Ảnh hưởng của tỷ lệ pha loãng, pH và nồng độ thẩm thấu lên hoạt lực tinh trùng cá dìa (Siganus guttatus Bloch, 1787)

Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 3/2014 26 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG ẢNH HƯỞNG CỦA TỶ LỆ PHA LOÃNG, pH VÀ NỒNG ĐỘ THẨM THẤU LÊN HOẠT LỰC TINH TRÙNG CÁ DÌA (Siganus guttatus Bloch, 1787) EFFECTS OF DILUTION RATIO, pH AND OSMOLALITY ON SPERM MOTILITY IN RABBIT FISH (Siganus guttatus Bloch, 1787) Võ Thị Ngọc Giàu1, Lê Minh Hoàng2, Phan Văn Út3, Phạm Quốc Hùng4 Ngày nhận bài: 25/2/2014; Ngày phản biện thông qua: 16/4/2014; Ngày duyệt đăng: 13/8/2014 TÓM TẮT Nghiên cứu này đã được tiến hành để tìm ra tỷ lệ pha loãng, pH và nồng độ thẩm thấu tối ưu cho hoạt lực tinh trùng cá dìa (Siganus guttatus Bloch, 1787). Tinh dịch của cá dìa được pha loãng với nước biển nhân tạo ở các tỷ lệ 1:50, 1:100, 1:150 và 1:200 để xác định tỷ lệ pha loãng tối ưu cho hoạt lực tinh trùng cá dìa. Tiếp theo, tỷ lệ pha loãng này được sử dụng quan sát ở pH (6, 7, 8, 9) và nồng độ thẩm thấu (200, 300, 400, 500 mOsm/kg) để xác định giá trị pH và nồng độ thẩm thấu tốt nhất cho hoạt lực tinh trùng. Mỗi quan sát được lặp lại 3 lần. Kết quả cho thấy, tinh trùng cá dìa hoạt lực tốt nhất ở tỷ lệ pha loãng 1:50, pH = 8 và nồng độ thẩm thấu 400 mOsm/kg trong nước biển nhân tạo. Từ khóa: cá dìa, tỷ lệ pha loãng, nồng độ thẩm thấu, hoạt lực tinh trùng, pH ABSTRACT The objectives of the present study were reviewed to assess the optimal dilution rate, pH and osmolality for sperm motility in rabbit fi sh (Siganus guttatus Bloch, 1787). Semen were diluted with artifi cial seawater at ratios of 1:50, 1:100, 1:150 and 1:200 to fi nd the best dilution ratio for sperm motility. And then, this bestdilution rate was used for observing on pH (6, 7, 8, 9) and osmolality (200, 300, 400, 500 mosmol.kg-1) to fi nd the best pH and osmolality for sperm motility. All observations were replicated three times. The results indicated that the best performance of sperm were shown in the dilution rate 1:50, pH = 8 and osmolality 400 mOsm.kg-1 artifi cial seawater. Keywords: rabbit fi sh, dilution rate, osmolality, sperm motility, pH 1 Võ Thị Ngọc Giàu, 2 TS. Lê Minh Hoàng, 3 ThS. Phan Văn Út, 4 TS. Phạm Quốc Hùng: Viện Nuôi trồng thủy sản – Trường Đại học Nha Trang THOÂNG BAÙO KHOA HOÏC I. ĐẶT VẤN ĐỀ Cá dìa là loài phân bố rộng, có giá trị thương phẩm cao, sản lượng khá lớn và được nuôi ở nhiều nước châu Á [1] (được tham khảo trong [16]). Một vài loài thuộc giống cá dìa được nuôi theo hình thức truyền thống ở Phi-lip-pin nhưng việc nuôi thương mại vẫn chưa được hình thành [12]. Ở Việt Nam, trong dự án IMOLA, Trung tâm Khuyến ngư tỉnh Thừa Thiên Huế đã thực hiện mô hình nuôi cá dìa, tôm sú và rong câu chỉ vàng [4]. Hiện nay người dân ở tỉnh Khánh Hòa thường nuôi thương phẩm cá dìa với nguồn giống thu từ tự nhiên là chủ yếu. Mặc dù cá dìa là một đối tượng nuôi ngày càng phổ biến và có giá trị kinh tế cao ở khu vực Đông Nam Á nhưng vấn đề sản xuất giống vẫn chưa được giải quyết tốt [13]. Chất lượng sản phẩm sinh dục của cá bố mẹ là cơ sở quan trọng trong việc nâng cao chất lượng thụ tinh [7]. Tinh trùng của hầu hết các loài cá biển không hoạt lực trong buồng sẹ và dịch tương [5]. Tinh trùng bắt đầu hoạt lực khi được phóng thích ra ngoài môi trường nước, tinh trùng gặp trứng tiến hành quá trình thụ tinh. Vì vậy, hoạt lực của tinh trùng là yếu tố quan trọng quyết định khả năng thụ tinh của tinh trùng [11]. Khi được phóng thích ra môi trường thụ tinh, hoạt lực của tinh trùng phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện môi trường như tỷ lệ pha loãng, áp suất thẩm thấu, pH, nhiệt độ, nồng độ các ion (Ca2+, Mg2+, Na+) [5,11]. Thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng đã có nhiều nghiên cứu về chất lượng tinh trùng như cá chẽm mõm nhọn Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 3/2014 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 27 Psammoperca waigiensis [3], cá mú cọp Epinephelus fuscoguttatus [2], cá bơn Hippoglossus hippoglossu [9]; các yếu tố môi trường ngoài ảnh hưởng tới hoạt lực tinh trùng của nhiều loài cá như cá hồi Salmo gairdneri [14], cá tầm Ba Tư Acipenser persicus [5],... Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu nào tiến hành trên cá dìa Siganus guttatus. Do đó, nghiên cứu này đã được thực hiện nhằm tìm ra tỉ lệ pha loãng, pH và nồng độ thẩm thấu tối ưu cho hoạt lực tinh trùng cá dìa nhằm nâng cao hiệu quả thụ tinh trong quá trình sản xuất nhân tạo, giảm sức ép lên nguồn lợi cá dìa tự nhiên đồng thời góp phần đa dạng đối tượng nghiên cứu hoạt lực tinh trùng cá. II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Chuẩn bị nguồn tinh dịch Cá dìa đực (Siganus guttatus Bloch, 1787) đã được thu thập từ tự nhiên, đưa về nuôi vỗ trong lồng tại Vũng Ngán - Nha Trang - Khánh Hòa một thời gian. Đàn cá này được định kỳ kiểm tra hàng tuần, khi cá đạt chất lượng tinh tốt thì được vuốt tinh để tiến hành các quan sát. Các quan sát này được thực hiện tại Phòng Thí nghiệm Sinh học nghề cá - Viện Nuôi trồng thủy sản, Trường Đại học Nha Trang. 2. Phương pháp thu mẫu tinh dịch Đầu tiên, chúng ta dùng khăn bông thấm sạch nước ở xung quanh lỗ sinh dục của cá đực. Tiếp theo, chúng ta vuốt dọc bên hông và bụng cá, khi tinh dịch cá chảy ra thì hút tinh dịch bằng ống xilanh. Tinh dịch trong ống xilanh được cho vào ống eppendorf 1,5 ml, đậy kĩ nắp ống rồi đưa vào thùng xốp đựng đá bào, vận chuyển ngay về phòng thí nghiệm để tiến hành các quan sát. Trong khi vuốt, lỗ sinh dục của cá phải được tránh không để nước, phân hay nước tiểu lẫn vào tinh dịch để thu được tinh có chất lượng tốt. 3. Ảnh hưởng của tỷ lệ pha loãng lên hoạt lực tinh trùng Để tiến hành quan sát này thì tinh dịch với nước biển nhân tạo ở các tỉ lệ pha loãng khác nhau. Thành phần nước biển nhân tạo bao gồm: 27g NaCl; 0,5g KCl; 1,2g CaCl2; 4,6g MgCl2; 0,5g NaHCO3 được pha trong 1 lít nước cất và pH = 7,8, nồng độ thẩm thấu 356 ± 0,5 mOsm/kg. Tinh dịch và nước biển nhân tạo được pha theo các tỉ lệ 1:50; 1:100; 1:150; 1:200 trong ống eppendorf. Sau đó, 1 µl tinh dịch của cá trong ống eppendorf pha loãng với nước biển nhân tạo được hút ra bằng micropipet. Tiếp theo, 1 µl tinh dịch đã pha loãng được hút đưa lên lam kính quan sát dưới kính hiển vi ở độ phóng đại 400 lần. Hoạt lực của tinh trùng bao gồm các thông số: phần trăm tinh trùng hoạt lực (PTHL) và thời gian hoạt lực (TGHL). PTHL được xác định bằng số tinh trùng hoạt lực so với tổng số tinh trùng quan sát. TGHL được tính từ lúc pha loãng cho đến 100% tinh trùng bất hoạt (đơn vị tính: giây). Sau khi xác định được tỉ lệ pha loãng tốt nhất thì tỷ lệ pha loãng đó được dùng để tiến hành các quan sát tiếp theo. 4. Ảnh hưởng của pH lên hoạt lực của tinh trùng Ảnh hưởng của pH được đánh giá bằng cách sử dụng nước biển nhân tạo ở các giá trị pH: 6, 7, 8, 9 với tỷ lệ pha loãng tối ưu có nồng độ thẩm thấu tương đương với nước biển nhân tạo. Hoạt lực tinh trùng cũng được kiểm tra tương tự như trình bày ở trên. 5. Ảnh hưởng của nồng độ thẩm thấu lên hoạt lực tinh trùng Để xác định ảnh hưởng của nồng độ thẩm thấu lên hoạt lực tinh trùng, dung dịch NaCl ở các mức nồng độ thẩm thấu: 200, 300, 400 và 500 mOsm/kg ở tỉ lệ pha loãng tối ưu có nồng độ pH tương đương như nước biển được sử dụng. Hoạt lực của tinh trùng ở quan sát này bao gồm các thông số: phần trăm tinh trùng hoạt lực, thời gian hoạt lực và thời gian trì hoãn (TGTH). TGTH là khoảng thời gian khi kích hoạt hoạt lực của tinh trùng, tinh trùng không hoạt lực ngay mà có thời gian làm quen với môi trường sau đó hoạt lực. Dung dịch ở các mức thẩm thấu trên được pha loãng với tỉ lệ tối ưu để quan sát ảnh hưởng của nồng độ thẩm thấu lên hoạt lực tinh trùng. Hoạt lực tinh trùng cũng được kiểm tra tương tự như trình bày ở trên. 6. Phương pháp xử lý số liệu Các số liệu thu thập được xử lý trên phần mềm SPSS 16 và Excel 2003. Để tìm ra tỷ lệ pha loãng, pH và nồng độ thẩm thấu tốt nhất cho hoạt lực của tinh trùng cá dìa, chúng tôi dùng phân tích phương sai một yếu tố (one - way ANOVA). Sự sai khác giữa các nghiệm thức được so sánh theo kiểm định Duncan, sai khác có ý nghĩa được xem xét khi (P < 0,05). Các giá trị được trình bày dưới dạng giá trị trung bình ± sai số chuẩn (Mean ± SE). Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 3/2014 28 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG Pha loãng tinh trùng là yếu tố kích hoạt tinh trùng hoạt động và duy trì khả năng thụ tinh của tinh trùng trong môi trường thụ tinh [5]. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của tỉ lệ pha loãng lên hoạt lực tinh trùng cá dìa ở hình 1A cho thấy, thời gian tinh trùng hoạt lực cao nhất ở tỉ lệ pha loãng 1:50 (161,3 ± 15,51 s) và thấp nhất ở tỷ lệ 1:200 (49,7 ± 3,18 s). Tinh trùng pha loãng với tỷ lệ 1:50 có sai khác về mặt ý nghĩa thống kê với các tỷ lệ pha loãng còn lại (P < 0,05). Theo hình 1B, phần trăm tinh trùng hoạt lực giảm dần theo thời gian ở các mốc quan sát. Ở 10 s đầu tiên, tinh trùng hoạt lực ở tất cả các tỷ lệ pha loãng 1:50, 1:100, 1:150; 1:200 nhưng phần trăm tinh trùng hoạt lực cao nhất (86,7 ± 8,82%) ở tỷ lệ pha loãng 1:50, thấp nhất ở tỷ lệ pha loãng 1:100 (66,7 ± 8,82%). Tuy nhiên, phần trăm tinh trùng hoạt lực giữa các tỷ lệ pha loãng ở thời điểm này không có sự sai khác về mặt thống kê (P > 0,5). 60 s tiếp theo, phần trăm tinh trùng hoạt lực cao nhất (86,7 ± 8,82%) vẫn ở tỷ lệ pha loãng 1:50 và đã có sự sai khác về mặt thống kê so với các tỉ lệ pha loãng còn lại (P < 0,5). Điều này đúng ở 120 s và 180 s tiếp theo, phần trăm tinh trùng hoạt lực chỉ còn ở tỷ lệ pha loãng 1:50 (3 ±3 ,3%), các tỷ lệ pha loãng 1:100, 1:150; 1:200, tinh trùng đã ngừng hoạt lực ở 180 s. Vậy tỷ lệ pha loãng tốt nhất cho tinh trùng cá dìa hoạt lực là 1:50 với TGHL trung bình là (161,3 ± 15,51 s) và PTHL đạt (86,7 ± 8,82%) ở 10 s. Kết quả này tương tự với tỷ lệ pha loãng ở cá tầm Ba Tư Acipenser persicus [4], cá Perca fl uviatilis [5] nhưng cũng khác so với một số loài như: cá chẽm mõm nhọn Psammoperca waigiensis [4], cá mú cọp Epinephelus fuscoguttatus [2] tỷ lệ pha loãng tốt nhất 1:200, cá đù vàng Larimichthys polyactis [11] tỉ lệ pha loãng tốt nhất là 1:100, cá Mugil cephalus [15] tỉ lệ pha loãng tốt nhất là 1:10. Tỉ lệ pha loãng 1:50 được sử dụng để kiểm tra sự ảnh hưởng của nồng độ thẩm thấu, pH lên hoạt lực tinh trùng cá dìa. 2. Ảnh hưởng của pH lên hoạt lực tinh trùng III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 1. Ảnh hưởng của tỷ lệ pha loãng (TLPL) lên hoạt lực tinh trùng Hình 1. Ảnh hưởng của TLPL lên hoạt lực tinh trùng cá dìa Các ký hiệu chữ cái a, b, c, chỉ sự sai khác về mặt thống kê (P < 0,05) cho (A) TGHL và (B) PTHL theo từng cụm thời gian (10s, 60s, 120s hoặc 180s) Nghiên cứu ảnh hưởng của pH đối với hoạt lực tinh trùng cá dìa được tiến hành ở các nồng độ pH (6, 7, 8, 9) với tỉ lệ pha loãng 1:50. Kết quả cho thấy, các giá trị pH khác nhau thì hoạt lực tinh trùng cá dìa có sự khác nhau. Tinh trùng cá dìa hoạt lực tốt nhất ở pH = 8 với thời gian hoạt lực là 158,3 ± 12,83 s. Hình 2. Ảnh hưởng của pH lên hoạt lực tinh trùng cá dìa Các ký hiệu chữ cái a, b, c, d chỉ sự sai khác về mặt thống kê (P < 0,05) cho (A) TGHL và (B) PTHL theo từng cụm thời gian (10s, 60s, 120s hoặc 180s) Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 3/2014 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 29 Không có sự khác nhau có ý nghĩa thống kê về thời gian hoạt lực của tinh trùng giữa các giá trị pH. Tuy nhiên, phần trăm hoạt lực ở các giá trị pH giảm dần theo thời gian. 10 s đầu tiên, phần trăm hoạt lực ở pH = 8 lớn hơn phần trăm hoạt lực pH = 6, pH = 7, pH = 9 và có sự sai khác có ý nghĩa thống kê với phần trăm hoạt lực pH = 6, pH = 7 nhưng không có sự sai khác pH = 9. 60 s tiếp theo, phần trăm hoạt lực ở pH = 8 cũng lớn hơn phần trăm hoạt lực pH = 6, pH = 7, pH = 9 nhưng đã có sai khác có ý nghĩa thống kê với phần trăm hoạt lực ở cả 3 giá trị pH = 6, pH = 7, pH = 9. Điều này đúng với 120 s và 180 s, sau 180 s thì phần trăm hoạt lực pH = 8 là 13,3 ± 4,41% còn ở các giá trị pH còn lại tinh trùng đã ngừng hoạt lực. Về mặt sinh thái, vùng sinh sống của cá dìa trưởng thành là ở ven biển [10]. pH của nước biển dao động trong khoảng 8,1 - 8,3. Theo kết quả quan sát thì pH = 8 của dung dịch pha loãng là phù hợp nhất để kích hoạt sự vận động của tinh trùng cá dìa. Kết quả này tương tự như nghiên cứu trên cá tầm Ba Tư Acipenser persicus [3] cá chẽm mõm nhọn Psammoperca waigiensis [4], cá đù vàng Larimichthys polyactis [11], cá hồi vân Salmo gairdneri [14] nhưng khác so với cá da trơn châu Á Clarias macrocephalus [8] thì tỷ lệ pha loãng tốt nhất khi pH = 7. 3. Ảnh hưởng của nồng độ thẩm thấu (NĐTT) lên hoạt lực tinh trùng Hình 3. Ảnh hưởng của NĐTT lên hoạt lực tinh trùng cá dìa Các ký hiệu chữ cái A,B,C,D chỉ sự sai khác về mặt thống kê (P < 0,05) cho (A) TGTH, a,b,c,d cho (B) PTHL theo từng cụm thời gian (10s, 60s, 120s hoặc 180s) và cho (A) TGHL Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ thẩm thấu lên hoạt lực tinh trùng cá dìa cho thấy, khi kích hoạt ở các mức nồng độ thẩm thấu 300, 400 và 500 mOsm/kg thì tinh trùng không hoạt lực ngay mà tinh trùng cần thời gian làm quen với môi trường (thể hiện ở thời gian trì hoãn). Ở mức nồng độ thẩm thấu 200 mOsm/kg tinh trùng không hoạt lực. Quan sát khi tinh trùng hoạt lực cho thấy, môi trường có nồng độ thẩm thấu 400 mOsm/kg cho kết quả hoạt lực cao nhất (201,7 ± 13,34 s) với thời gian trì hoãn (225 ± 9,2 s), thời gian hoạt lực và thời gian trì hoãn ở nồng độ thẩm thấu 300 mOsm/kg và 500 mOsm/kg lần lượt là (114,7 ± 17,75 s và 248,3 ± 18,03 s); (148 ± 19,14 s và 188 ± 30,02 s). Thời gian hoạt lực của tinh trùng có sự sai khác có ý nghĩa thống kê giữa nồng độ thẩm thấu 400 mOsm/kg với các nồng độ thẩm thấu còn lại (P < 0,05) nhưng giữa nồng độ thẩm thấu 300, 400 mOsm/kg thì không có sự sai khác về mặt thống kê trong thời gian hoạt lực tinh trùng (P > 0,05). Phần trăm tinh trùng hoạt lực đạt tốt nhất tại 400 mOsm/kg (51,7 ± 4,41%) ở 10 s và có sự sai khác với các nồng độ 200, 300, 500 mOsm/kg. Sau 180s, tinh trùng ở các giá trị 200 mOsm/kg, 300 mOsm/kg và 500 mOsm/kg không còn hoạt lực, trong khi đó 400 mOsm/kg tinh trùng vẫn còn hoạt lực 10,7 ± 5,02%. Qua đó, có thể khẳng định tinh trùng cá dìa hoạt lực tốt nhất ở dung dịch có nồng độ thẩm thấu 400 mOsm/kg, cao hơn cá hồi vân Salmo gairdneri [14], cá Perca fl uviatilis [5], giá trị NĐTT còn dao động lớn và rất cao như theo nghiên cứu của Harald và ctv (2001), NĐTT tốt nhất cho tinh trùng cá Hippoglossus hippoglossus từ 400 - 1000 mOsm/kg [9]. IV. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1. Kết luận Trong nghiên cứu này, tinh dịch cá dìa pha loãng với nước biển nhân tạo ở tỉ lệ 1:50 cho kết quả tốt nhất về PTHL (86,7 ± 8,82%) ở 10 s đầu tiên và TGHL(161,3 ± 15,51 s). Ở môi trường nước biển nhân tạo có pH = 8, tinh trùng hoạt lực và PTHL tối ưu trong nghiên cứu này lần lượt là 158,3 ± 12,83 s và 63,3 ± 8,82%. Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 3/2014 30 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG Tinh dịch cá dìa pha loãng trong dung dịch có nồng độ thẩm thấu 400 mOsm/kg với tỉ lệ 1:50 thì thời gian và PTHL tinh trùng tốt nhất của nghiên cứu này lần lượt là 201,7 ± 13,34 s và 51,7 ± 4,41% ở 10s. 2. Kiến nghị Ngoài tỷ lệ pha loãng, nồng độ thẩm thấu, pH thì nhiệt độ, nồng độ các ion (Ca2+, Mg2+, K+, Na+) cũng ảnh hưởng lên hoạt lực của tinh trùng trong môi trường thụ tinh. Do đó, nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ các ion lên hoạt lực tinh trùng cá dìa cần được nghiên cứu thêm nhằm góp phần tạo điều kiện môi trường tối ưu trong quá trình sản xuất thành công giống cá dìa. Ngoài ra, nghiên cứu đặc tính lý hóa học của tinh dịch cá dìa cũng cần thiết góp phần vào quá trình bảo quản tinh trùng loài cá này trong tương lai. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt 1. Lê Văn Dân, Lê Văn Ngoan, 2006. Nghiên cứu sự phát triển tuyến sinh dục cá dìa (Siganus guttatus Bloch, 1787) ở vùng đầm phá Thừa Thiên Huế. Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, 2: 61-64. 2. Hoàng Thị Hiền, 2012. Nghiên cứu một số đặc tính lý, hóa học của tinh trùng cá mú cọp (Epinephelus fuscoguttatus Forsskal, 1775). Luận văn Thạc sĩ. Trường Đại học Nha Trang. 3. Nguyễn Thị Hồng Nhung, 2012. Nghiên cứu đánh giá chất lượng tinh trùng và ảnh hưởng của một số yếu tố lên hoạt lực tinh trùng cá chẽm mõm nhọn (Psammoperca waigiensis Cuvier &Valencienes, 1828). Luận văn Thạc sĩ. Trường Đại học Nha Trang. 4. Trung tâm Khuyến ngư Thừa Thiên Huế, 2007. Báo cáo kết quả thực hiện mô hình nuôi cá dìa giống sinh sản nhân tạo (Siganus guttatus) kết hợp với rong câu chỉ vàng (Gracilaria verrucosa) và tôm sú (Penaeus monodon). Tiếng Anh 5. Alavi. S. M. H, Cosson. J, Karami. R, Amiri. B. M and Akhoundzadeh. M. A, 2004. Spermatozoa motility in the Persian sturgeon (Acipenser persicus): effects of pH, dilution rate, ions and osmolality. Reproduction 128: 819-828. 6. Alavi. S. M. H, M. Rodina. M, Policar. T, Kozak. P, Psenicka. M and Linhart. O, 2007. Semen of Perca fl uviatilis L: Sperm volume and density, seminal plasma indices and effects of dilution ratio, ions and osmolality on sperm motility. Theriogenology, 68: 267-283. 7. Cabrita. E, Robles. V and Herrasez. P, 2009. Methods in reproductive aquaculture marine and freshwater species. CRC Press Taylor & Francis Group. 8. Fermin. J. D, Miura. T, Adachi. S and Yamauchi. K, 1999. Seminal plasma composition, sperm motility and milt dilution in the Asian catfi sh Clarias macrocephalus. Aquaculture, 171: 323-338. 9. Harald. B. T, Tillmann. T, Benfey. J, Deborah. J, Robichaud. M and Power. J, 2001. The relationship between sperm density, spermatocrit, sperm motility and fertilization success in Atlantic halibut, Hippoglossus hippoglossus. Aquaculture, 194: 191-200. 10. Lam. T. J, 1974. Siganids: Their biolo gy and mariculture potential. Aquaculture: 325-354. 11. Le. M. H, Lim. H. K, Min. B. H, Lee. J. U and Chang. Y. J, 2011. Effects of varying dilutions, pH, temperature and cations on spermatozoa motility in fi sh Larimichthys poly actis. Journal of Environmental biology 32: 271-276. 12. Pillai. T. G, 1962. Fish farming methods in the Philippines, Indonesia and Hong Kong. FAO Fish: 51-52. 13. Rachmansyah, Usman, Lante. S and Ahmad. T, 2007. Rabbitfi sh Siganus guttatus breeding and larval rearin g trial. Aquaculture Asia Magazine, July - September 2007: 39-41. 14. Van der Horst. G, Dott. H. M and Foster. G. C, 1980. Studies on the motility and cryopreservation of rainbow trout (Salmo gairdneri) spermatozoa, South African Journal Zoology, 15: 275-279. 15. Yeganeh. S, Mojazi. A. B and Alavi. S. M. H, 2008. Motility of Mugil cephalus L. spermatozoa in coelomic fl uid, seminal fl uid and saline media. Journal of Applied Ichthyology 24: 517-518. 16. shbase.org. Access in December 2013.