Bài giảng Kiểm nghiệm vi sinh vật - Chương 4: Các thử nghiệm sinh hóa - Nguyễn Văn Hạnh

Các thử nghiệm sinh hóaGV: Nguyễn Văn HạnhChương 4Phân lập khuẩn lạc thuần khiết là cần thiết cho định danh VSVViệc định danh dựa chủ yếu vào đặc điểm kiểu hình đặc biệt là các phản ứng sinh hóa.Có 3 cách sử dụng các thử nghiệm sinh hóa để định danh VSV:Cách truyền thốngSử dụng các bộ KITSử dụng các thiết bị tự độngThử nghiệm khả năng lên menMục đích: thử nghiệm khả năng sữ dụng các nguồn CH của các VSVNguyên tắc: VSV sử dụng CH  tao acid  giảm pH môi trườngCác loại carbonhydrateMonocarbonhydrate: glucose, xylose, rhamnose Dicarbonhydrate: sucrose, lactose Polycarbonhydrate: tinh bột, celluloseCác loại đường khử: đường mono chứa chức –CHOCác loại đường rượu: chứa chức -OHPhenol Red Carbohydrate BrothTrypticase10gNaCl5gCao thịt1gPhenol red(7,2ml của dung dịch phenol red 0,25%)0,018gCarbohydrate*1 gHấp ở 115oC trong 15 phútTrang 104Thử nghiệm khả năng lên menMôi trường: Phenolred broth base bổ sung 0,5-1% đường cần thử nghiệmVSV sử dụng được nguồn đường trong môi trường sẽ làm giảm pH  thay đổi màu chất chỉ thị phenolredPhản ứng (+): môi trường chuyển vàngPhản ứng (-): môi trường có màu đỏ Thử nghiệm CitrateMục đích: Xác định khả năng vi sinh vật sử dụng nguồn citrat như là nguồn cacbon duy nhất.Cở sở sinh hóa:VSV sử dụng citrate, sinh ra CO2 làm kiềm hóa MTVSV sử dụng muối ammonium là nguồn đạm duy nhất tạo ra NH3 làm kiềm hóa MTThử nghiệm CitrateMôi trường Simmon citrate agar (tr. 105) Ammonium dihydrogen phosphate 1.0g Dipotassium hydrogen phosphate 1.0g NaCl 5g Sodium citrate 2g MgSO4 0,2g Bromothymol blue 0,08g Agar 13gThử nghiệm CitrateChú ý - Cấy lượng sinh khối vừa đủ - Có đối chứng trắng đi kèmĐối chứng trắngPứ âm tínhPứ dương tínhThử nghiệm UreaseMục đích: phát hiện VSV có mang enzym ureaseCơ sở sinh hoá: (NH2)2CO + H2O  2 NH3 + CO2  tăng pH môi trường  đỏ phenol (vàng – đỏ)Môi trường sử dụng:Urea Broth (Rustigian – Stuart)Christensen Urea (môi trường thạch nghiêng)Môi trường Urea BrothUrea20gCao nấm mem0,1gNa2HPO49,5gK2HPO49,1gPhenol red0,01gNước cất1 lítThực hiệnChuẩn bị môi trườngCấy VSV vào 5ml môi trườngủ 37oC/24 giờQuan sátThử nghiệm UreaseThử nghiệm khả năng sinh H2SMục đích: phát hiện khả năng sinh H2SCơ sở sinh hóa: Acid amin chứa S H2S Thiosulfate H2SH2S sinh ra được nhận biết bởi ion sắt, chì tạo kết tủa màu đen (FeS, PbS)desulfohydrasethiosulfate reductaseThử nghiệm khả năng sinh H2SĐể phân biệt các loài thuộc họ Enterobacteriaceae và giống ProteusMôi trường sử dụng:KIA, TSI (thạch nghiêng)SIM, PIA (thạch sâu)BSA (thạch đĩa)Cấy vsv lên môi trường Ủ (37oC, 24 – 48h)Thử nghiệm khả năng sinh H2SĐọc kết quả:Xuất hiện màu đen trong môi trườngKhông xuất hiện màu đen trong môi trường(+)(-)(+)ĐCThử nghiệm khả năng sinh H2S(+)(+)(-)Pancreatic digest of casein (casitone)20.0 gPeptic digest of animal tissue (beef extract)6.1 gFerrous ammonium sulfate0.2 gSodium thiosulfate0.2 gAgar3.5 gThử nghiệm khả năng sinh IndolMục đíchPhát hiện các VSV có khả năng sinh indol  các VSV có hệ emzym tryptophanaseChủng VSVMT canh tryptonThuốc thử Kovac’sPứ dương tínhPứ âm tính37oC / 24hThử nghiệm khả năng sinh IndolLà phản ứng giúp phân biệtE. coli (+) với Klebsiella (-)Proteus mirabilis (-) với Proteus khác (+)Bacillus alvei (+) với Bacillus khác (-)Đối chứng (+) Proteus rettgeri (-) Serratia marcescensThử nghiệm KIA/TSIKIA: Kligler iron agar (trang 99) Pepton 20g Lactose 20g Glucose 1g NaCl 5g Feric ammonium citrate 0,5g Sodium thiosulphate 0,5g Agar 15g Phenol red 0,025g Nước cất 1 lít pH 7,4±0,2Thử nghiệm KIA/TSITSI: Triple sugar iron agar (trang 106) Pepton 20g Lactose 10g Sucrose 10g Glucose 1g NaCl 5g Feric ammonium sulphate o,2g Sodium thiosulphate 0,2g Agar 13g Phenol red 0,025g Nước cất 1 lít pH 7,4±0,2Thử nghiệm KIA/TSIMục đích: phát hiện khả năngsử dụng các nguồn cacbonhydratesinh H2Stạo hơi (gas)Ủ 37oC/24 giờQuan sát:Phần nghiêng / phần sâu / hơi / H2SThử nghiệm KIA/TSI1234567810911ĐCThử nghiệm MR (Methyl red)Mục đích: xác định vi sinh vật sản xuất và duy trì các acid bền trong quá trình lên men glucose.Cơ sở sinh hóa:Chất chỉ thị pH: methyl redMR (+) – càng kéo dài thời gian nuôi cấy – môi trường càng acidMR (-) – càng kéo dài thời gian nuôi cấy – các chất có tính acid bị chuyển hóa – môi trường dần trung tính Thời gian ủ 2 – 5 ngày ở 37oCdưới 4,45,0 – 5,8trên 6,0Thử nghiệm MR (Methyl red)Môi trường: Glucose Phosphate (MR-VP broth)Chủng VSVủ 2 – 5 ngày37oCPứ âm tínhPứ dương tínhĐCMR-VP brothThử nghiệm VP (Voges – Proskauer)Mục đích: Phát hiện vsv tạo sản phẩm trung tính (acetoin) trong quá trình lên men glucoseCở sở sinh hóa: Acetoin được tạo ra trong điều kiện yếm khí hoàn toàn.2 pyruvate acetoin + 2 CO2Phức màu hồngThử nghiệm VP (Voges – Proskauer)Môi trường sử dụng: MR-VPPhương pháp tiến hành:Cấy vi sinh vật trong môi trường MR-VPỦ 24 – 48 giờ, nhiệt độ 37oCBổ sung thuốc thử vào môi trường, lắc nhẹĐọc kết quả sau 20 phút và chậm nhất là 4 giờ.Thử nghiệm VP (Voges – Proskauer)Kiểm tra thuốc thử bằng đối chứng(+) : Enterobacter cloacea(-) : E. coliĐọc kết quả:(+): màu đỏ trên môi trường(-): mặt môi trường không đổi màu(+)(-)Thử nghiệm Bile EsculinMục đích: xác định khả năng thủy giải glucoside esculin thành esculetin và glucose khi có sự hiện diện của muối mật.Cơ sở sinh hoá:Esculin là hợp chất nhân tạoEsculetine được phóng thích phản ứng với Fe2+ tạo thành phức hợp màu đenMôi trường Bile Esculine AgarBeef extract3gPepton5gEsculin1gMật bò (Oxgall)40gFerric citrate0,5gAgar15gNước cất1 lítGlucoseEsculetinePhân tử EsculineSự phân giải Esculine thành Glucose và EsculetineThử nghiệm Bile EsculinKhuẩn lạc Enterococcus faecalis cho kết quả BEA (+)Thử nghiệm MalonateMục đíchPhát hiện các VSV có khả năng sử dụng malonate như nguồn carbon duy nhấtCơ sở sinh hoáMalonate là chất cạnh tranh với succinateKhi VSV phân hủy được malonate thì cũng phân huỷ được các nguồn đạm vô cơ khác  tạo thành sp kiềm  làm tăng pH môi trườngThử nghiệm MalonateMôi trường sử dụng: Malonate broth (bromothymol blue)Dương tính: MT chuyển màu xanh da trờiÂm tính: MT không đổi màu và không sinh khối(+)(-)ĐCpH 7,6Thử nghiệm catalaseMục đích: phát hiện các vi sinh vật có hệ enzym catalase.Cơ sở sinh hoá: Catalase hiện diện ở các VSV hiếu khí và kỵ khí tùy ý H2O2 H2O + O2 (bọt khí)(hydrogen peroxide)catalaseThử nghiệm catalaseThực hiệnVSV lấy từ môi trường nuôi cấy (lỏng, rắn)Đặt VSV lên lam kính sạchNhỏ H2O2 30% Quan sát sau 1-2 giâyPhản ứng (+): có bọt khí xuất hiệnPhản ứng (-): không có bọt khí xuất hiệnThử nghiệm catalaseThử nghiệm catalaseThử nghiệm catalase trên đĩa petri: sử dụng H2O2 30%Thử nghiệm decarboxylaseMục đích: xác định khả năng tạo enzyme decarboxylase xúc tác phân cắt nhóm carboxyl ở một số acid aminCấu trúc của phân tử Amino acid3 thử nghiệm quan trọngLysine decarboxylase (LDC)Ornithine decarboxylase (ODC)Arginine decarboxylase (ADC) / Arginine dehydrolase (ADH)Các enzyme trên là các enzyme cảm ứng, chỉ được tạo ra khi trong môi trường nuôi cấy có cơ chất tương ứngCơ sở sinh hoáCác sp tạo ra làm tăng pH môi trường  đổi màu chất chỉ thịMôi trường sử dụng:Decacboxylase Basal Mediumchỉ thị bromocresol purple (5,2 – 6,8)Thử nghiệm decarboxylasepH 6,8Biểu hiện sinh hoá Dương tính: pH môi trường tăng Âm tính: pH giảmMT trước khi cấyPứ dương tínhPứ âm tínhThử nghiệm decarboxylaseTHỬ NGHIỆM COAGULASEMục đích: Thử nghiệm khả năng làm đông tụ huyết tương bởi enzyme coagulaseLà bước cuối trong định danh các giống StaphylococcusChủng đối chứng (+): S. aureus (-): S. epidermidisThử nghiệm tiến hành với huyết tương và fibrinogen.THỬ NGHIỆM COAGULASE Thử nghiệm bằng 2 cáchThử trên phiến kínhĐọc kết quảGiọt nướcSinh khối vsvHuyết tương người++Thử nghiệm trong ống nghiệm:0,5ml huyết tương0,5ml huyết dịch sinh khốiỦ và đọc kết quả mỗi30 phútTHỬ NGHIỆM COAGULASEKết quả thử nghiệm Coagulase(+) khi xuất hiện khối đông tụ huyết tương(-) không xuất hiện khối đông tụ, dung dịch đồng nhấtThử nghiệm gelatinaseMục đích: thử nghiệm khả năng phân giải gelatine bởi gelatinase.Cơ sở sinh hóa:Gelatine polypeptide + acid aminGelatine trong môi trường dinh dưỡng môi trường đông đặcVSV phân hủy gelatine môi trường lỏnggelatinaseThử nghiệm gelatinaseĐối chứng dương: Aeromonas hydrophila âm: E. coliMôi trường sử dụng Nutrient GelatineDạng ống nghiệm thạch sâuCấy vi sinh vật và ủ ở nhiệt độ phòng.Thử nghiệm gelatinaseĐọc kết quả (+) môi trường tan chảy (-) môi trường không tan chảyTN KHẢ NĂNG LÊN MEN – ÔXI HÓAMục đích: thử nghiệm khả năng chuyển hoá glucose theo các con đường khác nhauCơ sở sinh hóa:Lên men: là quá trình kỵ khí, tạo môi trường acid caoÔxi hóa: là quá trình hiếu khíTN KHẢ NĂNG LÊN MEN – ÔXI HÓAMôi trường sử dụng: Oxidation/Fermentation media (Hugh & Leifson media)Chỉ thị pH: bromocresol purplepH 6,8TN KHẢ NĂNG LÊN MEN – ÔXI HÓATrực khuẩn gram âm O (oxidation)Pseudomonas aeruginosaF (fermentation)Serratia marcescensCầu khuẩn gram dương O (oxidation)Micrococcus luteusF (fermentation)Staphylococcus aureusTN KHẢ NĂNG LÊN MEN – ÔXI HÓAĐọc kết quả:A: đối chứngB: phản ứng Ôxi hóaC: phản ứng lên menThử nghiệm nitratase (khử nitrate)Mục đích: Thử nghiệm khả năng khử nitrateCở sở sinh hóa:NO2 + sulphanilamine/N-napthylethylenediamine hydrochloride  chất màu hồngNO3 + bụi kẽm  màu hồngThử nghiệm nitratase (khử nitrate)Phương pháp tiến hành:Nuôi cấy chủng vi sinh vật trong môi trường chứa nitrateBổ sung chất thử để kiểm tra sự hiện diện của nitritePhản ứng định tính nitrite (-) bổ sung lượng kẽm nhỏ để định tính nitrateThử nghiệm nitratase (khử nitrate)Thử nghiệm oxydaseMục tiêu: phát hiện VSV có hệ enzym oxydase (hệ cytochrom C)Cơ sở sinh hoáCytochrom C khử + H+ + O2 Cytochrom C ôxi hoá + H2OCytochrom C ôxi hoá + TMPD khử  TMPD ôxi hoá (màu xanh) Thử nghiệm oxydaseThuốc thửTMPD (0,1%): N,N,N’,N’-tetramethyl-p-phenylenediamineBảo quản lạnh trong tốiThời hạn bảo quản: 2 tuầnĐối chứng (+): Serratia marcescens (-) : Proteus rettgeriThử nghiệm oxydaseThực hiện:Lấy VSV từ Nitrient Agar đặt lên giấy thấmNhỏ thuốc thử TMPDQuan sát sau 30 giâyPhản ứng (+): sinh khối chuyển màu xanhPhản ứng (-): sinh khối vẫn màu trắngThử nghiệm oxydaseThử nghiệm ONPGMục đích: phát hiện các vi sinh vật có hệ enzyme ß-galactosidase – enzyme cảm ứng.Cơ sở sinh hóa: ONPG o-nitrophenolMàu vàngKhông màuThử nghiệm ONPGLactose agarChủng VSV2ml ONPG brothPứ (+)Pứ (-)ủ qua đêm37oCMàu vàngThử nghiệm khả năng tan huyếtMục tiêu: phát hiện các vi sinh vật có khả năng làm tan hồng cầuMáu sử dụng: cừu, bê non, thỏ Cơ sở sinh hoá: Các heamolysine là các tác nhân làm tan hồng cầu động vậtVi sinh vật khác nhau  heamolysine khác nhau  cường độ và biểu hiện tan hồng cầu khác nhauThử nghiệm khả năng tan huyếtPhân loại: 3 kiểu tan huyếtTan huyết hoàn toàn (ß): vòng tan huyết trong, rõTan huyết không hoàn toàn (α):xung quanhvà dưới khuẩn lạc chuyển đục và có màu khácKhông tan huyết (ɣ): hoàn toàn không tan huyếtThử nghiệm CAMPMục tiêu: thử nghiệm khả năng cộng hưởng tan huyết giữa các VSVCơ sở sinh hóa:S. aureus tiết β-lysin gay tan hồng cầuVSV tiết CAMP gây tan huyếtβ-lysin + CAMP  gây tan huyết mạnh, hoàn toànÝ nghĩa: dùng phân biệt Streptococcus nhóm B (+) với Streptococcus nhóm khác (-)Staphylococcus aureusStreptococcus agalactiaeStreptococcus pyogenes(+)(-)Thử nghiệm tính di độngMục đích: Xác định khả năng di động của vi sinh vật.Cở sở: Vi sinh vật di động nhờ tiêm maoCác tiến hành: Cấy đâm sâu vi sinh vật vào môi trường thạch mềm (0,5% agar).Vi sinh vật di động sẽ làm môi trường đục, phát triển lan ra khỏi vết cấy.Vi sinh vật không di động sẽ phát triển quanh đường cấy, môi trường không bị đục.Thử nghiệm tính di động(+)(+)(-)Ứng dụng thử nghiệm sinh hóa để định danh VSVMỗi loài vsv có những đặc tính sinh hóa khác nhauThực hiện kiểm tra các thử nghiệm sinh hóa có thể giúp xác định tên loài (định danh) vi sinh vật đó.Bảng sinh hóa dùng định danh các loài vi sinh vật đường ruột (trang 23)Hệ thống xác định vi sinh vật API-20E(bioMerieux, Inc)