Ảnh hưởng của tỷ lệ pha loãng, pH và nồng độ thẩm thấu lên hoạt lực tinh trùng cá hồng bạc (Lutjanus argentimaculatus Forskal, 1775)

Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 3/2015 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 27 THOÂNG BAÙO KHOA HOÏC ẢNH HƯỞNG CỦA TỶ LỆ PHA LOÃNG, pH VÀ NỒNG ĐỘ THẨM THẤU LÊN HOẠT LỰC TINH TRÙNG CÁ HỒNG BẠC (Lutjanus argentimaculatus Forskal, 1775) EFFECTS OF DILUTION, pH AND OSMOLALITY ON SPERMATOZOA MOTILITY IN SILVER RED SNAPPER (Lutjanus argentimaculatus Forskal, 1775) Lê Minh Hoàng1, Nguyễn Địch Thanh2 Ngày nhận bài: 30/7/2014; Ngày phản biện thông qua: 19/3/2015; Ngày duyệt đăng: 15/9/2015 TÓM TẮT Ảnh hưởng của các yếu tố môi trường lên hoạt lực tinh trùng cá hồng bạc Lutjanus argentimaculatus (Forsskal, 1775) đã được nghiên cứu qua ba thí nghiệm riêng biệt về tỷ lệ pha loãng (1:50, 1:100, 1:200 (tinh dịch: biển nhân tạo ASW), về pH (6,0; 7,0; 8,0; 9,0) và về nồng độ thẩm thấu (200, 300, 400 và 500 mOsm/kg). Ở các thí nghiệm này, tỉ lệ tinh trùng hoạt lực và thời gian hoạt lực đã được quan sát. Kết quả cho thấy, các thông số hoạt lực tốt nhất của tinh trùng quan sát được khi pha loãng tinh dịch ở tỷ lệ 1:100, pH (8,0) và nồng độ thẩm thấu là 500 mOsm/kg. Các kết quả này có thể đóng góp hữu ích trong việc hoàn thiện các phương pháp bảo quản tinh trùng ở không chỉ cá Hồng bạc mà còn ở các loài cá xương biển khác. Từ khóa: tỷ lệ pha loãng, nồng độ thẩm thấu, hoạt lực tinh trùng, Lutjanus argentimaculatus ABSTRACT Effects of environmental factors on the performance of sperm motility in Lutjanus argentimaculatus (Forsskal,1775) had been estimated by conducting three separate experiments in which treatments differed in, dilution (1:50; 1:100; 1:200 (semem: artificial seawater), pH value (6.0; 7.0; 8.0 and 9.0) and osmolality (200; 300; 400 and 500 mOsm.kg-)1. In these experiments, the maximum percentage of motile sperms and total duration motility of all sperms were observed. Based on the results, the best performances of sperm were shown in treatments with 1:100 dilution, pH 8.0 and osmolality of 500 mOsm.kg-1. To be concluded, these results can be usefully contributed in improvement of the sperm preservation methods in not only this species but also in other marine teleost. Keywords: dilution ratio, osmolality, sperm motility, Lutjanus argentimaculatus 1 TS. Lê Minh Hoàng, 2 TS. Nguyễn Địch Thanh: Viện Nuôi trồng thủy sản – Trường Đại học Nha Trang I. ĐẶT VẤN ĐỀ Cá hồng bạc (Lutjanus argentimaculatus Forsskal, 1775) là loài rộng muối, phân bố ở nhiều khu vực trên thế giới, từ vùng Ấn Độ Dương - Tây Thái Bình Dương (Indo-West Pacific) từ Samoa và đảo Line đến Đông Phi, và từ phía Bắc Australia đến đảo Ryukyu; và rải rác ở vùng Đông Địa Trung Hải qua kênh đào Suez [10]. Ở Việt Nam, cá Hồng bạc phân bố rải rác dọc theo bờ biển các tỉnh Quảng Ninh, Hải Phòng, Thừa Thiên - Huế, Bà Rịa - Vũng Tàu, vùng biển Tây Nam bộ, nhưng tập trung nhiều nhất ở vùng biển Nam Trung bộ [4]. Cá Hồng bạc có tốc độ tăng trưởng nhanh, thịt thơm ngon và có giá trị dinh dưỡng cao, giá bán hiện nay đạt từ 100.000đ/ kg -170.000đ/kg [5]. Ở Việt Nam, cá hồng bạc có thị trường xuất khẩu rộng và khá hấp hẫn như Trung Quốc, Đài Loan, Nhật Bản, Mỹ, EU [6]. Tương tự các đối tượng cá biển khác như cá chẽm (Laters calcarifer), cá chẽm mõm nhọn (Psammoperca waigiensis), cá mú (Epinephelus spp.), cá giò (Rachycentron canadum) và cá măng (Chanos chanos), cá hồng bạc (Lutjanus argentimaculatus) là loài cá có giá trị kinh tế cao và đang được nuôi thương phẩm ở nước ta, nhiều nhất ở các tỉnh Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 3/2015 28 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG Nam Trung bộ [6]. Tuy nhiên, cho đến nay, quá trình sinh sản nhân tạo và ương giống cá Hồng bạc đang gặp nhiều khó khăn, do nguồn giống và cá bố mẹ phụ thuộc phần lớn vào tự nhiên [6]. Năm 2012, Nguyễn Địch Thanh [5] đã nghiên cứu sản suất giống nhân tạo cá hồng bạc thành công tuy nhiên nguồn cá bố mẹ cho nghiên cứu vẫn phải đánh bắt từ tự nhiên. Do đó, hiện nay, các quy trình bảo quản tinh lâu dài có thể là giải pháp phù hợp để giảm bớt sự cần thiết phải đánh bắt cá đực cùng thời điểm với cá cái bố mẹ. Ngoài ra, các phương pháp bảo quản này cũng nâng cao sự hiệu quả và mức kiểm soát trong quản lý di truyền đàn cá, nhờ vậy không chỉ hữu hiệu trong nuôi trồng thủy sản mà còn giúp bảo vệ nguồn lợi tự nhiên (tổng quan bởi [16]). Tuy nhiên cho đến nay, chưa có công trình nào công bố về việc bảo quản thành công tinh trùng của loài cá này. Để phát triển các phương pháp bảo quản, việc nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng tinh trùng và khả năng thụ tinh của tinh dịch thông qua biểu hiện vận động của tinh trùng là rất quan trọng. Các yếu tố môi trường bao gồm tỷ lệ pha loãng, áp suất thẩm thấu, pH, nhiệt độ, nồng độ các ion (ví dụ, Ca2+, Mg2+, K+, Na+) đã được chứng minh là có ảnh hưởng đáng kể lên hoạt lực của tinh trùng [7, 15] và vì vậy sẽ ảnh hưởng lên chất lượng tinh và khả năng thụ tinh [15]. Các nghiên cứu loại này đã được thực hiện trên nhiều đối tượng khác nhau, ví dụ, cá tầm Ba Tư (Acipenser persicus) [7], cá đù vàng (Larimichthys polyactis) [15], cá bơn Đại Tây Dương (Hippoglossus hippoglossus) [14], cá chẽm mõn nhọn (Psammoperca waigiensis) [3]; tuy nhiên, chưa có báo cáo nào về cá hồng bạc. Vì thế, nghiên cứu này của chúng tôi sẽ cung cấp những thông tin đầu tiên về ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường (tỷ lệ pha loãng, pH và nồng độ thẩm thấu) lên hoạt lực tinh trùng cá hồng bạc mà nhờ đó sẽ góp phần cải thiện các điều kiện trong bảo quản ngắn hạn và dài hạn của tinh trùng loài cá này trong tương lai. II. ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Thu mẫu Cá hồng bạc Lutjanus argentimaculatus (Forskal, 1775) đực thu thập từ tự nhiên, được nuôi vỗ một thời gian trong các lồng nuôi tại Vũng Ngán - Nha Trang - Khánh Hòa. Cá này được cho ăn bằng cá tạp (khẩu phần ăn: 5% khối lượng cơ thể) kết hợp bổ sung vitamin và các khoáng chất đồng thời được chăm sóc tốt để cá thành thục tốt nhất. Các kiểm tra được thực hiện sau đó 2 - 3 tuần, khi cá đạt chất lượng tinh tốt, cá được vuốt tinh để tiến hành các thí nghiệm. Tinh dịch được thu lúc sáng sớm, vào các ống enpendoff, loại có thể tích 1,5 ml. Quá trình thu được đảm bảo sao cho nước, phân hay nước tiểu không bị lẫn vào tinh dịch. Các ống chứa tinh được đậy chặt nắp và bảo quản lạnh trong thùng xốp đựng đá bào ngay sau khi tinh được thu và trong quá trình vận chuyển về Phòng thí nghiệm Viện Nuôi trồng thủy sản - Trường Đại học Nha Trang trước khi các đánh giá tiếp theo được tiến hành. 2. Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của tỷ lệ pha loãng lên hoạt lực của tinh trùng Ở thí nghiệm này, nước biển nhân tạo được sử dụng để pha loãng tinh trùng với thành phần tạo bao gồm: 27g NaCl; 0,5g KCl; 1,2 g CaCl2; 4,6g MgCl2 và 0,5 g NaHCO3 trong 1 lít nước cất. Các nghiệm thức khác nhau có các tỷ lệ pha loãng như sau: 1:50; 1:100; 1:200 (tinh dịch : nước biển nhân tạo). Ở mỗi nghiệm thức, sau khi pha loãng, hoạt lực tinh trùng sẽ được đánh giá thông qua quan sát dưới kính hiển vi với độ phóng đại 400 lần. Hoạt lực của tinh trùng bao gồm các thông số: phần trăm tinh trùng hoạt lực, và tổng thời gian hoạt động. Phần trăm hoạt lực được xác định bằng số tinh trùng hoạt lực so với tổng số tinh trùng quan sát được (ước tính bằng mắt thường). Thời gian hoạt lực được tính từ lúc pha loãng cho đến 100% tinh trùng bất hoạt (đơn vị tính: giây). Tỉ lệ pha loãng nào mà ở đó hoạt lực tinh trùng tốt nhất sẽ được dùng trong các thí nghiệm đánh giá tiếp theo. 3. Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của pH lên hoạt lực của tinh trùng Thí nghiệm này gồm bốn nghiệm thức khác nhau về giá trị pH trong môi trường pha loãng tinh dịch lần lượt là 6,0; 7,0; 8,0; 9,0. Sau khi tinh dịch được pha loãng, hoạt lực của tinh trùng được đánh giá và từ đó pH tối ưu cho môi trường pha loãng tinh dịch được xác định. 4. Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của nồng độ thẩm thấu lên hoạt lực của tinh trùng Để xác định ảnh hưởng của nồng độ thẩm thấu lên hoạt lực tinh trùng, thí nghiệm đã sử dụng dung dịch NaCl ở các mức nồng độ thẩm thấu: 200, 300, 400 và 500 mOsm/kg để pha loãng tinh trùng (với tỉ lệ pha loãng và nồng độ pH của môi trường tối ưu được xác định từ các thí nghiệm trước. Nồng độ tối ưu được xác định là nồng độ mà ở đó hoạt lực tinh trùng cho biểu hiện tốt nhất. Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 3/2015 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 29 5. Xử lý số liệu Số liệu được trình bày dưới dạng giá trị trung bình ± sai số chuẩn. Số liệu được xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel. Ảnh hưởng của tỷ lệ pha loãng, pH và áp suất thẩm thấu được phân tích phương sai một yếu tố (One-way ANOVA) bằng kiểm định Ducan với mức ý nghĩa P<0,05 thông qua phần mềm SPSS 16.0. III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 1. Ảnh hưởng của tỷ lệ pha loãng lên hoạt lực của tinh trùng Pha loãng cho phép tất cả các tinh trùng được kích hoạt cùng một lúc và tránh sai sót trong trường hợp quan sát với mật độ tinh trùng cao. Điều này đặc biệt quan trọng trong các loài có mật độ tinh trùng cao và tinh trùng chuyển động nhanh chóng [13, 17]. Ảnh hưởng của tỷ lệ pha loãng lên hoạt lực của tinh trùng cá hồng bạc được thể hiện qua hình 1. Hình 1. Ảnh hưởng của tỷ lệ pha loãng lên hoạt lực của tinh trùng cá hồng bạc Các chữ cái a, b, c khác nhau thể hiện sự sai khác có ý nghĩa thống kê của thời gian và hoạt lực tinh trùng cá hồng bạc (P<0,05) Kết quả quan sát cho thấy có sự sai khác giữa các tỷ lệ pha loãng 1:100 với các tỷ lệ 1:200 và 1:50. Tỷ lệ pha loãng 1:100 có thời gian hoạt lực của tinh trùng cao nhất (328,67±14,85 s), tiếp đó là tỷ lệ 1:50 (235,33±7,42 s), thấp nhất là ở tỷ lệ 1:200 (176±25,38 s). Phần trăm tinh trùng hoạt động cũng có sự sai khác giữa các tỷ lệ pha loãng. Ở các mốc thời gian quan sát, phần trăm hoạt lực cao nhất là ở tỷ lệ 1:100. Đến 180s, phần trăm tinh trùng hoạt lực ở tỷ lệ 1:100 là 28,33±4,4%, ở 1:50 là 16±3%, ở 1:200 tinh trùng hoạt lực rất thấp (khoảng 2%). Kết quả của thí nghiệm này cho thấy, tỷ lệ pha loãng 1:100 là tỷ lệ pha loãng tối ưu cho tinh trùng hoạt lực. Tỷ lệ này cũng là tỷ lệ pha loãng tốt nhất đối với hoạt lực tinh trùng cá đù vàng [15], cá chẽm mõm nhọn Psammoperca waigiensis [3], cá mú cọp Epinephelus fuscoguttatus [2]. Trong khi đó, đối với tinh trùng cá rô châu Âu Perca fluviatilis [9] và cá dìa Siganus guttatus [1], hoạt lực tốt nhất quan sát được khi pha loãng ở tỷ lệ 1:50. 2. Ảnh hưởng của pH lên hoạt lực của tinh trùng Hình 2. Ảnh hưởng của pH lên hoạt lực của tinh trùng cá hồng bạc Các chữ cái a, b, c khác nhau thể hiện sự sai khác có ý nghĩa thống kê của thời gian và hoạt lực tinh trùng cá hồng bạc (P<0,05) Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 3/2015 30 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG Kết quả cho thấy có sự sai khác giữa các giá trị pH khác nhau, tinh trùng hoạt lực tốt nhất ở pH= 8 với tổng thời gian hoạt lực là 310,67±12,41s. Khi quan sát ở 10s, phần trăm hoạt lực không có sự sai khác giữ các giá trị pH= 6; pH= 7; pH= 8; pH= 9. Ở các mốc thời gian tiếp theo, có sự sai khác giữa phần trăm hoạt lực ở pH= 8 so với các giá trị còn lại. Đến 180s, ở pH= 8 tinh trùng hoạt lực 25±4,4%, trong khi đó ở pH=6 và pH= 9 tinh trùng hầu như không hoạt lực. pH ngoại bào và nội bào, cũng như thành phần ion của dung dịch kích hoạt ảnh hưởng đến việc bắt đầu và thời gian vận động của tinh trùng [8]. Đối với một số loài cá biển, sự gia tăng pH trong tế bào đã được ghi nhận lại trong quá trình kích hoạt khả năng vận động tinh trùng [8] và hơn thế nữa, pH ngoại bào có thể có ảnh hưởng lên chiều hướng và sự thay đổi pH nội bào, một biểu hiện thích nghi với điều kiện pH trong môi trường sinh thái của loài. Điều này giải thích cho các kết quả quan sát được ở thí nghiệm này và các kết quả ở một số loài khác như cá đù vàng Larimichthys polyactis [15], cá chẽm mõm nhọn Psammoperca waigiensis [3] và cá dìa Siganus guttatus [1] (pH=8); cá mú cọp Epinephelus fuscoguttatus (pH = 7) [2]. Đặc biệt, ở cá chẽm Dicentrarchus labrax [11], tinh trùng có thể hoạt động trong dung dịch có môi trường đệm từ pH=5 đến pH=10 và chúng hoạt động tốt nhất xung quanh giá trị pH=9 và tương tự đối với cá bơn (Hippoglossus hippoglossus) [14]. 3. Ảnh hưởng của nồng độ thẩm thấu lên hoạt lực của tinh trùng Nồng độ thẩm thấu có vai trò quan trọng trong việc kích hoạt, duy trì khả năng hoạt động của tinh trùng trong khi vào môi trường nước và hơn nữa là nâng cao khả năng thụ tinh của tinh trùng [3]. Đối với các loài cá nước ngọt, sự kích hoạt xảy ra khi tinh trùng tiếp xúc với môi trường nhược trương và ở các loài cá biển là môi trường ưu trương [11]. Ảnh hưởng của nồng độ thẩm thấu lên hoạt lực tinh trùng cá hồng bạc được thể hiện ở hình 3. Hình 3. Ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu lên hoạt lực của tinh trùng cá hồng bạc Các chữ cái a, b, c khác nhau thể hiện sự sai khác có ý nghĩa thống kê của thời gian và hoạt lực tinh trùng cá hồng bạc (P<0,05) Thông qua hình 3 ta thấy giá trị ở 500 mOsm/kg sai khác có ý nghĩa so với các giá trị nồng độ thẩm thấu còn lại. Tinh trùng hoạt lực lâu nhất ở nồng độ thẩm thấu 500 mOsm/kg (443,33±5,23s) và ở 200 mOsm/kg tinh trùng cá hồng bạc không hoạt động. Ở nồng độ 300 mOsm/kg tinh trùng phải mất 51,67s để cân bằng áp suất thẩm thấu trước khi hoạt động, trong khi đó ở các giá trị 400 mOsm/kg hay 500 mOsm/kg tinh trùng hoạt lực ngay, không có thời gian trì hoãn. Phần trăm hoạt lực đạt tốt nhất tại 500 mOsm/kg (100% ở 60s). Đến khoảng 300s, tinh trùng ở các giá trị 300 mOsm/kg và 400 mOsm/kg không còn hoạt lực, trong khi đó đến 420s tinh trùng ở 500 mOsm/kg vẫn còn hoạt lực. Do đó, ở dung dịch có nồng độ thẩm thấu 500 mOsm/kg tinh trùng cá hồng bạc có hoạt lực tốt nhất. Ở hầu hết các loài cá, hoạt lực tinh trùng phụ thuộc vào độ thẩm thấu của môi trường bên ngoài do sự thay đổi nồng độ ion nội bào tăng lên hoặc giảm đi [12]. Nghiên cứu trên cá mú cọp Epinephelus fuscoguttatus cho thấy 500 mOsm/kg cũng là nồng độ thẩm thấu tối ưu đối với hoạt lực tinh trùng [2]. Trong khi đó, đối với tinh trùng cá chẽm mõm nhọn thì nồng độ thẩm thấu tốt nhất là 400 mOsm/kg [3], cá dìa là 300 mOsm/kg [1]. Nồng độ thẩm thấu thích hợp cho tinh trùng cá Hippoglossus hippoglossus dao động trong khoảng 400-1000 mOsm/kg [14]. IV. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1. Kết luận Tỉ lệ pha loãng tối ưu cho hoạt lực của tinh trùng là 1:100 (tinh dịch:nước biển nhân tạo) với thời gian hoạt lực là 328,67±14,85 s và phần trăm tinh trùng hoạt lực là 86,67±3,33%. Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 3/2015 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 31 Tinh trùng cá hồng bạc hoạt lực tối ưu ở môi trường có pH= 8 với thời gian hoạt lực là 310,67±12,41s và 87,33±2,33% tinh trùng hoạt lực. Nồng độ thẩm thấu tối ưu nhất cho hoạt lực tinh trùng cá hồng bạc là 500 mOsm/kg với thời gian vận động và phần trăm hoạt lực lần lượt là 443,33 ± 5,23s và 100%. 2. Kiến nghị Để hoàn thiện các thông tin về các yếu tố ảnh hưởng lên hoạt lực của cá này, một số nghiên cứu tiếp theo cần được tiến hành, trong đó, các yếu tố khác như nồng độ ion, nhiệt độ cần được đánh giá và bên cạnh đó bước nhảy của các mức tỷ lệ pha loãng cần ngắn hơn. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt 1. Võ Thị Ngọc Giàu, Lê Minh Hoàng, Phan Văn Út và Phạm Quốc Hùng (2014), Ảnh hưởng của tỷ lệ pha loãng, pH và nồng độ thẩm thấu lên hoạt lực tinh trùng cá dìa (Siganus guttatus Bloch, 1787), Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản, Trường Đại học Nha Trang, 26-30. 2. Lê Minh Hoàng, Hoàng Thị Hiền, Phạm Phương Linh và Phạm Quốc Hùng (2014), Ảnh hưởng của tỷ lệ pha loãng, nhiệt độ, pH và áp suất thẩm thấu lên hoạt lực tinh trùng cá mú cọp (Epinephelus fuscoguttatus Forsskal, 1775), Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản, Trường Đại học Nha Trang, 19-23. 3. Nguyễn Thị Hồng Nhung (2012), Nghiên cứu đánh giá chất lượng tinh trùng và ảnh hưởng của một số yếu tố lên hoạt lực tinh trùng cá chẽm mõm nhọn Psammoperca waigiensis (Cuvier &Valencienes, 1828), Luận văn Thạc sĩ, Trường Đại học Nha Trang. 4. Nguyễn Hữu Phụng, Nguyễn Văn Long và Trần Thị Hồng Hoa (2001), Nguồn lợi cá rạn san hô ở vịnh Nha Trang, Tạp chí Khoa học công nghệ biển. NXB Hà Nội. 2, 16-26. 5. Nguyễn Địch Thanh (2012), Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học sinh sản của cá hồng bạc Lutjanus argentimaculatus (Forsskal, 1775) và ảnh hưởng của thức ăn đến sinh trưởng, tỷ lệ sống ở giai đoạn cá bột, tại Nha Trang, Khánh Hòa, Luận văn Tiến sĩ, Trường Đại học Nha Trang. 6. Nguyễn Quang Thiều (2012), Tìm hiểu quy trình ương nuôi ấu trùng cá Hồng bạc (Lutjanus argentimaculatus, Forsskal, 1775) tại Lương Sơn - Nha Trang, Luận văn tốt nghiệp, Trường Đại học Nha Trang. Tiếng Anh 7. Alavi, S.M.H. and Cosson, J. (2005), Sperm motility in fishes. I. Effects of temperature and pH: a review, Cell Biology International. 29, pp. 101- 110. 8. Alavi, S.M.H., Cosson, J., Karami, M., Amiri, B.M. and Akhoundzadeh, M.A. (2004), Spermatozoa motility in the Persian sturgeon (Acipenser persicus): effects of pH, dilution rate, ions and osmolality, Reproduction. 128, pp. 819-828. 9. Alavi, S.M.H., Rodina, M., Policar, T., Kozak, P., Psenicka, M. and Linhart, O. (2007), Semen of Perca fluviatilis: sperm volume and density, seminal plasma indices and effects of dilution ratio, ions and osmolality on sperm motility, Theriogenology. 68, pp. 276-283. 10. Allen, G.R. (1985), FAO species catalogue. Vol. 6. Snappers of the world. An Annotated and Illustrated Catalogue of Lutjanid Species Known to Date. FAO Fish. Synop., (125) Vol.6: 208 p., Editor^Editors. 11. Cabrita, E., Robles, V. and Herráez, P. (2009), Methods in Reproductive Aquaculture Marine and Freshwater Species, CRC Press Taylor & Francis Group, pp. 93-149. 12. Cosson, J. (2004), The Ionic and Osmotic Factors Controlling Motility of Fish Spermatozoa, Aquaculture International. 12, pp. 69-85. 13. Cosson, J., Groison, L.A., Suquet, M., Fauvel, C., Dreanno, C. and Billard, R. (2008), Marine fish spermatozoa: racing ephemeral swimmers, Reproduction. 136, pp. 277-294. 14. Harald, B.T., Benfey, J.T., Martin-Robichaud, D.J. and Power, J. (2001), The relationship between sperm density, spermatocrit, sperm motility and fertilization success in Atlantic halibut, Hippoglossus hippoglossus, Aquaculture. 194, pp. 191-200. 15. Le, M.H., Lim, H.K., Min, B.H., Park, M.S., Son, M.H., Lee, J.U. and Chang, Y.J. (2011), Effects of varying dilutions, pH, temperature and cations on spermatozoa motility in fish Larimichthys polyactis, Environmental Biology. 32, pp. 271-276. 16. Tiersch, T. R. , Wayman, W. R. , Skapura, D. P. , Neidig, C. L. and Grier, H. J. (2004), Transport and cryopreservation of sperm of the common snook, Centropomus undecimalis (Bloch), Aquaculture Research. 35, pp. 278-288. 17. Yao, Z., Richardson, G.F. and Crim, L.W. (1999), A diluent for prolonged motility of ocean pout (Macrozoarces americanus) sperm, Aquaculture. 174, pp. 183-193.