Bài giảng Kỹ thuật cơ bản phân tích vi sinh vật trong thực phẩm - Trương Huỳnh Anh Vũ

4/18/2018 1 KỸ THUẬT CƠ BẢN PHÂN TÍCH VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM ThS. TRƯƠNG HUỲNH ANH VŨ Email: vutha@case.vn 0909182242 Tháng 04/2018 ĐẶC ĐIỂM, VAI TRÒ, PHÂN LOẠI VI SINH VẬT 4/18/2018 2 ĐẶC ĐIỂM CHUNG CỦA VI SINH VẬT 1. Kích thước nhỏ bé 2. Sinh trưởng, phát triển nhanh 3. Thích nghi cao 4. Phân bô ́ diện rộng, đa dạng về chủng loại VAI TRÒ TÁC ĐỘNG TÍCH CỰC CỦA VI SINH VẬT
Tham gia quá trình tuần hoàn vật chất trong tự nhiên: phân giải chất hữu cơ, khởi đầu chuỗi thức ăn, tham gia chu trình carbon, nitơ,
Trong công nghiệp: tham gia vào qui trình sản xuất các hợp chất như cồn, acid hữu cơ, enzyme,
Trong y học: vaccin, kháng sinh, vitamin, hormon,
Trong chế biến, bảo quản thực phẩm: sản xuất bột ngọt, sinh khối, rượu bia, đồ uống lên men, bacteriocin, 4/18/2018 3  Vi sinh vật là nguyên nhân gây ra các căn bệnh chết người: thương hàn, dịch hạch, ung thư,  Là tác nhân gây bệnh cho người, động/thực vật  Làm hư hỏng lương thực/thực phẩm VAI TRÒ TÁC ĐỘNG TIÊU CỰC CỦA VI SINH VẬT Vi sinh vật chia làm 6 nhóm
Virus (Vi rút)
Bacteria (Vi khuẩn)
Archae (Cổ khuẩn)
Fungi (Nấm)
Protozoa (Sinh vật nguyên sinh)
Algae (Tảo) PHÂN LOẠI VI SINH VẬT 4/18/2018 4 THIẾT KẾ PHÒNG THỬ NGHIỆM VI SINH VẬT  Không được ảnh hưởng đến độ tin cậy của phép phân tích.  Tránh nguy cơ tạp nhiễm chéo. Các cách để đạt được mục tiêu đó là: a) xây dựng phòng thử nghiệm theo nguyên tắc “đường một chiều” b) thực hiện phòng ngừa thích hợp để đảm bảo phép thử và độ nguyên vẹn của mẫu (ví dụ: sử dụng các hộp chứa được hàn kín) c) tách riêng các hoạt động theo thời gian/không gian d) Tránh các điều kiện vượt quá sự cho phép như: nhiệt độ, bụi, độ ẩm, hơi nước, tiếng ồn, độ rung v.v YÊU CẦU CHUNG 4/18/2018 5 YÊU CẦU CHUNG Để giảm nguy cơ nhiễm chéo: a) Tường, trần và sàn nhà phải nhẵn, dễ rửa và chịu được các chất tẩy rửa/chất khử trùng. b) Sàn nhà không được trơn. c) Mọi cấu trúc nổi phía trên cần được bọc kín hoặc dễ làm vệ sinh định kỳ. d) Các cửa ra vào và cửa sổ cần được đóng kín, chống được bụi bám và dễ lau rửa. e) Nhiệt độ môi trường (18°C – 27°C). f) Môi trường phòng thử nghiệm cần được bảo vệ chống bức xạ mặt trời ở phía ngoài. g) Không sử dụng rèm che phía trong vì khó làm vệ sinh và trở thành nguồn tích bụi. YÊU CẦU CHUNG Các khu vực phải được tách biệt: - Nhận và bảo quản mẫu - Chuẩn bị mẫu - Cấy/kiểm tra mẫu - Ủ và cấy chuyền vi sinh vật - Bảo quản, cấy chủng chuẩn - Chuẩn bị và khử trùng môi trường nuôi cấy/dụng cụ - Bảo quản môi trường nuôi cấy và thuốc thử - Khử nhiễm, 4/18/2018 6 KỸ THUẬT TIỆT TRÙNG/KHỬ NHIỄM 1. Tiệt trùng bằng nhiệt khô - Tiệt trùng các dụng cụ thủy tinh, đĩa petri, - 170 °C ± 10 °C hoặc tương đương, ít nhất 1 giờ. 2. Tiệt trùng bằng nhiệt ẩm (hơi nước) - Tiệt trùng các dụng cụ thủy tinh, môi trường nuôi cấy và vật liệu phòng thử nghiệm. - Nhiệt độ 121 °C ± 3 °C, ít nhất 15 phút. 3. Tiệt trùng bằng phương pháp lọc - Thường sử dụng cho các đối tượng không bền nhiệt hoặc dễ mất hoạt tính khi tiếp xúc với nhiệt độ cao. - Kích thước lỗ thường dùng 0.22, 0.45 µm 4/18/2018 7 4. Khử nhiễm bằng các hợp chất hóa học  Sử dụng các hợp chất hóa học như các sản phẩm chứa clo, cồn, các hợp chất amoni bậc bốn, ở nồng độ thích hợp và để tiếp xúc với dụng cụ trong một thời gian phù hợp.  Đảm bảo rằng dư lượng hóa chất không ảnh hưởng đến sự phục hồi của các vi sinh vật. 5. Khử nhiễm bằng tia UV Tia UV (tia cực tím) là sóng điện từ nằm trong phổ điện từ giữa ánh sáng nhìn thấy và tia X. Theo ISO 21348 tia UV được chia thành ba loại như sau: - Tia UVA (400nm÷315nm; 3.1÷3.94eV)  UV gần - Tia UVB (280nm÷315nm; 3.94÷4.43eV)  UV trung - Tia UVC (180nm÷280nm; 4.43÷12.4eV)  UV xa 4/18/2018 8 MỘT SỐ THIẾT BỊ VÀ DỤNG CỤ CƠ BẢN 4/18/2018 9 TỦ AN TOÀN SINH HỌC  Không nên sử dụng đầu đốt khí hoặc đèn cồn trong tủ.  Sử dụng các dụng cụ dùng một lần (que cấy vòng, pipet, v.v...) là sự lựa chọn thích hợp.  Cần để các tủ càng xa các thiết bị khác càng tốt.  Bố trí thiết bị và vật liệu để giảm thiểu xáo trộn luồng không khí tại khoang làm việc. CÂN PHÂN TÍCH  Cân chủ yếu được sử dụng để cân mẫu thử, môi trường nuôi cấy và thuốc thử.  Ngoài ra, cân có thể được sử dụng để đo các thể tích dịch pha loãng theo khối lượng.  Độ chính xác của cân cần đạt dung sai 1% nhưng phải đủ để đạt được dung sai tối đa 5% khối lượng, trừ khi có quy định khác. Ví dụ: Để cân 10g, thì cân cần có khả năng đọc đến 0,1 g. Để cân 1g, thì cân cần có khả năng đọc đến 0,01 g.  Đặt cân trên một mặt phẳng nằm ngang ổn định, điều chỉnh nếu cần để đảm bảo mức thăng bằng, chống rung và xê dịch. 4/18/2018 10 BỘ ĐỒNG HÓA/MÁY DẬP MẪU  Được sử dụng để chuẩn bị huyền phù ban đầu từ mẫu thử nghiệm  Không sử dụng đối với một số loại thực phẩm như: - Có nguy cơ làm thủng túi (có mặt các hạt sắc nhọn, cứng hoặc khô) - Các sản phẩm khó đồng hóa do cấu trúc của chúng (ví dụ: xúc xích dạng salami)  Các máy trộn rung có thể được sử dụng cho hầu hết các loại thực phẩm, bao gồm các sản phẩm cứng/khô. Thông thường thời gian hoạt động là từ 0,5 min đến 1 min. Nếu các vi sinh vật có thể nằm sâu bên trong cấu trúc thì cần cắt mẫu thành từng miếng nhỏ trước khi xử lý.  Được sử dụng để đo chênh lệch điện thế, tại nhiệt độ xác định.  Phải có khả năng đọc được đến 0,01 đơn vị pH, có thể thực hiện các phép đo chính xác đến ± 0,1 đơn vị pH.  Máy đo pH phải có chế độ bù nhiệt thủ công hoặc bù nhiệt tự động. MÁY ĐO pH 4/18/2018 11  Để khử trùng môi trường nuôi cấy, dụng cụ thử nghiệm,...  Không sử dụng nồi hấp áp lực để tiệt trùng các dụng cụ sạch (hoặc các môi trường nuôi cấy) đồng thời với dụng cụ (hoặc môi trường nuôi cấy) đã qua sử dụng.  Tốt nhất là sử dụng các nồi hấp áp lực riêng biệt cho hai quá trình này. Sau khi hấp khử trùng, tất cả các vật liệu và dụng cụ phải được làm nguội trong nồi hấp, trước khi lấy ra.  Vì lý do an toàn, không lấy sản phẩm ra khỏi nồi hấp áp lực khi nhiệt độ chưa giảm xuống dưới 80°C. NỒI HẤP ÁP LỰC TỦ ẤM  Các tủ ấm phải điều chỉnh nhiệt độ hoặc các thông số khác được đồng đều và ổn định.  Nếu nhiệt độ môi trường xung quanh cao hơn nhiệt độ của tủ, thì cần có hệ thống làm mát.  Thành của tủ ấm cần được bảo vệ tránh ánh nắng mặt trời.  Không nên để đầy tủ vì tủ sẽ mất một thời gian dài để cân bằng nhiệt độ.  Không mở cửa tủ trong thời gian dài. 4/18/2018 12 TỦ LẠNH/TỦ ĐÔNG Tủ lạnh  Để tránh nhiễm chéo, bảo quản các mẫu vật riêng rẽ ở các ngăn khác nhau: - Môi trường chưa nuôi cấy và thuốc thử; - Các mẫu thử nghiệm; - Các chủng chuẩn vi sinh vật làm việc.  Việc để sản phẩm vào tủ lạnh được bố trí sao cho không khí lưu thông thích hợp và giảm thiểu khả năng lây nhiễm chéo. Tủ đông  Tủ đông lạnh, nhiệt độ phải thấp dưới -15°C, tốt nhất là dưới -18°C.  Tủ đông sâu, nhiệt độ phải thấp dưới -70°C.  Sử dụng để bảo quản các vi sinh vật, các chủng làm việc/chủng chuẩn và các thuốc thử. KÍNH HIỂN VI QUANG HỌC
Tránh đặt kính ở nơi có độ ẩm cao có thể dẫn đến suy giảm chất lượng thấu kính.
Lau sạch vật kính soi dầu và các bộ phận liên quan bằng khăn lau kính. 4/18/2018 13 MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VI SINH VẬT 4/18/2018 14 YÊU CẦU CHUNG
Môi trường nuôi cấy được dùng cho việc tăng sinh, phân lập, cấy chuyền và định danh vi sinh vật.
Phân loại môi trường theo thành phần • Môi trường tự nhiên • Môi trường tổng hợp • Môi trường bán tổng hợp
Phân loại môi trường theo công dụng • Môi trường tiền tăng sinh • Môi trường tăng sinh chọn lọc • Môi trường phân lập • Môi trường thử nghiệm sinh hóa
Thành phần: nước, thạch, nguồn cacbon, đạm, vi khoáng, chất ức chế tăng trưởng, kháng sinh, chỉ thị, ĐỐI VỚI NƯỚC
Chỉ sử dụng nước tinh khiết hoặc nước có chất lượng tương đương không chứa các chất gây ức chế/ảnh hưởng đến sự phát triển của vi sinh vật trong các điều kiện thử nghiệm, ví dụ: tồn dư clo, amoniac và ion kim loại.
Nước phải được bảo quản trong vật chứa có nắp đậy kín làm bằng vật liệu trơ (thủy tinh trung tính, polyetylen v.v...) không chứa các chất gây ức chế.
Số lượng vi khuẩn không được vượt quá 103 CFU/ml và tốt nhất là dưới 102 CFU/ml. Độ dẫn điện của nước không được lớn hơn 25 μS.cm-1 (tương đương với điện trở ≥ 0,04 MΩ.cm) và tốt nhất là dưới 5 μS.cm-1 THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY 4/18/2018 15 ĐỐI VỚI AGAR
Agar (thạch) là tác nhân gây đông đặc để tạo môi trường rắn nuôi cấy vi sinh vật.
Ưu điểm cơ bản của agar là rất nhiều loài vi sinh vật không sử dụng làm cơ chất dinh dưỡng.
Nồng độ thích hợp để làm rắn môi trường thường là 1 – 2%.
Agar nóng chảy ở nhiệt độ 85 0C và đông đặc ở 32 – 40 0C. THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY ĐỐI VỚI NITƠ HỮU CƠ
Peptone  Peptone là sản phẩm phân giải trung gian của protein, dùng làm môi trường nuôi cấy vi sinh vật dị dưỡng  Peptone trypticase là sản phẩm phân giải casein bằng pancreatin  Phytone hay peptone papainic được trích xuất từ đậu nành  Peptone thịt là sản phẩm phân giải thịt bằng pepsin
Cao nấm men (Yeast extract)  Cao nấm men rất giàu các loại axit amin, vitamin,.. tạo điều kiện phát triển tốt cho nhiều loại vi sinh vật  Cao nấm men được điều chế bằng cách đông khô dung dịch ly trích từ nấm men đã qua quá trình tự phân
Cao thịt (Meat extract)  Được chế từ thịt đã loại bỏ gân, mỡ và xử lý sơ bộ bằng các enzym trước khi ly trích và cô đặc. Đây là thành phần dinh dưỡng cực tốt. THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY 4/18/2018 16 ĐỐI VỚI CÁC CHẤT ỨC CHẾ CHỌN LỌC Azide và sulfite: ức chế các trực khuẩn gram âm trong môi trường chọn lọc Streptococcii. Chất hoạt động bề mặt (Sodium Lauryl Sulphate, Sodium Dodecyl Sulfate): ức chế phần lớn vi khuẩn tạp nhiễm trong môi trường canh lauryl sulfate dung tăng sinh chọn lọc và sang lọc sơ bộ Coliforms. THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY Các chế phẩm từ mật bò (Ox bile) Mật bò: làm giảm sức căng bề mặt tại vùng tiếp xúc giữa màng và môi trường, kích thích men autolysin nội bào dẫn đến sự phân giải màng tế bào. • Thường dùng làm môi trường chọn lọc hoặc phân lập do khả năng kích thích sự phát triển của hệ vi sinh vật đường ruột và ức chế các vi khuẩn gram dương. Hỗn hợp muối mật (Bile salts): là hỗn hợp muối Na của các acid có trong mật bò (cholic, taurocholic, desoxycholic,) tác dụng giống như mật bò nhưng hoạt tính cao hơn và được dùng với nồng độ thấp hơn. Trong đó desoxycholate và taurocholate là 2 hợp chất có khả năng phân giải màng mạnh nhất. Sodium desoxycholate: là chế phẩm muối mật được dùng nhiều trong môi trường chọn lọc hoặc phân lập vi khuẩn đường ruột, gram âm. 4/18/2018 17 ĐỐI VỚI CƠ CHẤT PHẢN ỨNG SINH HÓA
Những cơ chất thường dùng là các loại đường như lactose, glucose, saccharose, fructose, maltose, arabinose, xylose, galactose, raffinose, melibiose, glycerine, mannitol, sorbitol, adonitol, với nồng độ khoảng 0,5 – 1%.
Các vi sinh vật sẽ tạo ra enzym phân giải hoặc biến đổi những chất trong môi trường thành chất mới, các chất mới được nhận diện bằng thuốc thử hoặc thay đổi pH qua những chất chỉ thị màu thích hợp. THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY 4/18/2018 18 KỸ THUẬT PHÂN TÍCH CƠ BẢN VI SINH VẬT KỸ THUẬT PHA LOÃNG 4/18/2018 19 KỸ THUẬT ĐỔ/TRÃI ĐĨA KỸ THUẬT CẤY RIA/CẤY ĐÂM SÂU 4/18/2018 20 KỸ THUẬT LỌC MÀNG KỸ THUẬT MPN 4/18/2018 21 4/18/2018 22 KỸ THUẬT CRYOBANK BẢO QUẢN CHỦNG CHUẨN Gồm các hạt sứ, xốp, rỗng tự nhiên đã được sử lý với axit và chất lưu trữ lạnh phù hợp (cryopreservative fluid) tạo điều kiện cho tế bào của vi khuẩn dễ dàng bám lên bề mặt của các hạt. 4/18/2018 23 CÁCH SỬ DỤNG PIPET 4/18/2018 24 1. tap-huan/ky-thuat-pha-che-moi-truong-nuoi-cay-phan-lap-vi- khuan-c12326i14680.htm 2. ISO 7218:2007/Amd.1:2013. Microbiology of food and animal feeding stuffs — General requirements and guidance for microbiological examinations AMENDMENT 1 3. F. Power, P. Pell, and P. Sneath, 1978. A simple method for storage of bacteria at −76°C. J. Appl. Bacteriol. 44:313-316. 4. Cryobank-Rekultivierungsstudie-e.pdf 5. https://www.idexx.com/en/water/water-products-services/colisure/ 6. https://www.idexx.com/en/water/water-products-services/colilert/ 7. Một số hình ảnh sử dụng trong tài liệu được trích dẫn từ nhiều nguồn từ internet khác nhau. TÀI LIỆU THAM KHẢO