Ảnh hưởng của loại dung môi chiết và siêu âm đến hoạt tính chống oxy hóa và hàm lượng protein của dịch chiết từ hải miên (Ircinia mutans)

Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 4/2015 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 11 THOÂNG BAÙO KHOA HOÏC ẢNH HƯỞNG CỦA LOẠI DUNG MÔI CHIẾT VÀ SIÊU ÂM ĐẾN HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA VÀ HÀM LƯỢNG PROTEIN CỦA DỊCH CHIẾT TỪ HẢI MIÊN (Ircinia mutans) EFFECTS OF EXTRACTION SOLVENT AND ULTRASOUND-ASSISTED EXTRACTION ON ANTIOXIDANT ACTIVITY AND PROTEIN CONTENT OF EXTRACTS FROM MARINE SPONGE (Ircinia mutans) Huỳnh Nguyễn Duy Bảo1, Nguyễn Khắc Bát2 Ngày nhận bài: 29/9/2015; Ngày phản biện thông qua: 09/12/2015; Ngày duyệt đăng: 15/12/2015 TÓM TẮT Nghiên cứu này đã đánh giá ảnh hưởng của bốn loại dung môi chiết (chloroform, methanol, ethanol và nước cất) và chiết xuất với sự hỗ trợ của siêu âm đến hoạt tính chống oxy hóa và hàm lượng protein của dịch chiết từ hải miên (Ircinia mutans). Dịch chiết hải miên bằng nước cất có hoạt tính chống oxy hóa cao hơn so với dịch chiết hải miên bằng methanol, ethanol và chloroform trong cùng điều kiện chiết. Nhìn chung, chiết xuất với sự hỗ trợ của siêu âm thu được dịch chiết có hoạt tính chống oxy hóa cao hơn chiết xuất không có sự hỗ trợ của siêu âm. Hàm lượng protein của các dịch chiết từ hải miên có tương quan cao với hoạt tính chống oxy hóa. Từ những kết quả trên chỉ ra rằng nước cất là dung môi thích hợp để chiết xuất hoạt chất sinh học chống oxy hóa từ hải miên Ircinia mutans và protein là hoạt chất sinh học chống oxy hóa chủ yếu có trong dịch chiết. Từ khóa: Hải miên, hoạt tính khử gốc tự do, tổng năng lực khử, hoạt chất sinh học ABSTRACT This study evaluated the effect of four extracting solvents (chloroform, methanol, ethanol and distilled water) and ultrasound-assisted extraction on the antioxidant activity and protein content of extracts from marine sponge (Ircinia mutans). The water extracts of the marine sponge showed higher antioxidant activity than methanol, ethanol and chloroform extracts under similar extraction conditions. Generally, the extracts obtained by ultrasound-assisted extraction from the marine sponge showed higher antioxidant activity than those obtained by extraction without applying ultrasound. The protein content of extracts from the marine sponge was highly correlated with the antioxidant activity. These results showed that distilled water is a suitable solvent for extracting antioxidants from the marine sponge and protein is a major antioxidant in the extracts. Keywords: Marine sponge, radical scavenging activity, total reducing power, bioactive compounds 1 TS. Huỳnh Nguyễn Duy Bảo: Khoa Công nghệ thực phẩm – Trường Đại học Nha Trang 2 TS. Nguyễn Khắc Bát: Viện Nghiên cứu Hải sản Hải Phòng I. ĐẶT VẤN ĐỀ Hải miên được xếp đầu danh sách đối với việc phát hiện các hợp chất có hoạt tính sinh học và khả năng ứng dụng trong dược phẩm do sự đa dạng về cấu trúc hóa học của các chất chuyển hóa có trong hải miên. Nhiều nghiên cứu trong những năm gần đây phát hiện ra những hợp chất có hoạt tính sinh học từ hải miên như chất chống oxy hóa, chất kháng viêm, kháng khuẩn, chống lao, chống ung thư, Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 4/2015 12 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG kháng nấm, chống sốt rét, kháng virus và kháng HIV (Mehbub và cộng sự, 2014). Trong số các nguồn hoạt chất sinh học chống oxy hóa từ tự nhiên, hải miên được xếp vào nhóm có chứa hoạt chất sinh học chống oxy hóa cao. Một số chất chuyển hóa trong hải miên như polypeptide, saponin, sterol, fl avonoid, glycoside và các hợp chất phenol là những chất có hoạt tính chống oxy hóa cao (Halliwell, 1994; Chairman và Singh, 2012). Ngoài ra, Sato và cộng sự (2006) cũng đã tìm thấy các hợp chất carotenoids, polyphenol, glutathione trong một số loài hải miên, đây cũng là những hợp chất có hoạt tính chống oxy hóa cao. Việt Nam có điều kiện rất thuận lợi cho các loài hải miên cùng với các sinh vật ký sinh trên chúng phát triển. Những nghiên cứu trước đây đã công bố có khoảng 201 loài hải miên được tìm thấy ở vùng biển Việt Nam (Thai Minh Quang, 2000). Trong đó, các loài hải miên Ircinia spp. đã được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu khai thác hoạt chất sinh học (Kumar và Pal, 2012). Nghiên cứu của Orhan và cộng sự (2012) cho thấy dịch chiết từ các loài hải miên Ircinia spinulosa, I. fasciculata, and I. variabilis có hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm, khử gốc tự do 2,2 diphenyl-1picrylhydrazine (DPPH) và ức chế acetylcholinesterase. Hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết từ hải miên Ircinia mutans đã được Nazemi và cộng sự (2014) công bố và các protein có hoạt tính kháng khuẩn đã được phân lập từ hải miên bởi Salehi và cộng sự (2014). Nhìn chung, những công bố về nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa của hải miên Ircinia mutans còn rất hạn chế. Để khai thác hiệu quả nguồn tài nguyên quý giá này, việc nghiên cứu tách chiết các hoạt chất sinh học từ hải miên Ircinia mutans ở vùng biển Việt Nam là rất cần thiết. Nghiên cứu này đã tiến hành xác định ảnh hưởng của loại dung môi chiết và chiết xuất với sự hỗ trợ của siêu âm đến hoạt tính chống oxy hóa và hàm lượng protein của dịch chiết từ hải miên Ircinia mutans nhằm tìm ra loại dung môi và phương pháp thích hợp cho chiết xuất hoạt chất chống oxy hóa từ hải miên đạt hiệu quả cao. II. ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Nguyên vật liệu và hóa chất 1.1. Nguyên vật liệu Hải miên Ircinia mutans sử dụng trong nghiên cứu này được lấy mẫu ở vùng biển Phú Quốc, tỉnh Kiên Giang vào tháng 7 năm 2014. Hình 1. Hải miên Ircinia mutans lấy mẫu ở vùng biển Phú Quốc Ngay sau khi lấy mẫu, hải miên được ướp lạnh và vận chuyển về phòng thí nghiệm Trường Đại học Nha Trang. Tại phòng thí nghiệm, hải miên được bảo quản đông ở nhiệt độ - 20oC để sử dụng cho nghiên cứu này. 1.2. Hóa chất 2,2 diphenyl-1picrylhydrazine (DPPH), Bovine serum albumin (BSA), Folin–Ciocalteu reagent được mua từ công ty Sigma-Aldrich, Hoa Kỳ. Các hóa chất còn lại là loại đạt tiêu chuẩn dùng cho phân tích hóa học, được mua từ Công ty Loba Chemie, Ấn Độ và Công ty Wako, Nhật Bản. 2. Phương pháp nghiên cứu Để xác định ảnh hưởng của loại dung môi chiết xuất đến hoạt tính sinh học chống oxy và hàm lượng protein của dịch chiết từ hải miên đã tiến hành thí nghiệm sử dụng 4 loại dung môi có độ phân cực khác nhau là nước cất, methanol, ethanol và cloroform. Chiết xuất được thực hiện theo 2 phương pháp là chiết xuất với sự hỗ trợ của siêu âm và chiết xuất không có sự hỗ trợ của siêu âm. Các cách tiến hành như sau: Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 4/2015 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 13 Chiết xuất với sự hỗ trợ của siêu âm: Lấy 100 g hải miên đông lạnh ở -20oC đem cắt nhỏ đến kích thước khoảng 1 – 2 mm rồi đồng hóa với 200 ml dung môi. Hỗn hợp đồng hóa được đưa đi chiết xuất lần 1 trong thời gian 10 phút ở nhiệt độ phòng với sự hỗ trợ của siêu âm. Sau đó, đưa đi ly tâm ở 4oC trong 20 phút với vận tốc 3000 vòng/phút. Sau khi ly tâm, tách lấy dịch và lọc qua giấy lọc Whatman số 1 thu được dịch lọc. Bã lọc được tiến hành chiết lại 2 lần nữa với tỷ lệ dung môi/nguyên liệu và cách chiết như lần 1. Dịch lọc thu được từ 3 lần chiết nhập chung lại rồi ly tâm ở 4oC trong 10 phút với vận tốc 15000 vòng/phút. Tách lấy dịch ly tâm và lọc qua giấy lọc Whatman số 1, bổ sung thêm dung môi vào dịch lọc cho đủ 600 ml dịch chiết. Chiết xuất không có sự hỗ trợ của siêu âm: Lấy 100 g hải miên đông lạnh ở -20oC đem cắt nhỏ đến kích thước khoảng 1 – 2 mm rồi đồng hóa với 200 ml dung môi. Hỗn hợp đồng hóa được đưa đi chiết xuất lần 1 trong thời gian 10 phút ở nhiệt độ phòng không có sự hỗ trợ của siêu âm. Sau đó, đưa đi ly tâm ở 4oC trong 20 phút với vận tốc 3000 vòng/phút. Sau khi ly tâm, tách lấy dịch và lọc qua giấy lọc Whatman số 1 thu được dịch lọc. Bã lọc được tiến hành chiết lại 2 lần nữa với tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu và cách chiết như lần 1. Dịch lọc thu được từ 3 lần chiết nhập chung lại rồi ly tâm ở 4oC trong 10 phút với vận tốc 15000 vòng/phút. Tách lấy dịch ly tâm và lọc qua giấy lọc Whatman số 1, bổ sung thêm dung môi vào dịch lọc cho đủ 600 ml dịch chiết. Dịch chiết hải miên thu được giữ ở 4oC dùng để phân tích hoạt tính chống oxy hóa và hàm lượng protein trong ngày. 3. Phương pháp phân tích Hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết từ hải miên được đánh giá dựa vào khả năng khử gốc tự do DPPH được phân tích theo phương pháp của Fu và cộng sự (2002) và dựa vào tổng năng lực khử được phân tích theo phương pháp của Oyaizu (1986). Hàm lượng protein trong dịch chiết từ hải miên được phân tích theo phương pháp Lowry và cộng sự (1951). 4. Phương pháp xử lý số liệu Số liệu trình bày trong bài báo này là giá trị trung bình của 3 lần thí nghiệm. Tính giá trị trung bình và vẽ đồ thị sử dụng phần mềm Microsoft Excel 2003. Sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê (p < 0,05) của các giá trị trung bình được phân tích trên phần mềm thống kê R phiên bản 2.13.1. III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 1. Ảnh hưởng của loại dung môi chiết xuất đến hoạt tính khử gốc tự do DPPH của dịch chiết từ hải miên Kết quả phân tích hoạt tính khử gốc tự do DPPH của dịch chiết hải miên chiết xuất bằng các dung môi khác nhau với sự hỗ trợ của siêu âm và không có sự hỗ trợ của siêu âm được thể hiện trên hình 2. Hình 2. Hoạt tính khử gốc tự do DPPH của dịch chiết từ hải miên bằng các dung môi khác nhau với sự hỗ trợ của siêu âm (a) và không có sự hỗ trợ của siêu âm (b) Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 4/2015 14 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG Cả hai trường hợp chiết xuất với sự hỗ trợ của siêu âm và không có sự hỗ trợ của siêu âm đều cho thấy dịch chiết hải miên bằng nước cất có hoạt tính khử gốc tự do DPPH cao nhất và dịch chiết hải miên bằng chloroform có hoạt tính khử gốc tự do DPPH rất thấp. Trong cùng điều kiện chiết, dịch chiết hải miên bằng methanol có hoạt tính khử gốc tự do DPPH cao hơn dịch chiết hải miên bằng ethanol và sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê (P < 0,05). Tuy nhiên, cả hai dịch chiết hải miên bằng methanol và ethanol đều có hoạt tính khử gốc tự do DPPH thấp hơn rất nhiều so với dịch chiết hải miên bằng nước cất. Điều này cho thấy các hợp chất có hoạt tính khử gốc tự do DPPH trong loài hải miên Ircinia mutans là những chất có độ phân cực cao nên hòa tan tốt trong nước cất, ít hòa tan trong các dung môi hữu cơ phân cực (methanol và ethanol) và hầu như không hòa tan trong dung môi chloroform. Nghiên cứu của Taheri và Jalalinezhad (2015) cho thấy, dịch chiết bằng nước cất và bằng methanol từ 1 gam hải miên Geodia perarmata có khả năng khử được gốc tự do DPPH với nồng độ tương ứng là 0,048 và 0,009 mM. Trong nghiên cứu này, dịch chiết bằng nước cất và bằng methanol từ 1 gam hải miên Ircinia mutans có khả năng khử được gốc tự do DPPH với nồng độ tương ứng là 15,8 và 0,74 mM. Với khả năng khử gốc tự do DPPH cao hơn 300 lần so với dịch chiết từ hải miên Geodia perarmata, đã cho thấy hải miên Ircinia mutans là loài tiềm năng cho chiết xuất các hoạt chất sinh học chống oxy hóa. 2. Ảnh hưởng của loại dung môi chiết xuất đến tổng năng lực khử của dịch chiết từ hải miên Kết quả phân tích tổng năng lực khử của dịch chiết hải miên chiết xuất bằng các dung môi khác nhau với sự hỗ trợ của siêu âm và không có sự hỗ trợ của siêu âm được thể hiện trên hình 3. Hình 3. Tổng năng lực khử của dịch chiết từ hải miên bằng các dung môi khác nhau với sự hỗ trợ của siêu âm (a) và không có sự hỗ trợ của siêu âm (b) Tương tự như kết quả phân tích hoạt tính khử gốc tự do DPPH, cả hai trường hợp chiết xuất với sự hỗ trợ của siêu âm và không có sự hỗ trợ của siêu âm đều cho thấy tổng năng lực khử của dịch chiết hải miên bằng nước cất cao nhất và của dịch chiết hải miên bằng chloroform thấp nhất (hình 3). Tổng năng lực khử của dịch chiết hải miên bằng methanol cao hơn gấp 2 lần (P < 0,05) so với dịch chiết hải miên bằng ethanol trong cùng điều kiện chiết. Điều này cho thấy các hợp chất có có tổng năng lực khử cao trong loài hải miên Ircinia mutans là những chất có độ phân cực cao nên hòa tan tốt trong nước cất, ít hòa tan trong các dung môi hữu cơ phân cực (methanol và ethanol) và hầu như không hòa tan trong dung môi chloroform. Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 4/2015 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 15 Dịch chiết bằng nước cất và bằng methanol từ 1 gam hải miên Geodia perarmata có tổng năng lực khử tương đương với 0,61 và 0,14 mg vitamin C (Taheri và Jalalinezhad, 2015). Trong nghiên cứu này, dịch chiết bằng nước cất và bằng methanol từ 1 gam hải miên Ircinia mutans có tổng năng lực khử tương đương với 10,8 và 2,4 mg vitamin C. Điều này góp phần khẳng định hải miên Ircinia mutans là loài tiềm năng cho chiết xuất các hoạt chất sinh học chống oxy hóa và nước cất là dung môi thích nhất cho chiết xuất các hoạt chất sinh học này. Từ những kết quả phân tích hoạt tính khử gốc tự do DPPH và tổng năng lực khử của dịch chiết hải miên bằng các dung môi khác nhau với sự hỗ trợ của siêu âm và không có sự hỗ trợ của siêu âm cho phép khẳng định các hoạt chất sinh học chống oxy hóa trong loài hải miên Ircinia mutans có độ phân cực cao nên nước cất là dung môi thích hợp nhất để chiết xuất các hợp chất này. 3. Ảnh hưởng của loại dung môi chiết xuất đến hàm lượng protein của dịch chiết từ hải miên Kết quả phân tích hàm lượng protein của dịch chiết hải miên chiết xuất bằng các dung môi khác nhau với sự hỗ trợ của siêu âm và không có sự hỗ trợ của siêu âm được thể hiện trên hình 4. Hình 4. Hàm lượng protein của dịch chiết từ hải miên bằng các dung môi khác nhau với sự hỗ trợ của siêu âm (a) và không có sự hỗ trợ của siêu âm (b) Từ kết quả ở hình 4 cho thấy hàm lượng protein của dịch chiết hải miên bằng nước cất với sự hỗ trợ của siêu âm và không có sự hỗ trợ của siêu âm tương ứng là 10,84 ± 0,42 và 8,24 ± 0,09 mg/ml, cao hơn gấp 3 lần so với hàm lượng protein của dịch chiết hải miên bằng methanol và ethanol trong cùng điều kiện chiết. Cả hai trường hợp chiết xuất với sự hỗ trợ của siêu âm và không có sự hỗ trợ của siêu âm đều cho thấy hàm lượng protein của dịch chiết hải miên bằng methanol và ethanol khác biệt không có ý nghĩa thống kê (P > 0,05). Dịch chiết hải miên bằng chloroform có hàm lượng protein rất thấp gần như bằng không. Điều này cho thấy hoạt chất sinh học chống oxy hóa trong dịch chiết từ hải miên Ircinia mutans chủ yếu là protein và có thể có nhiều loại protein có hoạt tính chống oxy hóa khác nhau. 4. Tương quan giữa hàm lượng protein với hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết từ hải miên Mối tương quan giữa hàm lượng protein với hoạt tính khử gốc tự do DPPH và tổng năng lực khử của dịch chiết từ hải miên Ircinia mutans được thể hiện trên hình 5. Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 4/2015 16 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG Kết quả phân tích tương quan ở hình 5 cho thấy hàm lượng protein của dịch chiết từ hải miên Ircinia mutans bằng các loại dung môi khác nhau có tương quan rất cao với hoạt tính khử gốc tự do DPPH (r = 0,97) và tổng năng lực khử (r = 0,92) của dịch chiết. Kết quả này cho thấy protein là một trong những hoạt chất sinh học chống oxy hóa chủ yếu trong hải miên Ircinia mutans. IV. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết từ hải miên Ircinia mutans chiết xuất bằng nước cất cao hơn chiết xuất bằng methanol, ethanol và cloroform. Phương pháp chiết xuất với sự hỗ trợ của siêu âm đã làm tăng hàm lượng protein của dịch chiết nên hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết tăng lên so với chiết xuất không có sự hỗ trợ của siêu âm. Protein trong hải miên Ircinia mutans có hoạt tính chống oxy hóa cao, cho thấy loài hải miên này là nguồn lợi thủy sản tiềm năng có thể khai thác để chiết xuất hoạt chất sinh học chống oxy hóa ứng dụng vào thực phẩm chức năng và dược phẩm. Hình 5. Tương quan giữa hàm lượng protein (PRO) với hoạt tính khử gốc tự do DPPH (DPPH) và tổng năng lực khử (TNLK) của dịch chiết từ hải miên TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Chairman, K., Singh, A. J. A. R., Alagumuthu, G. (2012). Cytotoxic and antioxidant activity of selected marine sponges. Asian Pacifi c Journal of Tropical Disease, 2(3): 234–238. 2. Fu. H., Shieh D., Ho C. (2002). Antioxidant and free radieal scavenging activities of edible mushrooms. Food lipids, 9: 35-46. 3. Halliwell, B. (1994). Free radicals, antioxidants, and human disease: curiosity, cause or consequence?. The Lancet, 344: 721-724. 4. Kumar, M. S., Pal, A. K. (2012). Investigation of bioactivity of extracts of Marine Sponge, Spongosorites halichondrioides (Dendy, 1905) from western coastal areas of India. Asian Pacifi c Journal of Tropical Biomedicine, S1784-S1789. Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 4/2015 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 17 5. Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. (1951). Protein measurement with the folin phenol reagent. The Journal of Biological Chemistry, 193: 265-275 6. Mehbub, M. F., Lei, J., Franco, C., Zhang, W. (2014). Marine sponge derived natural products between 2001 and 2010: Trends and opportunities for discovery of bioactives. Marine Drugs, 12(8): 4539-4577. 7. Nazemi, M., Motallebi, M. A. A., Jamili, S., Mashinchian, A., Ghavam, M. P. (2014). Comparison of antibacterial activities of Ircinia mutans extracts in two different seasons from Kish Island, Persian Gulf, Iran. Iranian Journal of Fisheries Sciences, 13(4): 823-833. 8. Orhan, I. E., Ozcelik, B., Konuklugil, B., Putz, A., Kaban, U. G., Proksch, P. (2012). Bioactivity screening of the selected turkish marine sponges and three compounds from Agelas oroides. Record of Natural Products, 6(4): 356 -367. 9. Oyaizu, M. (1986). Studis on products of browning reations: autioxidative activities of products of browning reaction prepared from glucosamine. Japanese Journal of Nutrition, 44: 307-315. 10. Salehi, A., Patong, R., Ahmad, A. (2014). Isolation And Characterization Of Some Kind Bioactive Proteins Sponge As Antibacterial Agent. International Journal of Scientifi c & Technology Research, 3(2): 233-236. 11. Sato, S., Kuramoto, M., Ono, N., Ircinamine, B. (2006). Bioactive alkaloid from marine sponge. Dactylia sp. Tetrahedron Letters, 47: 7871–7873. 12. Taheri, A., Jalalinezhad, S. (2015).Antioxidative and Cytotoxic Effect of Marine Sponge (Geodia perarmata) Extracts against Breast and Colorectal Cancer Cells. 2nd International Conference on Advances in Environment, Agriculture & Medical Sciences (ICAEAM-15), June 11-12, 2015, Antalya (Turkey). 13. Thai Minh Quang. (2013). A review of the diversity of sponges (porifera) in Vietnam. The 2nd international workshop on marine bioresources of Vietnam, Hanoi 5-6/6/2013, 109-115.