi trường nuôi cấy thương mại như pH indicator – vàng (acid) hay hồng (alkali) – Áp suất thẩm thấu • Tương tự áp suất thẩm thấu 290 mOsm Phase lỏng – Huyết thanh • Nhân tố không xác định: albumins, growth factors và growth inhibitors • Gia tăng khả năng đệm • Tăng khả năng bám dính và trung hòa chất độc • Quan trọng cho các tế bào phát triển chậm hay khi nuôi mật độ thấp • Biến thiến từng mẻ • Huyết thanh bất họat nhiệt (incubation at 56ºC for 30 minutes) có thể giúp giảm rủi ro nhiễm Experimental Methods 2006 31 Phase khí – Carbondioxide • Quan trọng cho hệ đệm – 5-10% CO2 – Sản xuất sản phẩm: pyruvate – Oxy • Hầu hết tế bào cần thiết phân áp oxy thấp • anaerobic glycolysis • Nồng độ oxy cao có thể gia tăng gốc O2 tự do H3C C C O- O O C S O H3C CoA HSCo A NAD+ NADH + CO2 Pyruvate Dehydrogenase pyruvate acetyl-CoA Experimental Methods 2006 32 Hình dạng tế bào khi nuôi • Hình dạng tế bào khi nuôi cấy ở 2 dạng chính: – Phát triển huyền phù (như một tế bào đơn hay các cụm nhỏ tế bào) • Dòng tế bào thu từ máu (leukaemia, lymphoma) – Phát triển dạng monolayer bám dính vào dụng cụ nuôi. • Tế bào thu từ các mô rắn (lungs, kidney), endothelial, epithelial, neuronal, fibroblasts Hela-Epithelial MRC5-Fibroblast SHSY5Y-Neuronal BAE1-Endothelial Nhiệt độ – Nhiệt độ tối ưu phụ thuộc vào loài • Nhiệt độ cơ thể mà tế bào được thu nhận • Nhiệt độ của của vùng mô thu nhận tế bào (skin temperature may be lower than the rest of the body) Experimental Methods 2006 33 10/9/17 TS. Vũ Bích Ngọc- vbngoc@hcmus.edu.vn