Bài giảng Hợp chất thứ cấp thiên nhiên - Chương 6: Ứng dụng công nghệ sinh học trong phát triển cây dược liệu

ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ SINH HỌC TRONG PHÁT TRIỂN CÂY DƯỢC LIỆU CNSH & Cây dược liệu 1. Nhân nhanh giống, tái sinh cây, Nhân sinh khối 2. Cải biến di truyền trao đổi chất 3. Sử dụng chuyển hóa tế bào 4. Chuyển gene 5. Chọn giống cây dược liệu 6. Bảo tồn, phân loại loài chính xác, truy xuất nguồn gốc PHẦN 1 GIỚI THIỆU CHUNG Xu hướng khai thác các hợp chất tự nhiên • Tách chiết từ các nguồn tự nhiên • Tìm các nguồn hợp chất mới • Tổng hợp hóa học • Cải biến hóa học • Cải biến bằng xúc tác enzyme • Sử dụng hệ thống xúc tác tế bào để chuyển hóa • Sử dụng các sinh vật chuyển gene Nguồn hợp chất tự nhiên • Mô thực vật • Sinh vật biển (rong, tảo) • Động vật (trên cạn, biển) • Nọc độc • Nấm/vi nấm • Vi sinh vật Những khó khăn trong khai thác các hợp chất tự nhiên • Chỉ có mặt ở một số loài sinh vật nhất định • Chỉ có hoạt tính trong điều kiện nuôi trồng tự nhiên • Chỉ có hoạt tính khi ở dạng cấu trúc nhất định, các dạng đồng phân khác không có hoạt tính hoặc hoạt tính thấp • Cải biến đặc hiệu vị trí bằng con đường hóa học rất khó khăn (gắn các nhóm chức). • Hàm lượng thấp, khó tinh sạch Khai thác hợp chất tự nhiên Natural compounds Tách chiết từ thực vật, vi sinh vật, nấm Khó khăn: tinh sạch và triển khai ở quy mô lớn, chi phí cao Lên men vi sinh vật Nuôi cấy mô tế bào thực vật Nuôi vi tảo Khó khăn: hoạt tính thấp hoặc không có hoạt tính Tổng hợp hóa học Khó khăn: sản phẩm phụ, độc, các đồng phân không mong muốn Chuyển hóa bằng enzyme Khó khăn: hiệu quả cao nhưng rất đắt Các hợp chất tự nhiên Hợp chất tự nhiên • Là hợp chất hóa học được tạo ra một cách tự nhiên bởi sinh vật có hoạt tính sinh dược học sử dụng để sản xuất dược phẩm, thuốc • Hợp chất tự nhiên cũng bao gồm các hợp chất được tổng hợp hoàn toàn bằng con đường hóa học với các đặc điểm và tính chất giống với các hợp chất được tổng hợp bởi sinh vật. Định nghĩa Những nhóm hợp chất tự nhiên quan trọng • Terpenoid: tổng hợp từ Acetyl-CoA theo con đường mevalonic (sesquiterpene và các dẫn xuất) • Phenol/polyphenol: những hợp chất chứa vòng thơm được tổng hợp theo con đường acid shikimic hoặc acid malonic (flavonoid) • Hợp chất chứa nitơ: từ các amino acid (alkaloid) Ứng dụng hợp chất tự nhiên • Thuốc chữa bệnh (ung thư, trợ tim, thần kinh) • Kháng sinh, kháng viêm • Chống oxy hóa, tăng cường miễn dịch • Diệt côn trùng, ký sinh • Hương liệu • Chất màu bổ sung thực phẩm Ví dụ: Hợp chất tự nhiên ức chế ung thư • Gắn với tubulin • Ức chế topoisomerase • Ức chế telomerase Tubulin và chất gắn với tubulin • Vi ống là những protein dạng sợi được cấu tạo từ tubulin. Trong quá trình phân bào, các NST gắn vào vi ống để di chuyển về phía trung tử. • Các tế bào ung thư phân chia rất mạnh. Nếu can thiệp vào quá trình gắn của các vi ống với NST sẽ ức chế quá trình nhân lên của tế bào ung thư. • Gắn với tubulin sẽ ức chế được tế bào ung thư. Tương tác của các chất gắn tubulin sẽ dẫn đến thay đổi cấu trúc và ảnh hưởng đến chức năng của tế bào Topoisomerase Topoisomerase • Topoisomerase tham gia vào quá trình sao chép và sửa chữa DNA. • Topoisomerase kiểm soát trạng thái xoắn của phân tử DNA bằng cách cắt và nối liên kết phosphodiester của phân tử DNA. Topoisomerase inhibitors • Là những chất ức chế hoạt động của enzyme Topoisomerase. • Topoisomerase đang được coi là đích để phát triển các chất chống ung thư. Ức chế hoạt động của Topoisomerase các phân tử DNA sợi đơn ngắn hoặc các đoạn DNA mạch kép bị cắt thay đổi tính toàn vẹn của genome. • Nhưng tế bào bị đứt gãy DNA sẽ bị chết theo cơ chế apoptosis. PHẦN 2 • ỨNG DỤNG CNSH TRONG PHÁT TRIỂN CÂY DƯỢC LIỆU Nhân nhanh giống, tái sinh cây, Nhân sinh khối Nhân nhanh giống, tái sinh cây, Nhân sinh khối Cải biến di truyền trao đổi chất (metabolic engineering) Ứng dụng CNSH để khai thác các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học Con đường trao đổi chất Con đường tổng hợp các hợp chất tự nhiên Sinh vật Các con đường tổng hợp Vi khuẩn MVA hoặc MEP Vi khuẩn cổ MVA Tảo lục MEP Thực vật Shikimic, MVA, MEP Động vật MVA Nấm MVA MVA và MEP Chuyển hóa sinh học Tiền chất Tế bào bình thường Tế bào cải biến di truyền Quá trình chuyển hóa sinh học tạo ra nhiều hợp chất có đặc tính hóa học, sinh dược học Tế bào Chuyển hóa sinh học Nhà máy tế bào Tiền chất Sản phẩm Giá trị thấp Hoạt tính thấp Khó cải biến bằng con đường hóa học Giá trị cao Hoạt tính mạnh Bền vững Làm thế nào để có tiền chất? Tế bào có nhiều con đường trao đổi chất có thể thu được tiền chất Plants Microbe Microalgae Mevalonate pathway (MEP) Sikimic acid pathway Non-mevalonate pathway (MVA) Chuyển hóa sinh học Nhà máy tế bào Tiền chất Sản phẩm Giá trị thấp Hoạt tính thấp Khó cải biến bằng con đường hóa học Giá trị cao Hoạt tính mạnh Bền vững Làm thế nào để có tiền chất? Tế bào có nhiều con đường trao đổi chất có thể thu được tiền chất Plants Microbe Microalgae Mevalonate pathway (MEP) Sikimic acid pathway Non-mevalonate pathway (MVA) Nguồn gene Khai thác dữ liệu Các con đường trao đổi chất Chuyển gene mong muốn Tiền chất Chuyển hóa Phát triển sản phẩm Nâng quy mô lớn Phân tíchKiểm tra hoạt tính • Ức chế ung thư • Chống oxy hóa • Diệt côn trùng • Bệnh cây Sản phẩm cuối cùng Tế bào chủ • UV-vis • HPLC • Spectrofluorometer • NMR • MALDI MS Công nghệ sinh học • Khai thác sinh khối hoặc hệ thống xúc tác tế bào – Thực vật: photobioreactor – Vi sinh vật (nấm, vi tảo): lên men • Chuyển gene – Thực vật: photobioreactor – Vi sinh vật (nấm, vi tảo): lên men Reference data, Martin et al., 2001; Jackson et al., 2003; Martin et al., 2003; Ro et al., 2006; Takahashi et al., 2007, Asadollahi et al., 2008; Wang et al., 2011a; Albertsen et al., 2011; Peralta-Yahya et al., 2011; Westfall et al., 2012 Ví dụ Tế bào nấm men được dùng, biểu hiện gene mã hóa enzyme amorphadiene synthase và cytochrome P450 monooxygenase (CYP71AV1) Chất chống sốt rét Chuyển hóa thông qua con đường tổng hợp terpen. Toàn bộ cụm gene chuyển hóa đã được đưa vào E.coli và nấm men. Paclitaxel Artemisinin Artemisia annua Taxus brevifolia • Sử dụng dưới dạng paclitaxel (Taxol) để chống ung thư hiệu quả trong nhiều năm Món ngon Ví dụ: Sản xuất axit glutamic Model of induction of l-glutamate production in C. glutamicum. Nakamura J et al. Appl. Environ. Microbiol. 2007;73:4491-4498 Nắm được các con đường trao đổi chất (khai thác các CSDL) Acetyl-CoA Acetoacetyl-CoA Acetyl-CoA acetyltransferase Acetyl-CoA CoA Acetyl-CoA HMG-CoA synthase CoA HMG-CoA HMG-CoA reductase 2NADPH 2NADP- CoA MVA MVA kinase ATP ADP PMVA PMVA kinase ATP ADP DPMVA DPMVA decarboxylase ATP ADP, Pi, CO2 MVA pathway Sản xuất terpen ở E. coli: Nguồn FPP của tế bào chủ quinone and cell wall biosynthesis HMB-PP HMB-PP reductase MEP pathway MEcPP HMB-PP synthase CDP-ME-2-phosphate MEcPP synthase CDP-ME CDP-ME kinase ATP ADP MEP CTP Pi MEP cytidyl transferase DXP NADPH NADP+ DXP reductoisomerase Glyceraldehyde-3-phosphate Pyruvate DXP synthase IPP isomerase IPP DMAPP FPP synthase IPP FPP GPP GPP synthase IPP Mevalonolacto ne Mevalonate vector Removal of the HMG-CoA reductase and HMG-CoA synthase genes DPMVA decarboxylase Ptac MVA kinase PMVA kinase IPP isomerase HMG CoA reductase HMG CoA synthase P15A ori Cmr pAC-Mev 10.6 kbp TrrnB Ptac MVA kinase DPMVA decarboxylase PMVA kinase P15A ori Cmr TrrnB IPP isomerase pAC-Mv 8.5 kbp MCS Sesquiterpene cyclase Sesquiterpene Chuyển gene  cải biến trao đổi chất • Khai thác quá mức dẫn đến cạn kiệt nguồn dược liệu  Bảo tồn • Nhận diện, phân loại loài chính xác: Kết hợp mô tả hình thái với phân tích DNA barcode, finger printing • Bảo tồn in-situ & ex-situ • Ví dụ: Các cây quý như sâm ngọc linh, xáo tam phân Các hướng cải biến di truyền 1. Loại bỏ chất ức chế enzyme (ức chế dị lập thể) để tăng hoạt động của enzyme dẫn đến tăng sản phẩm tạo thành 2. Loại bỏ hoặc ức chế hoạt động của các enzyme hoặc con đường nhánh để giảm sự cạnh tranh cơ chất hoặc sản phẩm cuối cùng bị chuyển hóa tiếp hoặc tạo ra sản phẩm gây độc tế bào (gene knock out/RNAi) 3. Cải biến các đặc tính enzyme (đột biến định hướng) để tạo ra các đặc tính mới hoặc tăng phạm vi sử dụng cơ chất tạo ra sản phẩm mới 4. Đưa gene có nguồn gốc bên ngoài hoặc tái tổ hợp để cải thiện khả năng tổng hợp sản phẩm 5. Cung cấp con đường để loại bỏ các sản phẩm phụ hoặc tích lũy chất độc Loại bỏ chất ức chế enzyme (ức chế dị lập thể) để tăng hoạt động của enzyme dẫn đến tăng sản phẩm tạo thành Loại bỏ hoặc ức chế hoạt động của các enzyme hoặc con đường nhánh để giảm sự cạnh tranh cơ chất hoặc sản phẩm cuối cùng bị chuyển hóa tiếp hoặc tạo ra sản phẩm gây độc tế bào (gene knock out/RNAi) Phương pháp tác động gene đích RNAi Cải biến các đặc tính enzyme (đột biến định hướng) để tạo ra các đặc tính mới hoặc tăng phạm vi sử dụng cơ chất tạo ra sản phẩm mới Một số hướng ứng dụng kỹ thuật di truyền trao đổi chất và ví dụ minh họa 1. Loại bỏ chất ức chế enzyme (ức chế dị lập thể) để tăng hoạt động của enzyme dẫn đến tăng sản phẩm tạo thành • Vị trí dị lập thể bị biến đổi dẫn đến phân tử điều hòa không thể gắn được vào. • Phản ứng không bị ức chế. Ví dụ tổng hợp Lysine ở quy mô công nghiệp • Con đường tổng hợp Lysine từ oxaloacetat và pyruvate ở C. gluamicum xảy ra thông qua một con đường phân nhánh. Enzyme chuyển hóa Aspartate kinase điều khiển tổng hợp tiền chất Aspartylphosphate. Enzyme này sẽ bị ức chế khi nồng độ L-Lysine và L-threonin tăng cao trong tế bào. • Bằng cách gây đột biến gene tổng hợp enzyme Aspartate kinase mất đi vị trí dị lập thể dẫn đến nồng độ L-Lysine và L-threonin tăng những enzyme vẫn khoạt động. Kết quả chuỗi chuyển hóa được diễn ra liên tục mà không chịu ảnh hưởng bởi nồng độ của 2 amino acid trên. • Đây chính là cơ chế tổng hợp Lysine ở quy mô công nghiệp sử dụng các chủng đột biến Aspartate kinase. 2. Cải biến các đặc tính enzyme (đột biến định hướng) để tạo ra các đặc tính mới hoặc tăng phạm vi sử dụng cơ chất tạo ra sản phẩm mới Cải biến enzyme protein • Thay đổi cấu trúc, đặc điểm xúc tác (cơ chất) • Thay đổi đặc điểm hóa sinh (bền nhiệt, pH) 3. Loại bỏ hoặc ức chế hoạt động của các enzyme hoặc con đường nhánh để giảm sự cạnh tranh cơ chất hoặc sản phẩm cuối cùng bị chuyển hóa tiếp hoặc tạo ra sản phẩm gây độc tế bào (gene knock out/RNAi). Tổng hợp các hợp chất trao đổi Fatty acid synthase Fatty acid synthase Công nghệ RNAi Tổng hợp L-DOPA • L-DOPA (L-3,4-dihydroxyphenylalanine) được sử dụng làm thuốc điều trị Parkinson rất hiệu quả. Chuyển hóa L-DOPA từ Tyrosine Ức chế tyrR Ức chế trpD 4. Đưa gene có nguồn gốc bên ngoài hoặc tái tổ hợp để cải thiện khả năng tổng hợp sản phẩm Điều hòa tích lũy b-caroten Không xảy ra ở thực vật Wild types Transplastomic Plant Physiology April 2011vol. 155 no. 4 1501-1510 Ví dụ: Chuyển gene vào plasmid hoặc gắn trực tiếp vào NST của vật chủ để nâng cao hoạt tính chuyển hóa trong một con đường chuyển hóa Ví dụ Chuyển hóa terpenoids Terpenes Cải biến hóa học Chuyển hóa bằng enzyme Terpenoids Bổ sung các nhóm chức năng Oxy hóa hoặc sắp xếp lại khung C Terpene cyclase Là một enzyme vòng hóa, xúc tác phản ứng tạo vòng trong hóa học Valencene là một sesquiterpene (hợp chất vòng thơm ở cam) rất rẻ. Được tổng hợp từ FPP (farnesyl pyrophosphate) bởi enzyme terpene cyclase. FPP Terpene cyclase Valencene Valencene nootkatone Nootkatone là hợp chất hữu cơ tự nhiên và có phạm vi ứng dụng rất lớn. Giá thành rất cao. Đó là một dạng sesquiterpene và ketone. Valencene Cytochrome P450 Nootkatone Ví dụ: Ứng dụng của nootkatone Deer tick • Nootkatone được sử dụng ở dạng phun xịt để xua đuổi, diệt muỗi, gián, côn trùng • Thân thiện với môi trường, không độc cho người • Sử dụng phổ biến làm chất bổ sung thức ăn, mỹ phẩm, thuốc, dược phẩm. Application of biotransformation Vector mang cả con đường chuyển hóa Mevalonate vector Removal of the HMG-CoA reductase and HMG-CoA synthase genes DPMVA decarboxylase Ptac MVA kinase PMVA kinase IPP isomerase HMG CoA reductase HMG CoA synthase P15A ori Cmr pAC-Mev 10.6 kbp TrrnB Ptac MVA kinase DPMVA decarboxylase PMVA kinase P15A ori Cmr TrrnB IPP isomerase pAC-Mv 8.5 kbp MCS Gene mong muốn: Tách dòng từ các nguồn tự nhiên Đặt tổng hợp từ các công ty (synthesized genes) Sử dụng các hệ thống vector biểu hiện tương ứng ở các tế bào chủ khác nhau. Ưu điểm khi sử dụng hệ thống chuyển hóa bằng tế bào • Ưu tiên dùng các dạng đơn bào • Có chứa các con đường chuyển hóa và tiền chất • Sinh trưởng nhanh, ít lẫn tạp • Môi trường nuôi cấy rẻ • Dễ dàng mở rộng ở quy mô lớn • Sử dụng các photobioreactor Chuyển gene vào vi sinh vật • Quy trình chuyển gene tương đối đơn giản • Tốc độ sinh trưởng nhanh • Dễ dàng chuyển cả cụm gene điều khiển bởi 1 promoter (multicistronic) • Dễ dàng tiết ra ngoài môi trường • Khó khăn: Dễ lẫn tạp, môi trường nuôi cấy chi phí cao. Các con đường chuyển hóa hạn chế. Cần phải cung cấp tiền chất Chuyển gene vào nấm men • Quy trình chuyển gene tương đối đơn giản • Có thể chuyển nhiều gene xen nhập vào genome thông qua trao đổi chéo các đoạn tương đồng • Tốc độ sinh trưởng nhanh • Dễ dàng tiết ra ngoài môi trường • Khó khăn: Dễ lẫn tạp, môi trường nuôi cấy chi phí cao. Các con đường chuyển hóa hạn chế, cần phải cung cấp tiền chất Chuyển gene vào thực vật pCAMBIA-INO 12463 bp GUS 6 His tagged Kanamycin resistance NptII (Neomycin resistance) MCS LacZ Promoter P-INO (Promoter) CaMV 35S promoter CaMV 35S promoter Left border RB (right border) 3'UTR (polyA signal) BamHI (11672) EcoRI (10821) HindIII (11702) PstI (11694) SmaI (11669) XmaI (11667) NcoI (1) NcoI (9763) ClaI (5550) ClaI (8945) ClaI (11456) ApaLI (1150) ApaLI (1475) ApaLI (6497) ApaLI (6995) AvaI (2485) AvaI (3115) AvaI (4246) AvaI (4726) AvaI (8913) AvaI (9791) AvaI (11667) • Sự phức tạp của hệ thống biểu hiện gene ở thực vật • Mỗi gene chịu sự kiểm soát của 1 promoter • Kết hợp sử dụng hệ thống tái tổ hợp ở nấm men để chuyển nhiều gene vào 1 vector • Ưu điểm: Con đường trao đổi chất rất phong phú Mục đích • Sử dụng hệ thống tế bào để chuyển hóa các hợp chất ít giá trị thành các hợp chất có giá trị cao hơn nhiều. • Ứng dụng để tạo ra các hợp chất mới có hoạt tính sinh học cao hơn, giá thành rẻ hơn. • Phát triển các sản phẩm ứng dụng trong nông nghiệp, bảo vệ thực vật, thuốc, mỹ phẩm Hướng tiếp cận • Khai thác cơ sở dữ liệu các hợp chất và các gene chuyển hóa cũng như con đường chuyển hóa các chất đó. • Sàng lọc tiền chất phù hợp • Sử dụng các tế bào chủ – Vi sinh vật (E.coli, Bacillus sp., S. pombe and yeasts) – Vi tảo (nước ngọt và nước mặn) – Tế bào thực vật • Sử dụng các tế bào chuyển gene – Tách dòng gene hoặc cụm gene mong muốn từ các nguồn tự nhiên hoặc tổng hợp gene – Chuyển các gene vào vector và đưa vào tế bào chủ bằng nhiều phương pháp khác nhau • Các tế bào chủ: E.coli, S. pombe, cerevisiae, D. salina, C. vulgaris Bảo tồn, phân loại loài chính xác, truy xuất nguồn gốc • Khai thác quá mức dẫn đến cạn kiệt nguồn dược liệu  Bảo tồn • Nhận diện, phân loại loài chính xác: Kết hợp mô tả hình thái với phân tích DNA barcode, finger printing • Bảo tồn in-situ & ex-situ • Ví dụ: Các cây quý như sâm ngọc linh, xáo tam phân Nông nghiệp công nghệ cao • Nông nghiệp công nghệ cao sử dung phương pháp canh tác hiện đại, trong đó hướng tới giảm chi phí đầu vào và tăng giá trị sản phẩm nông nghiệp đầu ra theo định hướng phát triển bền vững, an toàn và thân thiện với môi trường. • Nông nghiệp công nghệ cao hướng tới không đòi hỏi nhiều đất canh tác, dễ dàng mở rộng quy mô, điều khiển tự động, giá trị gia tăng/đơn vị diện tích) • 4 tiêu chí: Công nghệ, kinh tế, xã hội và môi trường là phương châm hướng tới của nông nghiệp công nghệ cao. Những đặc thù riêng của CNSH vi tảo 1. Phù hợp và gắn với phát triển nông nghiệp công nghệ cao (không đòi hỏi đất canh tác, dễ dàng mở rộng quy mô, điều khiển tự động, giá trị gia tăng/đơn vị diện tích), không ảnh hưởng đến quỹ đất nông nghiệp và không phụ thuộc vào thời vụ. 2. Phạm vi ứng dụng rộng: Thực phẩm chức năng, hoạt chất sinh học, thức ăn thủy hải sản, mỹ phẩm, thuốc 3. Dễ dàng triển khai mô hình và áp dụng tại các địa phương 4. Trong hướng nghiên cứu ứng dụng, con đường dẫn đến sản phẩm tương đối nhanh Những lĩnh vực ứng dụng triển vọng của CNSH vi tảo • Nuôi sinh khối tảo ở quy mô lớn làm nguồn thức ăn • Axit béo và axit béo không no • Các hoạt chất có hoạt tính sinh dược học • Xử lý ô nhiễm môi trường • Sản xuất nhiên liệu sinh học: Biodiesel • Vật chủ để chuyển gene Các sản phẩm từ vi tảo Astaxanthin SẢN XUẤT ASTAXANTHIN TỪ VI TẢO HAEMATOCOCCUS PLUVIALIS Từ phòng thí nghiệm đến sản xuất Bộ sưu tập chủng giống vi tảo Từ phòng thí nghiệm đến sản xuất Hệ thống photobioreactor trong phòng thí nghiệm (Nghiên cứu và nhân giống gốc) Hệ thống photobioreactor trong nhà lưới (Nghiên cứu quy mô pilot) Sản xuất ở quy mô lớn Phối hợp sản xuất tảo Spirulina ĐỀ XUẤT TRIỂN KHAI SẢN XUẤT Nuôi trồng tảo Spirulina platensis trong hệ thống kín và tạo sản phẩm bột tảo làm thực phẩm dinh dưỡng Sản phẩm đăng ký